To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Müller celler er de vigtigste glialceller af nethinden. Deres endelige fødder danner grænserne for retina i det ydre og indre begrænsende membraner (ILM), og i forbindelse med astrocytter, pericytter og endotelceller de etablerer blod-retina-barrieren (BRB). BRB begrænser materialetransport mellem blodbanen og nethinden, mens ILM fungerer som en basalmembran, der definerer histologisk grænsen mellem nethinden og glaslegemet hulrum. Mærkning Müller celler er særlig relevant at undersøge den fysiske tilstand af de retinale barrierer, da disse celler er en integreret del af BRB og ILM. Både BRB og ILM hyppigt ændringer i retinal sygdom og er ansvarlige for sygdomssymptomer.
Der er flere veletablerede metoder til at undersøge integriteten af BRB, såsom Evans blue assay eller fluoresceinangiografi. Men disse metoder giver ikke oplysninger om omfanget af BRB permeabilitet to større molekyler, i nanometer. Desuden har de ikke give oplysninger om, hvor andre retinale barrierer, såsom ILM. At studere BRB permeabilitet sideløbende retinal ILM, vi brugte en AAV baseret metode, der giver oplysninger om permeabilitet BRB til større molekyler, mens angiver tilstanden af ILM og ekstracellulære matrix proteiner i sygdomstilstande. To AAV varianter er nyttige til en sådan undersøgelse: AAV5 og ShH10. AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreceptorer, men det kan ikke komme over til den ydre retina, når det indgives i glaslegemet når ILM er intakt (dvs. i vildtype-nethinder). ShH10 har en stærk tropisme mod gliaceller og vil selektivt mærke Müller glia i både raske og syge nethinder. ShH10 giver mere effektiv gen levering i nethinder hvor ILM er kompromitteret. Disse virale værktøjer kombineret med immunhistokemi og blod-DNA-analyse kaste lys på tilstanden af retinale barrierer i sygdom.
Müller celler er den største glial komponent af nethinden. Morfologisk, de spænder nethinden radialt og deres endfeet i kontakt med glaslegemet står ILM og hemmelige dele af sidstnævnte. ILM er en basalmembran sammensat af omkring ti forskellige ekstracellulære matrixproteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, collagen og flere heparin sulfat proteoglycaner). Under udvikling, dens tilstedeværelse er uundværlig for retinal histogenese, navigation af optiske axoner, og overlevelsen af ganglieceller 1-3. Men ILM er uvæsentlig i voksen nethinden og kan fjernes kirurgisk i visse patologier uden at forårsage beskadigelse af nethinden 4. I genterapi denne membran bliver en fysisk barriere for effektiv transduktion af nethinden hjælp AAV'er ved intravitreal injektion 5.
Gennem omfattende arborization af deres processer, Müller celler giver ernæringsmæssige og lovgivningsmæssige support både retinale neuroner og vaskulære celler. Müller celler er også involveret i reguleringen af retinal homeostase, i dannelsen og vedligeholdelsen af BRB 6. Tight junctions mellem retinale endotelceller, Müller celler, astrocytter og pericytter danne BRB. BRB forhindrer visse stoffer i at komme ind de retina.In mange sygdomme som diabetisk retinopati, retinal vene okklusion og luftvejssygdomme, hypoxi af nethinden forårsager lækage gennem BRB 7-9. Dette brud er forbundet med en stigning i vaskulær permeabilitet, der fører til vasogent ødem, nethindeløsning og retinal skade.
Müller celler er tæt forbundet med blodkar og basalmembranen, spiller en vigtig rolle i både BRB og ILM integritet. Derfor er særligt relevant for studiet af den fysiske tilstand af disse retinale barrierer mærkning Müller gliaceller.
Klassiskallierede er BRB permeabilitet målt ved anvendelse af Evans blue assay bestående af systemisk injektion af Evans blåt farvestof, som binder ikke-covalent til plasma-albumin. Denne analyse måler albumin lækage (protein af mellemliggende størrelse, ~ 66 kDa) fra blodkarrene i nethinden (se protokoller afsnit 5) 10. Alternativt kan vaskulær lækage visualiseres ved fluorescens retinal angiografi godtgør for lækage af fluorescein (lille molekyle, ~ 359 Da; se protokoller afsnit 6) 11. Ikke desto mindre er begge metoder tillader evaluering af BRB permeabilitet for små molekyler og proteiner, men de giver ikke oplysninger om ILM integritet.
Derfor, for at studere BRB permeabilitet, anvendte vi en AAV baseret metode, der giver oplysninger om BRB permeabilitet for større molekyler (f.eks AAV partikler, 25 nm diameter). Faktisk kan vores metode detektere tilstedeværelsen af AAV transgenet i blodet, hvilket tyder på, at ~ partikler 25 nm diameter villevære i stand til at infiltrere i blodbanen. Denne fremgangsmåde giver også oplysninger om strukturen af ILM og ekstracellulære matrixproteiner i patologiske tilstande. To AAV varianter er nyttige til en sådan undersøgelse: AAV5 og ShH10. Subretinalt injiceret AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreceptorer og retinale pigmentepitel 12, men det kan ikke komme over til den ydre retina, når det indgives i glaslegemet i vildtype-nethinder med intakt ILM 5,13. ShH10 er en AAV variant, der er blevet manipuleret til specifikt at målrette gliaceller end neuroner 14,15. ShH10 selektivt mærker Müller celler i både raske og syge nethinder med øget effektivitet i nethinder med kompromitterede barrierer 16. Disse virale værktøjer kombineret med immuhistochemistry og blod-DNA-analyse giver oplysninger om tilstanden af retinale barrierer og deres involvering i sygdom (figur 1).
BRB regulerer udvekslingen af molekyler mellem blod og retina. Dets fordeling er forbundet med forskellige sygdomme, såsom diabetisk retinopati eller aldersrelateret makulær degeneration (AMD). Vi har for nylig vist, at i en dystrofin knock-out mus, som viser permeable BRB bliver mere tolerant for genafgivelse medieret af adenoassocierede virale vektorer (AAV) nethinden. Men trods BRB permeabilitet AAV partikler injiceret intraokulært holde begrænset til okulær rum i denne model. Vores resultater viser, at ge…
The authors have nothing to disclose.
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
5 µm filter | Millipore | ||
Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |