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एक उपकरण के रूप में एडिनो-एसोसिएटेड वायरस का प्रयोग रोग में रेटिना बाधाओं का अध्ययन करने के लिए

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52451
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

Abstract

मुलर कोशिकाओं रेटिना के प्रिंसिपल glial कोशिकाओं रहे हैं। उनके अंत-पैर बाहर और भीतर सीमित झिल्ली (इल्म) में रेटिना की सीमा के फार्म, और astrocytes, pericytes और endothelial कोशिकाओं के साथ संयोजन के रूप में वे खून-रेटिना बाधा (BRB) की स्थापना। इल्म रेटिना और शीशे गुहा के बीच histologically सीमा को परिभाषित करता है कि एक तहखाने झिल्ली के रूप में कार्य करता है, जबकि BRB खून और रेटिना के बीच सामग्री परिवहन की सीमा। मुलर कोशिकाओं लेबल इन कोशिकाओं BRB और इल्म का एक अभिन्न हिस्सा हैं, के रूप में रेटिना बाधाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। BRB और ILM दोनों अक्सर रेटिना रोग में बदल दिया और रोग के लक्षणों के लिए जिम्मेदार होते हैं।

ऐसे इवांस नीले परख या fluorescein एंजियोग्राफी के रूप में BRB की अखंडता का अध्ययन करने के लिए कई अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं। हालांकि इन तरीकों BRB पारगम्यता टी की सीमा पर जानकारी प्रदान नहीं करतेनैनोमीटर रेंज में बड़े अणुओं, ओ। इसके अलावा, वे इस तरह के इल्म के रूप में अन्य रेटिना बाधाओं के राज्य के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। रेटिना इल्म के साथ BRB पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए, हम रोग राज्यों में इल्म और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के राज्य का संकेत है, जबकि बड़े अणुओं को BRB की पारगम्यता के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि एक एएवी आधारित पद्धति का इस्तेमाल किया। दो एएवी वेरिएंट इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं: AAV5 और ShH10। AAV5 फोटोरिसेप्टरों के लिए एक प्राकृतिक tropism है लेकिन इल्म बरकरार है जब (जंगली प्रकार retinas में यानी,) शीशे में दिलाई जब यह बाहरी रेटिना को भर में नहीं मिल सकता। ShH10 glial कोशिकाओं की दिशा में एक मजबूत tropism है और चुनिंदा स्वस्थ और रोगग्रस्त retinas के दोनों में मुलर glia लेबल होगा। ShH10 इल्म समझौता किया है जहां retinas में अधिक कुशल जीन डिलीवरी प्रदान करता है। Immunohistochemistry और खून-डीएनए विश्लेषण के साथ युग्मित ये वायरल उपकरण बीमारी में रेटिना बाधाओं के राज्य पर प्रकाश डाला।

Introduction

मुलर कोशिकाओं रेटिना के प्रमुख glial घटक हैं। आकृति विज्ञान, वे कांच के साथ संपर्क में त्रिज्यात रेटिना और उनके endfeet स्पैन इल्म और बाद के गुप्त घटकों का सामना। इल्म के बारे में दस अलग बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (laminin, agrin, perlecan, nidogen, मज्जा और कई हेपरिन सल्फेट proteoglycans) से बना एक तहखाने झिल्ली है। विकास के दौरान, अपनी उपस्थिति नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 1-3 की रेटिना ऊतकजनन, ऑप्टिक axons की नेविगेशन, और अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है। हालांकि, इल्म वयस्क रेटिना में नगण्य है और शल्य चिकित्सा रेटिना क्षति 4 कारण के बिना कुछ विकृतियों में हटाया जा सकता है। जीन थेरेपी में, इस झिल्ली intravitreal इंजेक्शन 5 से AAVs का उपयोग कर रेटिना के कुशल पारगमन के लिए एक शारीरिक बाधा बन जाता है।

उनकी प्रक्रियाओं के व्यापक द्रुमायण के माध्यम से, मुलर कोशिकाओं पोषण और नियामक suppo प्रदान करते हैंRT रेटिना न्यूरॉन्स और नाड़ी कोशिकाओं दोनों के लिए। मुलर कोशिकाओं को भी BRB 6 के गठन और रखरखाव में, रेटिना homeostasis के नियमन में शामिल कर रहे हैं। तंग जंक्शनों रेटिना केशिका endothelial कोशिकाओं के बीच, मुलर सेल, astrocytes और pericytes BRB के रूप में। BRB मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिना नस रोड़ा और सांस की बीमारियों की तरह retina.In कई बीमारियों में प्रवेश करने से कुछ पदार्थों को रोकता है, रेटिना के हाइपोक्सिया BRB 7-9 के माध्यम से रिसाव का कारण बनता है। इस संबंध विच्छेद vasogenic शोफ, रेटिना टुकड़ी और रेटिना को नुकसान के लिए अग्रणी संवहनी पारगम्यता में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है।

मुलर कोशिकाओं कसकर दोनों BRB और ILM अखंडता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, रक्त वाहिकाओं और तहखाने झिल्ली के साथ जुड़े रहे हैं। नतीजतन, मुलर glial कोशिकाओं लेबलिंग इन रेटिना बाधाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।

क्लासिकसहयोगी, BRB पारगम्यता प्लाज्मा एल्बुमिन को गैर covalently बांधता है जो इवांस नीले डाई, के प्रणालीगत इंजेक्शन से मिलकर इवांस नीले परख का उपयोग मापा जाता है। यह परख रेटिना में रक्त वाहिकाओं 10 (प्रोटोकॉल धारा 5 देखें) से एल्बुमिन रिसाव (मध्यवर्ती आकार के प्रोटीन, ~ 66 केडीए) के उपाय। वैकल्पिक रूप से, संवहनी रिसाव fluorescein के रिसाव के लिए attesting प्रतिदीप्ति रेटिना एंजियोग्राफी द्वारा देखे जा सकते हैं (छोटे अणु, ~ 359 दा; प्रोटोकॉल धारा 6 देखें) 11। फिर भी, दोनों तरीकों छोटे अणुओं और प्रोटीन के लिए BRB पारगम्यता के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, लेकिन वे इल्म अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं।

इसलिए, BRB पारगम्यता अध्ययन करने के लिए, हम बड़े अणुओं (जैसे, एएवी कणों, 25 एनएम व्यास) को BRB पारगम्यता के बारे में जानकारी देता है कि एक एएवी आधारित पद्धति का इस्तेमाल किया। दरअसल, हमारे विधि सुझाव है कि, जो रक्त में एएवी transgene की उपस्थिति का पता लगाने कर सकते हैं ~ 25 एनएम व्यास कणों होगाखून में घुसपैठ करने में सक्षम हो। इस विधि को भी रोग की स्थिति में इल्म और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है। दो एएवी वेरिएंट इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं: AAV5 और ShH10। Subretinally इंजेक्ट, AAV5 फोटोरिसेप्टरों और रेटिना वर्णक उपकला 12 के लिए एक प्राकृतिक tropism है, लेकिन बरकरार इल्म 5,13 के साथ जंगली प्रकार retinas में शीशे में दिलाई जब यह बाहरी रेटिना को भर में नहीं मिल सकता। ShH10 विशेष रूप से न्यूरॉन्स 14,15 से अधिक glial कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि एक एएवी संस्करण है। ShH10 चुनिंदा समझौता बाधाओं 16 के साथ retinas में वृद्धि की दक्षता के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त retinas के दोनों में मुलर कोशिकाओं लेबल। Immuhistochemistry और खून-डीएनए विश्लेषण के साथ युग्मित ये वायरल उपकरण रेटिना बाधाओं के राज्य और बीमारी में उनकी भागीदारी (चित्रा 1) के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी जानवरों नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO बयान के अनुसार के लिए परवाह है और संभाल रहे थे।

HEK-293 कोशिकाओं 17,18 के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा पुनः संयोजक एएवी (rAAV) के 1. उत्पादन

नोट: McClure सी, (2011) 19 जौव देखें।

  1. एएवी वेक्टर plasmids के एक बड़े पैमाने पर प्लाज्मिड तैयारी (कम से कम 1 मिलीग्राम / एमएल) के शुद्ध। 3 प्लास्मिड का प्रयोग करें। एएवी उल्टे टर्मिनल बिना प्रतिकृति और कैप्सिड जीन ले जाने एएवी सहायक प्लाज्मिड ITRS, एएवी आईटीआर स्थानांतरण प्लाज्मिड के रूप में भेजा ले जाने transgene अभिव्यक्ति कैसेट, और Adenovirus सहायक जीन E2, इ 4, और VA आरएनए जीन की आपूर्ति प्लाज्मिड भेजा दोहराता pHELPER के रूप में करने के लिए।
  2. इन तीन प्लास्मिड polyethyleneimine (या अन्य अभिकर्मक अभिकर्मक) का उपयोग कर के साथ 293 कोशिकाओं transfect। अभिकर्मक दक्षता से 80% अधिक अच्छा VI के लिए आवश्यक हैRAL पैदावार।
  3. एक iodixanol ढाल पर 293 सेल lysates से पुनः संयोजक एएवी शुद्ध। 15%, 25%, 40%, और 60% iodixanol ढाल प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। , एएवी कणों से युक्त 40% iodixanol अंश लीजिए 0.001% Pluronic साथ पीबीएस के खिलाफ एक घंटा और बफर एक्सचेंज (फॉस्फेट बफर खारा) के लिए 500,000 XG पर ultracentrifugation के बाद अंश ध्यान केंद्रित।
  4. वायरल जीनोमिक अनुमापांक 20 का निर्धारण करने के लिए, qPCR के बाद DNase ProteinaseK डाइजेस्ट प्रदर्शन करते हैं। आगे और रिवर्स प्राइमरों AAV2 आईटीआर में स्थित 62 बीपी क्षेत्र बढ़ाना। प्लाज्मिड मानक के लिए, जांच के परिवार के साथ लेबल और (BHQ) पेय एक ब्लैक होल है।
  5. आईटीआर प्राइमर, 100 एनएम आगे आईटीआर प्राइमर, 100 एनएम AAV2 आईटीआर जांच, 0.4 मिमी dNTPs, 2 मिमी और MgCl2, 1x प्लेटिनम Taq के बफर, 1U प्लेटिनम रिवर्स 340 एनएम का उपयोग 25 μl के अंतिम मात्रा में qPCR (मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) से बाहर ले जाने Taq और 5 μl टेम्पलेट (मानक, नमूना और कोई टेम्पलेट नियंत्रण)।
  6. के लिएमानक, धारावाहिक dilutions गुना 10 7 एक्स में अभिकर्मक के लिए प्लाज्मिड उपयोग (5 μl अक्टूबर 10 - अप्रैल 10 जीनोम / मिलीलीटर से एक अंतिम एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप 2 एक्स 10 9 3 10 एक्स 2 के लिए जीनोम / एमएल के प्रत्येक)।
  7. पर विकृतीकरण के 40 चक्रों के बाद 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम से कार्यक्रम शुरू 1 मिनट और annealing / विस्तार के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर। एक छोटी अवधि के भंडारण के लिए या लंबे समय तक भंडारण अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

एएवी 2. Intravitreal इंजेक्शन

  1. Ketamine (50 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ C57BL6J चूहों anesthetize और पलटा, एक उचित anesthetization का संकेत वापसी पलटा और पूंछ चुटकी प्रतिक्रिया को ठीक से नुकसान की पुष्टि करें। Neosynephrine 5% की कार्निया आवेदन द्वारा विद्यार्थियों को फैलाने और आई ड्रॉप 0.5% mydriaticum। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  2. एक ultrafine 30 ग्राम disposab दर्राLe भूमध्य रेखा के माध्यम से सुई और शीशे गुहा में, किनारी के बगल में (चिऊ कश्मीर, जौव (2007) 21 देखें)। शीशे गुहा के केंद्र में सुई का प्रत्यक्ष अवलोकन के साथ ShH10-GFP या AAV5-GFP की 1 से 10 एक्स 4 को 11 वीपी युक्त एक μl शेयर (चित्रा 1) इंजेक्षन। इल्म प्रयोगों के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक आंख का प्रयोग करें। BRB प्रयोगों के लिए दोनों आंखों इंजेक्षन। इंजेक्ट आंखों पर एक विरोधी भड़काऊ और जीवाणुरोधी सामयिक उपचार लागू करें।
  3. Neosynephrine के साथ विद्यार्थियों को फैलाने और mydriaticum आंख इमेजिंग के लिए चला जाता है। GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) अभिव्यक्ति एक सप्ताह, 2 सप्ताह, एक महीना, और intravitreal इंजेक्शन के बाद 2 महीने (चित्रा 1) का पालन करने के लिए एक आंख बुध्न कैमरा के साथ बुध्न परीक्षाओं प्रदर्शन करते हैं। सीओ 2 साँस लेना 1 से 2 महीने के बाद इंजेक्शन द्वारा चूहों बलिदान।

3. Immunohistochemistry

  1. रेटिना cryosections (चित्रा 1) के लिए, एल दूर करने के लिए enucleated आँखों काटना1 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में सत्ता और कॉर्निया, और विसर्जन तय।
    1. कमरे के तापमान पर एक घंटा, कमरे के तापमान पर एक और घंटा के लिए 20% sucrose के लिए 10% sucrose में पहले से तय की आंखों Cryoprotect। रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% sucrose के समाधान में Cryoprotect,। रुक और ऐसे क्रायो-मैट्रिक्स के रूप में राल embedding में eyecups एम्बेड। 10 माइक्रोन cryosections बनाओ और विशेष रूप से जमे हुए ऊतक वर्गों के लिए इलाज स्लाइड्स पर माउंट और कहा कि धुंधला दौरान ऊतक पालन में सुधार होगा।
    2. 5 मिनट के लिए पीबीएस 7.4 पीएच में 0.1% ट्राइटन X100 के साथ वर्गों permeabilize। पीबीएस में धो 2x और ब्लॉक 1% BSA के साथ पीबीएस में कमरे के तापमान पर एक घंटा, 0.1% के लिए बीच 20।
  2. रेटिना flatmounts (चित्रा 1) के लिए, विच्छेदन की सुविधा के लिए 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में enucleated आँखें ठीक।
    1. 15-30 मिनट में, कॉर्निया और लेंस को दूर करने के लिए आंखों के टुकड़े करना। Ora serrata आसपास के काटने से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) और श्वेतपटल से रेटिना अलग औरआँखों की नस। रेटिना और transduced रेटिना की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (निर्धारण 24 घंटा से अधिक नहीं होना चाहिए) को ठीक करने के लिए एक और 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में विसर्जित कर दिया। बाँझ पीबीएस, पीएच 7.4 में 5 मिनट धो लें।
    2. (1% बीएसए, 2% सामान्य बकरी या गधा सीरम के साथ पीबीएस, 0.5% ट्राइटन X-100) बफर अवरुद्ध करने के लिए पीबीएस बदलें, और कमरे के तापमान पर 4 घंटे या रात भर के 4 डिग्री सेल्सियस के लिए या तो अवरुद्ध बफर में सेते हैं।
  3. कमरे के तापमान पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर या तो चार घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतकों को सेते हैं। पीबीएस के साथ धो 3x।
    नोट: इस प्रकार के रूप में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी हैं: विरोधी laminin (/ 1000 1) लेबलिंग इल्म, विरोधी rhodopsin क्लोन 4D2 (1/500) लेबलिंग छड़, विरोधी glutamine के synthetase क्लोन जी एस -6 (1/1500) लेबलिंग मुलर कोशिकाओं , PNA Lectin (1/40) लेबलिंग शंकु।
  4. कमरे Tempe में एक घंटा (cryosections) या दो घंटा (flatmounts) के लिए बफर अवरुद्ध में एलेक्सा Fluor संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 500 कमजोर पड़ने: एक साथ ऊतकों को सेतेrature और प्रकाश से रक्षा की। पीबीएस के साथ धो 3x।
  5. रेटिना को राहत कटौती करें और यह फोटोरिसेप्टर या रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) की ओर या तो ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ एक गिलास स्लाइड पर flatmount। 4 डिग्री सेल्सियस पर coverslip और दुकान लागू होते हैं, जलीय mountingmedium जोड़ें।
  6. लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन पर confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं। उत्तेजना और उत्सर्जन crosstalk को कम करने के लिए, लाइन से छवियों को क्रमिक रूप से, लाइन मोल। Nyquist-शैनन नमूना प्रमेय के अनुसार कदम आकार को परिभाषित करें। अंतिम छवियों में oversaturated पिक्सल कि कम से कम जोखिम सेटिंग्स का उपयोग करें। जेड परियोजना समारोह के तहत अधिकतम तीव्रता का उपयोग करते हुए और अंत में 8 बिट आरजीबी रंग मोड कन्वर्ट करने के लिए एक ही विमान पर फिजी के साथ प्रक्रिया 12 बिट छवियों, परियोजना जेड वर्गों।

माउस रक्त के नमूनों की 4. पीसीआर विश्लेषण

  1. संवेदनाहृत C57BL6J चूहों के शिश्न नस में एक एएवी-GFP की 1 से 10 एक्स 4 को 11 कणों से युक्त 100 μl शेयर (isoflurane के 5% इंजेक्षनएक अल्ट्रा ठीक 6 मिमी सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर एक करीबी कक्ष में प्रेरण और सर्जरी के दौरान एक नाक शंकु के माध्यम से isoflurane की 2.5%) के लिए। यह जानवर एएवी कणों परिसंचारी के एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
  2. इंजेक्शन और 3 घंटा, 24 घंटा, 2 दिन, और तीन दिनों ShH10 intravitreal इंजेक्शन के बाद या intrapenile इंजेक्शन (चित्रा 1) के बाद से पहले माउस पूंछ से नमूना खून। के बारे में 10-20 μl हेपरिन ट्यूबों में एकत्र किया जाता है। प्रक्रिया के पूरा होने के बाद सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों बलिदान।
  3. अपनी पसंद की निकासी किट का उपयोग कर रक्त के नमूनों से जीनोमिक डीएनए निकालने।
  4. जीनोमिक डीएनए की पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए निम्नलिखित प्राइमर जोड़ी का उपयोग करें: GFP, 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3' भावना। निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम प्रदर्शन किया गया था: 95 डिग्री सेल्सियस दो मिनट (एक चक्र); 95 डिग्री सेल्सियस 45 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस से 45 सेकंड (30 चक्रों); 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट (एक चक्र);4 डिग्री सेल्सियस पकड़।

5. वैकल्पिक इवांस ब्लू विधि

नोट: इवांस नीले विधि 10 का उपयोग रेटिना में रक्त वाहिकाओं से एल्बुमिन रिसाव को मापने के द्वारा संवहनी पारगम्यता यों।

  1. एक 5 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से 5 एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में न्यूनतम, और छानने के लिए एक सामान्य नमकीन घोल (6 मिलीग्राम / एमएल), sonication के में विघटन से इवांस नीले डाई तैयार करें।
  2. , (कदम 4.1 देखें, isoflurane साँस लेना) C57BL6J चूहों anesthetize पलटा, वापसी पलटा और एक उचित anesthetization का संकेत पूंछ चुटकी प्रतिक्रिया को ठीक से नुकसान की जांच, और penile नस (चित्रा 1) के माध्यम से इवांस ब्लू (45 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन। चूहों के पंजे, थूथन, और कान, इवांस नीले इंजेक्शन के बाद डाई के तेज और वितरण की पुष्टि स्पष्ट रूप से नीला हो गया है की जाँच करें।
  3. Ketamine (50 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ डाई के इंजेक्शन के बाद C57BL6J चूहों 3 घंटा anesthetize और rightin के नुकसान को सत्यापितजी एक उचित anesthetization का संकेत पलटा। नमूना intracardially के बारे में 500 हेपरिन नलियों में रक्त की μl और एक साइट्रेट बफर के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से 2 मिनट के लिए चूहों छिड़कना (0.05 एम, पीएच 3.5, साइट्रिक एसिड की 7.8 ग्राम और आसुत जल का 1 एल में सोडियम साइट्रेट की 3.8 ग्राम भंग) वाहिकासंकीर्णन को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म। चूहे छिड़काव के माध्यम से बलिदान कर रहे हैं।
  4. ध्यान से छिड़काव, मालूम करना और बाद retinas के इकट्ठा करने के लिए एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत दोनों आंखों के टुकड़े करना (धारा 3.2 देखें)। एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण में सूखी retinas के रातोंरात, तौलना, और (100 XG) झटकों के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए formamide के 100 μl साथ retinas के incubating द्वारा इवांस नीले डाई निकाल सकते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 20,798.5 XG पर 30K ओमेगा फिल्टर ट्यूबों में अपकेंद्रित्र रेटिना के नमूने और अपकेंद्रित्र रक्त के नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,798.5 XG पर।
  5. Absorbance के उपाय करने के लिए दोनों supernatants का प्रयोग करें। Absorbance के अधिकतम के लिए घटाकर प्रत्येक नमूने के absorbance का निर्धारण करते हैं740 एनएम पर absorbance के न्यूनतम करने के लिए 620 एनएम पर नीले आर इवांस। Formamide में इवांस नीले रंग का एक मानक वक्र से प्लाज्मा और रेटिना में इवांस नीले एकाग्रता की गणना। प्रति घंटे शुष्क रेटिना (प्लाज्मा / जी रेटिना शुष्क WT / घंटा μl) के प्रति ग्राम इवांस नीले रंग की माइक्रोलीटर में BRB पारगम्यता व्यक्त करते हैं।

6. वैकल्पिक Fluorescein एंजियोग्राफी

नोट: चूहों में रेटिना रक्त वाहिकाओं से रिसाव सोडियम fluorescein की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा देखे जा सकते हैं।

  1. C57BL6J चूहों anesthetize (isoflurane साँस लेना, कदम 4.1 देखें) और आंख (neosynephrine और mydriaticum) drops के साथ विद्यार्थियों को चौड़ा करना। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  2. Fluorescein एंजियोग्राफी के लिए 0.1 मिलीलीटर बाँझ खारा में 10% सोडियम fluorescein की intraperitoneally 0.01-0.02 मिलीलीटर इंजेक्षन।
  3. एक आंख बुध्न कैमरे का उपयोग इंजेक्शन के बाद दोनों आंखों की छवियों को ले लीजिए। समर्थक के बाद कंपनी द्वारा दो साँस लेना चूहों बलिदानcedure।
    नोट: रेटिना वाहिकाओं एंजियोग्राफी पर दिखाई देने के लिए 20 सेकंड के लिए आवश्यक हैं। छवियाँ fluorescein इंजेक्शन के बाद 3-10 मिनट अधिकतम के बीच कब्जा कर लिया जाना है। रिसाव के धब्बे (यदि उपस्थित हो) 2.5 मिनट के बाद नमूदार हैं। बाद में समय अंक छवि गुणवत्ता की वजह से सोडियम fluorescein शीघ्र ही विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है के बाद प्राप्त कांच का, इस प्रकार केवल छवियों में diffusing के लिए खो दिया है।

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Representative Results

पशु मॉडल इल्म (- बी 2A चित्रा) की संरचना में perturbations से पता चलता है कि अगर हम ShH10 का उपयोग कर मुलर glial कोशिकाओं की रेटिना पारगमन वृद्धि की उम्मीद है। उदाहरण के लिए, हम Dp71 के अभाव में पता चला है कि, ShH10 लक्ष्य विशेष रूप से, लेकिन और अधिक कुशलता से मुलर जंगली प्रकार चूहों 16 (चित्रा -2 - एफ) की तुलना में इस माउस लाइन में इल्म की वृद्धि की पारगम्यता का संकेत intravitreal इंजेक्शन द्वारा glial कोशिकाओं,।

AAV5 भी इल्म पारगम्यता का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जंगली प्रकार चूहों में intravitreal इंजेक्शन द्वारा अप्रभावी AAV5, ऐसे Dp71 अशक्त चूहों के रूप में 16 या अन्य रेटिनल degenerations 22 (- एच चित्रा 2 जी) में समझौता रेटिना बाधाओं के साथ चूहों में फोटोरिसेप्टर के लिए जीन वितरण में दृढ़ता से प्रभावी हो जाता है। यह आगे इल्म विप्लव और संभावित पारगम्यता बढ़ाने की पुष्टिरेटिना न्यूरॉन्स के आसपास के अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स में ई।

हम intravitreally Dp71 अशक्त चूहों 16 (चित्रा 3) इंजेक्ट की एएवी का कोई निशान रक्त के नमूनों में पाया गया के बाद से Dp71 अशक्त चूहों के BRB टूटने एएवी कणों को चयनात्मक रहता है, कि पाया।

चित्र 1
चित्रा 1:। सामान्य प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एएवी उत्पादन के बाद, कणों शीशे में या anesthetized वयस्क चूहों को शिश्न नस में इंजेक्शन कर रहे हैं। माइक्रोन तृतीय कैमरा के साथ बुध्न छवियों GFP अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। GFP अभिव्यक्ति पैटर्न रेटिना cryosections पर विश्लेषण और immunohistochemistry और confocal छवियों retinas के लिए धन्यवाद flatmounted है। BRB के माध्यम से एएवी बीतने intravitreally या intrapenially इंजेक्शन चूहों से आने वाले रक्त के नमूनों पर पीसीआर विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया है, मैंएन GFP के अनुक्रम की उपस्थिति का पता लगाने के आदेश, एएवी का सूचक खून में उपस्थिति कण।

चित्र 2
चित्रा 2: एएवी पारगमन को इल्म पारगम्यता एक अखिल laminin एंटीबॉडी (ए, बी) के साथ लेबल flatmounted जंगली प्रकार और Dp71 अशक्त retinas की Confocal छवियों। (पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन)। GFP अभिव्यक्ति (सी, डी) दिखा बुध्न छवियों। ShH10-GFP के intravitreal इंजेक्शन (ई, एफ) के बाद retinas के एक महीने Flatmounted। ई दिखाने में एक तारक ने संकेत दिया क्षेत्र के तीन आयामी पुनर्गठन (ई *) लाल (विरोधी GFAP एंटीबॉडी) में मुलर glial हरे रंग में कोशिकाओं और astrocytes transduced। (: 500 माइक्रोन पैमाने पर पट्टी) AAV5-GFP (जी, एच) के intravitreal इंजेक्शन के बाद retinas के एक महीने Flatmounted। लाल (PNA लेक्टिन धुंधला) में हरे और शंकु बाहरी क्षेत्रों में transduced फोटोरिसेप्टर दिखा एच में एक तारांकित (एच *) ने संकेत दिया क्षेत्र के confocal छवि। बाएँ स्तंभ जंगली प्रकार माउस रेटिना से परिणामों से पता चलता है और मध्य स्तंभ Dp71 अशक्त माउस रेटिना से परिणामों से पता चलता है। स्कीमा (आई) कांच के माध्यम से Dp71 अशक्त रेटिना के रूप में समझौता बाधाओं, साथ रेटिना के एएवी पारगमन का प्रतिनिधित्व करता है। लघुरूप: सीवी, choroidal जहाजों; RPE, रेटिना वर्णक उपकला; PHR, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (छड़ और शंकु); मेकांग गंगा सहयोग, मुलर glial कोशिकाओं; एचसी, क्षैतिज कोशिकाओं; ई.पू., द्विध्रुवी कोशिकाओं; एसी, amacrine कोशिकाओं; एम, microglia; चुनाव आयोग, endothelial कोशिकाओं; पी, pericytes; जीसी, नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं; ए, astrocytes; इल्म, भीतर सीमित झिल्ली; वी, कांच का; एएवी, एडिनो से जुड़े वायरस। (Vacca एट अल।, Glia (2013) 16, # 3483740951391 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट)।

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चित्रा 3: एएवी कणों को BRB पारगम्यता माउस रक्त के नमूने से निकाले GFP transgene की पीसीआर प्रवर्धन।। चूहे या तो इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय पर intravitreally (IVT) एएवी-GFP के साथ intrapenially ShH10-GFP या (आईपी) के साथ इंजेक्शन। लेन 5-18, Dp71 अशक्त चूहों के लिए जंगली प्रकार चूहों और भी संख्या के लिए विषम संख्या; लेन दो, एएवी प्लाज्मिड, पीटीआर एस.बी.-smCBA-hGFP की एक एनजी; 3 लेन, पानी; 5-6, इंजेक्शन से पहले रक्त डीएनए गलियों; गलियों 7-8, 3 घंटा के बाद IVT; गलियों 9-10, 24 घंटा के बाद IVT; गलियों 11-12, 24 घंटा के बाद आईपी; गलियों 13-14, 48 घंटा के बाद IVT; गलियों 15-16, 48 घंटा के बाद आईपी; गलियों में 17-18, 72 घंटा के बाद IVT; 19-20, 72 घंटा के बाद आईपी गलियों। 1 गलियों और 4, Invitrogen पैमाने सीढ़ी (100 बीपी): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 बीपी। (Vacca एट अल।, Glia (2013) 16, # 3483740951391 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट)।

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Discussion

BRB खून और रेटिना के बीच अणुओं के आदान-प्रदान को नियंत्रित करता है। इसके टूटने ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी या उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) के रूप में विभिन्न रोगों के साथ जुड़ा हुआ है। हमने हाल ही में पारगम्य BRB प्रदर्शित करता है जो एक डिस्ट्रोफ़िन नाक आउट माउस, में रेटिना एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर (एएवी) द्वारा मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए और अधिक अनुमोदक हो जाता है कि पता चला है। हालांकि, BRB पारगम्यता एएवी कणों के बावजूद intraocularly इस मॉडल में नेत्र डिब्बे तक ही सीमित रहने के इंजेक्शन। हमारे परिणाम प्रणालीगत दुष्प्रभाव के अतिरिक्त जोखिम का प्रतिनिधित्व नहीं करता पारगम्य BRB प्रदर्शित करने वाले रोगों के लिए है कि जीन थेरेपी से संकेत मिलता है। इसके अलावा, वे इस तरह के इल्म के रूप में अन्य बाधाओं को वायरल कणों के लिए बेहतर उपयोग की अनुमति रेटिना की बीमारी के दौरान समझौता हो जाते हैं तथ्य यह है कि समर्थन करते हैं। हमारा निष्कर्ष एएवी एन्कोडिंग रिपोर्टर जीन रेटिना रोग के पशु मॉडल में BRB पारगम्यता और ILM अखंडता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है कि लगता है कि हमें आगे के लिए। खासकरlarly, विशेष रूप से मुलर glia लेबल जो एएवी संस्करण ShH10, रेटिना glia लेबल और बीमारी के जवाब में रेटिना की स्थिति पर रिपोर्ट करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ShH10 चुनिंदा स्वस्थ और रोगग्रस्त retinas के दोनों में मुलर glia लेबल होगा। हालांकि, ShH10 और अन्य AAVs दोनों के साथ छेड़छाड़ की बाधाओं के साथ retinas में अधिक कुशल जीन डिलीवरी प्रदान करेगा।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को लागू करने में कुछ महत्वपूर्ण कदम (1) सबसे सुरक्षित intravitreal इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए मैनुअल निपुणता विकसित करने, और (2) ठीक से पहले और विच्छेदन के बाद ऊतक फिक्सिंग कर रहे हैं। लेंस या रेटिना को छूने के बिना - रेटिना बाधाओं का अध्ययन करने में, intravitreal इंजेक्शन अच्छी तरह से करता है निष्पादित किया जाना चाहिए। लेंस को नुकसान पहुँचाए या रेटिना detaching BRB पारगम्यता 23,24 प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त लेंस क्षति बुध्न इमेजिंग में बाधा उत्पन्न करती। रेटिना मार्मिक इल्म टूटना और रेटिना संरचना को नुकसान पहुंचा सकते हैं। , अनुभव रेटिना को छू से बचने के लिएmenter रेटिना के सामने, कांच का गुहा के बीच में हैमिल्टन सिरिंज की नोक का पालन करना चाहिए। एक गैर विषैले डाई शीशे में तरल पदार्थ इंजेक्शन का अवलोकन करने में सहायता करने के लिए वायरल समाधान में (जैसे phenol लाल या fluorescein के रूप में) में शामिल किया जा सकता है। रेटिना को नुकसान आसानी से इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद बुध्न इमेजिंग के दौरान देखा जा सकता है। पर्याप्त अभिव्यक्ति के स्तर पर पहुंच जाने के बाद एक अन्य महत्वपूर्ण कदम ऊतक का निर्धारण होता है। स्पष्टीकरण के बाद, आंखों तुरंत लगानेवाला बफर में डूब जाना चाहिए और ऊतक permeabilization के पहले एक दूसरे निर्धारण GFP के रिसाव को रोकने के लिए आवश्यक है। यह लगानेवाला में पूरे आंख डुबो पहले कॉर्निया भट्ठा के लिए उपयोगी हो सकता है - इस लगानेवाला शीशे में तर करने के लिए एक मौका देना होगा। यह कदम समग्र ऊतक स्थिरता में वृद्धि कर सकते हैं।

अंत में, यह कुशलतापूर्वक रेटिना transduce करने के लिए पर्याप्त एएवी कणों इंजेक्षन करने के लिए और GFP पूर्व निरीक्षण करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैआँख बुध्न छवियों पर अभिव्यक्ति। एएवी कणों की अधिकतम राशि 10 10 कणों GFP अभिव्यक्ति हमेशा बुध्न इमेजिंग से नहीं मनाया जाता है नीचे, आंख के बारे में प्रति 10 10 -10 11 वी.जी. है।

इस तकनीक को सीधे इल्म या BRB नीचे वाहिका संरचना का निरीक्षण करने की संभावना नहीं देना होगा। हालांकि यह इवांस नीले परख और fluorescein एंजियोग्राफी का उपयोग करते हुए पहले संभव नहीं था कि एक तरह से रेटिना बाधाओं और रोग राज्यों में उनके संशोधन, जांच करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। विशिष्ट रेटिना पारगमन गुणों के साथ AAVs का प्रयोग, यह glial कोशिकाओं, उनके बाह्य मैट्रिक्स और इल्म के लिए सम्मान के साथ रेटिना के राज्य में बेहतर जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है। इस तकनीक के माहिर के बाद, एक चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता और BRB पर उनके प्रभाव और रेटिना पारगम्यता परीक्षण कर सकते हैं और इलाज के बाद मैं सामान्य परिस्थितियों बहाल करने के लिए रोग प्रगति और संभावना का एक बेहतर समझ की ओर जानारेटिना की बीमारी का ना माउस मॉडल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL6J mice strain JANVIER LABS mice
Ketamine 500 Virbac France anesthetic
Xylazine Rompun 2% Bayer Healthcare anesthetic
Neosynephrine 5% Faure Europhta dilatant
Mydriaticum 0.5% Thea dilatant
Sterdex Novartis anti-inflammatory
Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific 10143352 slides
anti-laminin Sigma L9393 antibody
anti-rhodopsin clone 4D2 Millipore MABN15 antibody
anti-glutamine synthetase clone GS-6 Millipore MAB302 antibody
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Dako 334 antibody
PNA Lectin Invitrogen L32459 probe
Alexa fluor conjugated secondary antibodies Invitrogen antibody
Fluorsave reagent Calbiochem 345789 mounting medium
QIAmp DNA Micro Kit QIAGEN 56304
GoTaq DNA polymerase Promega M3001
Evans Blue dye Sigma E2129 dye
5 µm filter Millipore
Sodium citrate Sigma S1804
Citric acid Sigma C1909-2.5KG
Formamide spectrophotometric Sigma 295876-2L
Fluorescein Sigma F2456 dye
Micron III Phoenix Research Labs Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Insulin Syringes Terumo SS30M3109
Syringe 10 µl Hamilton Dutscher 74487 Seringue 1701
Needle RN G33, 25 mm, PST 2 Fisher Scientific 11530332 Intravitreal Injection
UltraMicroPump UMP3 World Precision Instruments UMP3 Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller UMP3-1 Digital controller
Binocular magnifier SZ76 ADVILAB ADV-76B2 Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection
Spring scissors straight - 8.5 cm Bionic France S.a.r.l 15003-08 Retinas dissection
curved Vanna scissor 15004-08
Pince Dumont 5 11254-20
Veriti 96-Well Thermal Cycler Life technologies 4375786 Thermocycler
Ultrasonic cleaner Laboratory Supplies G1125P1T
Nanosep 30k omega tubes VWR
Speedvac Fisher Scientific SC 110 A
Spectrofluorometer TECAN infinite M1000

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References

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चिकित्सा अंक 98 रक्त-रेटिना बैरियर (BRB) भीतरी झिल्ली (ILM) एडिनो से जुड़े सीमित वायरस (एएवी)
एक उपकरण के रूप में एडिनो-एसोसिएटेड वायरस का प्रयोग रोग में रेटिना बाधाओं का अध्ययन करने के लिए
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Vacca, O., El Mathari, B., Darche,… More

Vacca, O., El Mathari, B., Darche, M., Sahel, J. A., Rendon, A., Dalkara, D. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (98), e52451, doi:10.3791/52451 (2015).

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