Abstract
Müller-Zellen sind die Haupt gliale Zellen der Retina. Ende ihrer Füße bilden die Grenzen der Netzhaut auf der äußeren und inneren Begrenzungsmembranen (ILM) und in Verbindung mit Astrozyten Perizyten und Endothelzellen sie die Blut-Retina-Schranke (BRB) herzustellen. BRB begrenzt Materialtransport zwischen dem Blutstrom und der Netzhaut, während das ILM wirkt als Basalmembran histologisch die Grenze zwischen der Netzhaut und des Glas Hohlraum definiert. Beschriftung Müller-Zellen ist besonders relevant für den physikalischen Zustand der Netzhautbarrieren zu studieren, da diese Zellen sind ein integraler Bestandteil des BRB und ILM. Sowohl BRB und ILM werden häufig in Netzhauterkrankungen verändert und sind für die Krankheitssymptome verantwortlich.
Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren, um die Integrität des BRB studieren, wie die Evans Blau-Assay oder Angiographie. Allerdings sind diese Verfahren nicht auf das Ausmaß der BRB Lässigkeit t informiereno größere Moleküle, im Nanometerbereich. Außerdem liefern sie keine Informationen über den Zustand anderer retinaler Barrieren wie die ILM. Um BRB Permeabilität neben retinalen ILM zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basiertes Verfahren, das Informationen über Permeabilität BRB zu größeren Molekülen während sie den Zustand der ILM und extrazellulären Matrixproteinen in Krankheitszuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. AAV5 hat einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren, aber es kann, wenn es in den Glaskörper verabreicht wird, wenn das ILM intakt ist (dh, in Wildtyp-Retina) nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 hat eine starke Tropismus hin Gliazellen und selektive Markierung Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. ShH10 bietet effizientere Genübertragung in Netzhaut, wo ILM gefährdet ist. Diese viralen Tools gepaart mit Immunhistochemie und Blut-DNA-Analyse Aufschluss auf den Zustand der Netzhautbarrieren in Krankheit.
Introduction
Müller-Zellen sind die Haupt glial Komponente der Netzhaut. Morphologisch pannen sie die Netzhaut und ihre radial Endfüßen, in Kontakt mit dem Glaskörper vor der ILM und geheime Komponenten des letzteren. Die ILM ist eine Basalmembran von etwa zehn unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen (Laminin, Agrin, Perlecan, Nidogen, Kollagen und mehrere Heparinsulfatproteoglykanen) zusammen. Während der Entwicklung ist die Präsenz für die Netzhaut Histogenese, Navigations optischer Axone, und das Überleben von Ganglienzellen 1-3 unverzichtbar. Allerdings ist ILM unwesentlich bei erwachsenen Netzhaut und kann chirurgisch in bestimmten Krankheitsbildern entfernt werden, ohne dass Netzhautschäden 4. Bei der Gentherapie wird diese Membran eine physikalische Barriere für eine effiziente Transduktion der Retina mit AAVs durch intravitreale Injektion 5.
Durch die umfangreiche Verzweigung ihrer Prozesse, Müllerzellen bieten Ernährungs- und regulatorischen support, um sowohl retinale Neuronen und vaskulären Zellen. Müller-Zellen werden auch in die Regulation der retinalen Homöostase beteiligt sind, bei der Bildung und Aufrechterhaltung der BRB 6. Tight Junctions zwischen retinalen Endothelzellen, Müllerzellen, Astrozyten und Perizyten bilden die BRB. BRB verhindert bestimmte Substanzen aus der Eingabe der retina.In vielen Krankheiten wie diabetische Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und respiratorischen Erkrankungen, Hypoxie der Retina führt zu Leckagen durch die BRB 7-9. Dieser Bruch wird mit einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität, die zu vasogenes Ödem, Netzhautablösung und retinale Schädigung verbunden.
Müller-Zellen sind dicht mit Blutgefäßen und der Basalmembran zugeordnet und spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der BRB und ILM Integrität. Folglich Beschriftung Müller Gliazellen ist besonders relevant für die Untersuchung der physikalischen Zustand dieser Netzhautbarrieren.
KlassikerAlliierten wird BRB Lässigkeit unter Verwendung des Evans-Blau-Assays, die aus der systemischen Injektion von Evans-Blau-Farbstoff, der nicht-kovalent an Plasmaalbumin bindet gemessen. Dieser Test misst die Albuminverlusts (Protein mittlerer Größe, ~ 66 kDa) von Blutgefäßen in der Netzhaut (siehe Protokolle Abschnitt 5) 10. Alternativ kann die Gefäßdurchlässigkeit durch Fluoreszenz retinalen Angiographie Bescheinigung für Leckage von Fluorescein visualisiert werden (kleines Molekül, ~ 359 Da; siehe Protocols Abschnitt 6) 11. Dennoch sind beide Verfahren ermöglichen die Bewertung der BRB Lässigkeit für kleine Moleküle und Proteine, aber sie bieten keine Informationen über das ILM Integrität.
Daher, um BRB Lässigkeit zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basierte Methode, die Informationen über die BRB Permeabilität zu größeren Molekülen (zB AAV-Partikel, 25 nm Durchmesser) einbringt. In der Tat kann unsere Methode Vorhandensein von AAV Transgen im Blut zu erkennen, was vermuten lässt, dass ~ Partikel 25 nm Durchmesser würdein der Lage, in den Blutstrom einzudringen. Dieses Verfahren liefert auch Informationen über die Struktur des ILM und extrazellulären Matrixproteinen in pathologischen Zuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. Subretinal injiziert hat AAV5 einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren und retinale Pigmentepithel 12, aber es kann, wenn es in den Glaskörper in Wildtyp-Retina mit intakten ILM 5,13 verabreichten nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 ist ein AAV-Variante, die konstruiert wurde, um gezielt Gliazellen über Neuronen 14,15. ShH10 selektiv Etiketten Müller-Zellen sowohl in gesunden und erkrankten Netzhaut mit erhöhter Effizienz in der Netzhaut mit eingeschränkter Barrieren 16. Diese viralen Tools gepaart mit immuhistochemistry und Blut-DNA-Analysen geben Auskunft über den Zustand der Netzhaut-Barrieren und ihre Beteiligung an Krankheit (Bild 1).
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Protocol
Alle Tiere in dieser Studie verwendet wurden entsprechend der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research betreut und behandelt.
1. Herstellung der rekombinanten AAV (rAAV) durch transiente Transfektion von HEK-293-Zellen 17,18
HINWEIS: Siehe McClure C, JoVE (2011) 19.
- Reinigung einer großen Plasmidpräparation (mindestens 1 mg / ml) der AAV-Vektor-Plasmide. Verwenden Sie 3-Plasmiden. Die AAV-Helferplasmid trägt, die Replikation und Capsidgene ohne AAV invertierte terminale Wiederholungen ITRs, die Transgen-Expressionskassette trägt die AAV ITR bezeichnet als die Transfer-Plasmid, und das Plasmid Zuführen der Adenovirus-Helfergene E2, E4 und VA RNA-Gene genannten als pHELPER.
- Transfektion von 293-Zellen mit diesen Plasmiden 3 mit Polyethylenimin (oder andere Transfektionsreagenz). Über 80% der Transfektionseffizienz für gute vi erforderlichral Erträge.
- Reinige rekombinanten AAV von 293 Zelllysate auf eine Iodixanol Gradienten. 15%, 25%, 40% und 60% Iodixanol wird verwendet, um den Gradienten zu erhalten. Sammle 40% Iodixanol Fraktion AAV-Partikel enthält, konzentrieren die Fraktion nach Ultrazentrifugation bei 500.000 · g für 1 Stunde und Pufferwechsel gegen PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) mit 0,001% Pluronic.
- Um festzustellen, virale genomische Titer 20, führen Sie eine DNAse ProteinaseK Digest gefolgt von QPCR. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer verstärken die 62 bp-Region im AAV2 ITR entfernt. Für die Plasmid-Standard wird die Sonde mit FAM bezeichnet und hat ein schwarzes Loch Löscher (BHQ).
- Durchführung qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion) in einem Endvolumen von 25 ul mit 340 nM Rückwärtsprimer ITR, 100 nM Vorwärtsprimer ITR, 100 nM AAV2 ITR Sonde, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq-Puffer, 1HE Platinum Taq und 5 ul Template (Standard, Probe und Leerwert-Kontrolle).
- Fürder Standard, mit dem Plasmid für die Transfektion in 7 x 10-fachen seriellen Verdünnungen (5 & mgr; l jeweils von 2 · 10 & sup9 bis 2 × 10 3 Genome / ml, was zu einer Endkonzentration von Oktober 10.-Oktober 4. Genome / ml).
- Beginnt das Programm mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 1 min und Annealing / Extension bei 60 ° C für 1 min. Lagerung bei 4 ° C für eine kurzzeitige Lagerung oder bei -20 ° C für lange Lagerzeiten.
2. Die intravitreale Injektion von AAV-
- Anesthetize C57BL6J Mäuse mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) und überprüfen Sie die Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung. Erweitern sich die Schüler von der Hornhaut Anwendung Neosynephrin 5% und mydriaticum 0,5% Augentropfen. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Übergeben Sie eine ultrafeine 30 G disposable Nadel durch den Äquator und neben dem Limbus in die Glaskörperhöhle (siehe Chiu K, JoVE (2007) 21). Injizieren 1 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 vp ShH10-GFP oder AAV5-GFP mit der direkten Beobachtung der Nadel in der Mitte der Glaskörperhöhle (Abbildung 1). Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für ILM-Experimente. Spritzen Sie beide Augen für BRB Experimente. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle die topische Behandlung auf injizierten Augen.
- Erweitern sich die Schüler mit Neosynephrin und mydriaticum Augentropfen für die Bildgebung. Führen Fundusuntersuchungen mit einer Augenhintergrundkamera mit GFP (Green Fluorescent Protein) Ausdruck 1 Woche, 2 Wochen, 1 Monat und 2 Monate nach der intravitrealen Injektion (Abbildung 1) zu folgen. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation 1 bis 2 Monate nach der Injektion.
3. Immunhistochemie
- Für Netzhautgefrierschnitten (Abbildung 1), sezieren entkernte Augen l entfernenens und der Hornhaut, und Tauch fix in 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde.
- Cryoprotect Die vorher fest Augen in 10% Sucrose für 1 h bei Raumtemperatur, 20% Saccharose für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Cryoprotect in 30% Saccharoselösung, über Nacht bei 4 ° C. Einzufrieren und in Einbettmittel wie Cryo-Matrix einbetten Augenmuscheln. Stellen Sie 10 um Gefrierschnitten und montieren Sie auf Folien speziell für Gefrierschnitte behandelt werden und dass Gewebehaftung zu verbessern während der Färbung.
- Permeabilisieren Abschnitte mit 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 für 5 min. 2 x Waschen in PBS und Block für 1 h bei Raumtemperatur in PBS mit 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- Für retinalen Flatmounts (Abbildung 1), fix entkernte Augen in 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten, um die Präparation zu erleichtern.
- In 15 bis 30 min, sezieren die Augen, um die Hornhaut und Linse zu entfernen. Trennen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel (RPE) und Lederhaut, indem auf der Ora serrata undder Sehnerv. Tauchen Sie ein in 4% Paraformaldehyd für weitere 30 Minuten, um die Netzhaut und das fluoreszierende Protein in transduzierten Zellen der Netzhaut (Fixierung muss 24 Stunden nicht überschreiten) zu beheben. Waschen 5 min in sterilem PBS, pH 7,4.
- Ändere die PBS Blockierungspuffer (PBS mit 1% BSA, 2% normales Ziegenserum, Esel, 0,5% Triton X-100), und Inkubation in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht.
- Gewebe mit primären Antikörpern inkubieren in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht. Jeweils 3x mit PBS.
HINWEIS: Die verwendeten Antikörper sind wie folgt: Anti-Laminin (1 / 1.000) Beschriftung der ILM, anti-Rhodopsin Klon 4D2 (1/500) Kennzeichnung Stangen, Anti-Glutamin-Synthetase-Klon GS-6 (1 / 1.500) Kennzeichnungsmüllerzellen , PNA-Lektin (1/40) Kennzeichnung Kegel. - Gewebe mit 1 inkubieren: 500 Verdünnung von Alexa Fluor konjugierte sekundäre Antikörper in Blocking-Puffer für 1 Stunde (Gefrierschnitte) bzw. 2 h (Flatmounts) bei Raumtempetur und vor Licht geschützt. Jeweils 3x mit PBS.
- Machen die Linderung Schnitte an der Retina und Flatmount sie auf einen Objektträger entweder mit der Photorezeptor oder retinaler Ganglionzellen (RGCs) Seite nach oben. In wässrigen mountingmedium gelten Deckglas und bei 4 ° C.
- Führen Sie die konfokale Mikroskopie auf Laserscanning konfokalen Mikroskop. Bilder nacheinander Zeile für Zeile zu erwerben, um Anregungs- und Emissionsübersprechen zu reduzieren. Definieren Schrittgröße nach dem Nyquist-Shannon-Abtasttheorem. Verwenden Sie die Belichtungseinstellungen, die übersättigt Pixel in den letzten Bildern zu minimieren. Prozess-12-Bit-Bilder mit FIJI, Projekt Z-Profile in einer Ebene mit maximaler Intensität unter Z-Projektfunktion und schließlich konvertieren 8-Bit-RGB-Farbmodus.
4. PCR-Analyse von Maus Blutproben
- Injizieren 100 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 Partikel eines AAV-GFP in die Penisvenen betäubter C57BL6J Mäusen (5% IsofluranInduktion in einer engen Kammer und 2,5% Isofluran über einen Nasenkegel während der Operation) mit einer Insulinspritze mit einer ultrafeinen 6 mm Nadel. Das Tier wird als positive Kontrolle des zirkulierenden AAV-Partikel dienen.
- Beispiel Blut von Maus Schwanz vor der Injektion und 3 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage nachdem ShH10 intravitreale Injektion oder nach intrapeniler Injektion (Abbildung 1). Über 10 bis 20 & mgr; wird in Heparin-Röhrchen gesammelt. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation nach Abschluss des Verfahrens.
- Extrahieren genomischer DNA aus Blutproben mit dem Extraktions-Kit Ihrer Wahl.
- Führen der PCR-Amplifikation von genomischer DNA. Aus diesem Protokoll verwenden Sie die folgende Primerpaar: GFP, spüren 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-Antisense-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Das folgende PCR-Programm wurde durchgeführt: 95 ° C 2 min (1 Zyklus); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 Zyklen); 72 ° C 5 Minuten (1 Zyklus);4 ° C halten.
5. Optional Evans Blue-Methode
HINWEIS: Quantifizieren vaskulären Permeabilität durch Messung Albuminverlust von Blutgefäßen in der Netzhaut mit dem Evans-Blau-Verfahren 10.
- Bereiten Evans Blue-Farbstoff durch Lösen in einer normalen Kochsalzlösung (6 mg / ml), Ultraschallbehandlung für 5 Minuten in einem Ultraschallreiniger und Filtration durch ein 5 um-Filter.
- Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1), überprüfen Sie den Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung, und injizieren Evans Blau (45 mg / kg) durch den Penis Ader (Abbildung 1). Überprüfen Sie, ob die Pfoten, Schnauze und Ohren von Mäusen werden eindeutig blau nach Evans-Blau-Injektion, bestätigt die Aufnahme und Verteilung des Farbstoffs.
- Anesthetize C57BL6J Mäusen 3 h nach der Injektion des Farbstoffes mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), und überprüfen den Verlust righting Reflex, der eine angemessene Betäubung. Proben intrakardial etwa 500 ul Blut in Heparinröhrchen und perfundieren Mäusen für 2 min über den linken Ventrikel mit einem Citratpuffer (0,05 M, pH 3,5; aufzulösen 7,8 g Zitronensäure und 3,8 g Natriumcitrat in 1 l destilliertem Wasser) auf 37 ° C vorgewärmt, um Vasokonstriktion zu verhindern. Die Mäuse werden über die Perfusion geopfert.
- Nach Perfusion enucleate und sorgfältig sezieren beide Augen unter einem Operationsmikroskop, um die Netzhaut zu sammeln (siehe Abschnitt 3.2). Dry Netzhaut in einem Zentrifugalverdampfer über Nacht, zu wiegen, und extrahieren Sie die Evans blauen Farbstoff durch Inkubation Netzhaut mit 100 ul Formamid für 18 Stunden bei 65 ° C unter Schütteln (100 · g). Zentrifuge Retina Proben in 30K omega Filterrohre an 20,798.5 g für 2 Stunden bei 4 ° C zentrifugieren Blutproben 20,798.5 g 15 min bei 4 ° C.
- Benutzen Sie beide Überstände, um die Absorption zu messen. Bestimmen Extinktion jeder Probe durch Subtrahieren des Extinktionsmaximum for Evans Blau bei 620 nm zur Extinktion Minimum bei 740 nm. Berechnen Evans Blau-Konzentration im Plasma und der Netzhaut von einer Standardkurve von Evans-Blau in Formamid. Express BRB Lässigkeit in Mikroliter Evans Blau pro Gramm Trocken Retina pro Stunde (ul Plasma / g Netzhauttrockengewicht / Stunde).
6. Optional Fluoreszein-Angiographie
HINWEIS: Leakage von retinalen Blutgefäßen in Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Natrium Fluorescein visualisiert werden.
- Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1) und erweitern die Schüler mit Augentropfen (Neosynephrin und mydriaticum). Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Intraperitoneal injizieren 0,01-0,02 ml 10% Natriumfluorescein in 0,1 ml steriler Kochsalzlösung zur Angiographie.
- Sammeln Sie Bilder beider Augen nach der Injektion mit einem Augenhintergrundkamera. Sacrifice Mäuse durch CO 2 Inhalation nach dem Pro-verfahren.
Hinweis: 20 Sekunden sind nötig, dass die Netzhautgefäße auf Angiographie sichtbar werden. Bilder müssen zwischen 3-10 min Maximum nach Fluorescein Einspritzung erfasst werden. Die Leckflecken (falls vorhanden) sind nach 2,5 min zu beobachten. Zu späteren Zeitpunkten wird die Bildqualität aufgrund von Natriumfluorescein Diffundieren in den Glaskörper, also nur Bilder kurz nach für die Analyse verwendet wird, erhalten hat.
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Representative Results
Wir erwarten mehr retinalen Transduktion Müller Gliazellen mit ShH10 wenn das Tiermodell zeigt Störungen in der Struktur des ILM (2A - B). Zum Beispiel haben wir in Abwesenheit von DP71 gezeigt, ShH10 Targets spezifisch aber effizienter Müller Gliazellen durch intravitreale Injektion, was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der ILM in diesem Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 16 (2C - F).
AAV5 kann auch als Indikator für ILM Permeabilität verwendet werden. AAV5, unwirksam durch intravitreale Injektion in Wildtyp-Mäusen wird stark wirksam bei der Genübertragung auf Photorezeptoren in Mäuse mit eingeschränkter Netzhaut Barrieren wie die DP71-null-Mäuse 16 oder in anderen Netzhautdegenerationen 22 (2G - H). Dies bestätigt die ILM Desorganisation und potentielle Durchlässigkeit zunehe in der extrazellulären Matrix rund um die Netzhautneuronen.
Wir fanden, dass die Aufteilung der BRB DP71-null-Mäusen bleibt selektiv AAV-Partikeln, da keine Spur von AAV wurden in Blutproben von intravitreal injiziert DP71-null-Mäusen 16 (Abbildung 3).
Fig. 1: Schematische Darstellung des allgemeinen Protokoll Nach AAV Produktion Partikel in den Glaskörper oder in den Penis Vene anästhesiert erwachsenen Mäusen injiziert. Fundusbilder mit Micron III Kamera durchgeführt, um die GFP-Expression zu folgen. Die GFP-Expressionsmuster auf der Netzhaut Kryoschnitte analysiert und flatmounted Netzhaut durch Immunhistochemie und konfokaler Bilder. Das AAV-Passage durch die BRB wird durch PCR-Analyse auf Blutproben, die von intravitreal oder intrapenially injizierten Mäusen untersucht, in, um die Anwesenheit von GFP-Sequenz erkennen, Indikator für die AAV-Partikel Präsenz in den Blutstrom.
Abbildung 2: ILM Durchlässigkeit für AAV-Transduktion konfokale Bilder der flatmounted Wildtyp und DP71-null Netzhaut mit einem pan-Laminin-Antikörper (A, B) gekennzeichnet. (Maßstab: 50 um). Fundus Bilder, die GFP-Expression (C, D). Flatmounted Retinae einen Monat nach ShH10-GFP intravitreale Injektion (E, F). Dreidimensionale Rekonstitution (E *) des mit einem Stern in E zeigt gekennzeichneten Bereich transduzierten Müller Gliazellen in grün und Astrozyten in rot (anti-GFAP Antikörper). Flatmounted Netzhaut einen Monat nach der intravitrealen Injektion von AAV5-GFP (G, H) (Maßstab: 500 um). Konfokale Abbildung der durch ein Sternchen in H, die transduziert Photorezeptoren in grün und Kegel äußeren Segmente in rot (PNA-Lektin Färbung) (H *) gekennzeichneten Bereich. Die linke Spalte zeigt Ergebnisse aus Wildtyp-Maus Netzhaut und die mittlere Spalte zeigt die Ergebnisse von DP71-null-Maus Netzhaut. Das Schema (I) repräsentiert AAV-Transduktion der Retina mit geschwächtem Barrieren DP71-null Retina durch den Glaskörper. Abkürzungen: CV, Aderhautgefäße; RPE, retinale Pigmentepithel; PhR, Photorezeptorzellen (Stäbchen und Zapfen); MGC, Müller Gliazellen; HC, Horizontalzellen; BC, bipolare Zellen; AC, Amakrinzellen; M, Mikroglia; EC, Endothelzellen; P, Perizyten; GC, Ganglienzellen; A, Astrozyten; ILM, inneren Grenzmembran; V, glasartige; AAV, Adeno-assoziierten Virus. (Re-Print mit Genehmigung von Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Abbildung 3: BRB Durchlässigkeit für AAV-Partikel PCR-Amplifikation des GFP-Transgens aus Maus Blutproben extrahiert.. Mäuse entweder intravitreal (IVT) mit ShH10-GFP oder intrapenially (IP) mit AAV-GFP zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion injiziert. Lane 5-18, ungerade Zahlen für Wildtyp-Mäusen und sogar Zahlen für DP71-null-Mäuse; Bahn 2, 1 ng des AAV-Plasmid, pTR-SB-smCBA-hGFP; Spur 3, Wasser; Bahnen 5-6, Blut-DNA vor der Injektion; Bahnen 7-8, 3 Stunden nach der IVT; Spuren 9-10, 24 Stunden nach der IVT; Bahnen 11 bis 12, 24 Stunden nach der IP; Bahnen 13 bis 14, 48 Stunden nach der IVT; Bahnen 15 bis 16, 48 Stunden nach der IP; Bahnen 17 bis 18, 72 Stunden nach der IVT; Bahnen 19 bis 20, 72 Stunden nach der IP. Spuren 1 und 4, Invitrogen Skala Leiter (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000 bp. (Re-Print mit Erlaubnis von Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Discussion
Die BRB regelt den Austausch von Molekülen zwischen Blut und Netzhaut. Dessen Abbau ist mit verschiedenen Krankheiten, wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) zugeordnet ist. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in einer Dystrophin-Knock-out-Maus, die durchlässig BRB zeigt, wird die Netzhaut zügiger der Genübertragung von Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) vermittelt. Trotz BRB Lässigkeit AAV-Partikel injiziert intraokular mit dem Augenraum in diesem Modell beschränkt bleiben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Gentherapie für Krankheiten, die permeable BRB keine zusätzlichen Risiken der systemischen Nebenwirkungen, die nicht vertreten anzuzeigen. Darüber hinaus unterstützen sie die Tatsache, dass andere Barrieren wie die ILM bei Netzhauterkrankungen ermöglicht einen besseren Zugang zu Viruspartikeln kompromittiert. Unsere Ergebnisse führen uns zu glauben, dass AAV-Codierung Reportergene ist ein hervorragendes Werkzeug, um BRB Lässigkeit und ILM Integrität in Tiermodellen von Netzhauterkrankungen zu untersuchen. Insbesonsondere kann der AAV Variante ShH10, die spezifisch markiert Müller Gliazellen als Werkzeug zur retinalen Glia beschriften und Bericht über den Zustand der Netzhaut im Ansprechen auf Krankheit verwendet werden. ShH10 selektiv beschriften Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. Allerdings werden sowohl ShH10 und anderen AAV eine effizientere Genübertragung in Netzhaut mit geschwächtem Barrieren.
Einige wichtige Schritte bei der Anwendung der oben beschriebenen Protokolle sind (1) die Entwicklung manuelle Geschicklichkeit, um die sicherste intravitreale Injektion durchzuführen, und (2) richtig Fixieren des Gewebes vor und nach der Präparation. Bei der Untersuchung der Netzhaut Barrieren sollte die intravitreale Injektion gut ausgeführt werden, das ist - ohne dabei das Objektiv oder die Netzhaut. Schäden an der Linse oder Ablösen der Netzhaut beeinflusst die BRB Lässigkeit 23,24. Zusätzlich Linsenschäden verhindert Fundusaufnahmen. Das Berühren der Netzhaut können die ILM Bruch und Beschädigung der Netzhautstruktur. Zu vermeiden, berühren die Netzhaut, die ErfahMenter sollte die Spitze der Hamilton-Spritze in der Mitte der Glaskörperhöhle zu beobachten, vor der Netzhaut. Eine nicht-toxische Farbstoff kann enthalten sein (wie beispielsweise Phenol Rot oder Fluorescein) im viralen Lösung in der Beobachtung der Fluideinspritzung in den Glaskörper zu unterstützen. Schädigung der Netzhaut kann leicht während Fundusaufnahmen nach dem Spritzvorgang beobachtet werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Fixierung des Gewebes nach ausreichender Expressionsniveaus erreicht sind. Nach Enukleation, müssen die Augen sofort in Fixierungspuffer eingetaucht und vor dem Gewebe Permeabilisierung eine zweite Fixierung ist notwendig, um die GFP-Leckage zu verhindern. Es kann hilfreich sein, um die Hornhaut vor dem Eintauchen des gesamten Auges in der Fixierungsschlitz - dies gibt dem Fixiermittel eine Chance, in den Glaskörper durchdringen. Dieser Schritt kann die Gesamtgewebestabilität zu erhöhen.
Schließlich ist es auch wichtig, ausreichend AAV-Partikel zu injizieren, um effizient die Retina transduzieren und GFP ex beachtenZusammendrücken Augenhintergrund Bilder. Die optimale Menge an AAV-Partikeln etwa 10 10 -10 11 vg pro Auge, unter 10 10 Partikel die GFP-Expression nicht immer von Fundusaufnahmen beobachtet.
Diese Technik die Möglichkeit, direkt zu beobachten die ILM oder die Gefäßsystem unter der BRB nicht geben. Aber es bietet eine Möglichkeit, Netzhautbarrieren und deren Änderung bei Krankheitszuständen, in einer Weise, die zuvor mit dem Evans-Blau-Assays und Fluoreszenzangiographie nicht möglich war, zu untersuchen. Verwendung AAVs mit bestimmten retinalen Transduktion Eigenschaften ist es möglich, einen besseren Einblick in den Zustand der Netzhaut in bezug auf die Gliazellen ihre extrazellulären Matrix und ILM erhalten. Nach Beherrschung dieser Technik kann man die Wirksamkeit von Therapiestrategien und deren Einfluss auf BRB und Netzhautdurchlässigkeit zu testen und gehen Sie zu einem besseren Verständnis der Krankheitsprogression und die Möglichkeit, Normalbedingungen nach der Behandlung i wiederherzustellenna Mausmodell für Netzhauterkrankungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
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