Använda adenoassocierat virus som ett verktyg för att studera Retinal Hinder i Disease
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Muller-celler är de främsta gliaceller i näthinnan. Deras slut fötterna bildar gränserna för näthinnan vid de yttre och inre begränsande membran (ILM), och i samband med astrocyter pericyter och endotelceller de etablerar blod-retinala barriären (BRB). BRB begränsar materialtransport mellan blodet och näthinnan medan ILM fungerar som en källare membran som definierar histologiskt gränsen mellan näthinnan och glaskroppen hålrum. Märkning Müller-celler är särskilt relevant att studera fysiska tillstånd näthinnans hinder, eftersom dessa celler är en integrerad del av BRB och ILM. Både BRB och ILM ofta ändras näthinnesjukdom och ansvarar för sjukdomssymptom.
Det finns flera väl etablerade metoder för att studera integritet BRB, såsom Evans blue assay eller fluorescein angiografi. Dessa metoder behöver dock inte ge information om omfattningen av BRB permeabilitet to större molekyler, i nanometerområdet. Dessutom behöver de inte ge information om tillståndet i andra retinala hinder såsom ILM. Att studera BRB permeabilitet tillsammans retinal ILM, använde vi en AAV baserad metod som ger information om permeabilitet BRB till större molekyler samtidigt indikerar tillståndet i ILM och extracellulära matrixproteiner i sjukdomstillstånd. Två AAV varianter är användbara för sådan studie: AAV5 och ShH10. AAV5 har en naturlig tropism för fotoreceptorer, men det kan inte komma över till den yttre näthinnan när det administreras i glaskroppen när ILM är intakt (dvs i vildtyp näthinnor). ShH10 har en stark tropism mot gliaceller och kommer att selektivt märka Müller Glia i både friska och sjuka näthinnor. ShH10 ger effektivare gen leverans i näthinnor där ILM äventyras. Dessa virala verktyg tillsammans med immunohistokemi och blod-DNA-analys kasta ljus på tillståndet i retinala hinder i sjukdomen.
Introduction
Muller-celler är den huvudsakliga glia komponenten av näthinnan. Morfologiskt de spänner näthinnan radiellt och deras endfeet, i kontakt med glaskroppen, möter ILM och hemliga komponenterna i den senare. ILM är en basalmembran bestående av ett tiotal olika extracellulära matrixproteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, kollagen och flera heparinsulfat proteoglykaner). Under utveckling är dess närvaro oumbärlig för retinal histogenes, navigering av optiska axoner, och överlevnaden av ganglieceller 1-3. Dock är ILM oväsentligt i vuxen näthinnan och kan opereras bort i vissa patologier utan att orsaka skada på näthinnan 4. I genterapi, blir detta membran en fysisk barriär för effektiv transduktion av näthinnan med hjälp AAV genom intravitreal injektion 5.
Genom den omfattande arborization sina processer, Müller-celler ger närings och reglerande Support för att både retinala neuroner och vaskulära celler. Müller-celler är också involverade i regleringen av näthinnans homeostas, i bildandet och underhåll av BRB 6. Tight junctions mellan näthinnans kapillärendotelceller, Müller celler, astrocyter och pericyter bildar BRB. BRB hindrar vissa ämnen kommer in i retina.In många sjukdomar som diabetesretinopati, retinal ocklusion och luftvägssjukdomar, hypoxi av näthinnan orsakar läckage genom BRB 7-9. Detta brott är förenat med en ökad vaskulär permeabilitet leder till vasogent ödem, näthinneavlossning och retinal skador.
Müller-celler är tätt förknippade med blodkärl och basalmembranet, spelar en viktig roll i både BRB och ILM integritet. Följaktligen märkning Müller gliaceller är särskilt relevanta för studien av den fysiska tillstånd av dessa retinala hinder.
Klassiskally, är BRB permeabilitet mäts med användning av Evans blue assay bestående av systemisk injektion av Evans blå färgämne, som binder icke-kovalent till plasmaalbumin. Denna analys mäter albuminläckage (protein av mellanstorlek, ~ 66 kDa) från blodkärlen i näthinnan (se Protokoll § 5) 10. Alternativt kan den vaskulärt läckage visualiseras genom fluorescens retinala angiografi bestyrkande av läckage av fluorescein (liten molekyl, ~ 359 Da; se Protokoll § 6) 11. Ändå båda metoderna tillåter utvärdering av BRB permeabilitet för små molekyler och proteiner, men de ger ingen information om ILM integritet.
Därför, för att studera BRB permeabilitet, använde vi en AAV baserad metod som ger information om BRB permeabilitet för större molekyler (t.ex., AAV-partiklar, 25 nm diameter). Partiklar kan faktiskt vår metod upptäcka förekomst av AAV transgen i blodet, vilket skulle tyda på att ~ 25 nm diameter skullekunna infiltrera in i blodomloppet. Denna metod ger också information om strukturen i ILM och extracellulära matrixproteiner vid patologiska tillstånd. Två AAV varianter är användbara för sådan studie: AAV5 och ShH10. Subretinally injiceras, har AAV5 en naturlig tropism för fotoreceptorer och retinal pigment epitel 12 men det kan inte komma över till den yttre näthinnan när det administreras i glaskroppen i vildtyp näthinnor med intakt ILM 5,13. ShH10 är en AAV-variant som har utformats för att specifikt rikta gliaceller över nervceller 14,15. ShH10 etiketter selektivt Müller celler i både friska och sjuka näthinnor med ökad effektivitet i näthinnor med nedsatt barriärer 16. Dessa virala verktyg tillsammans med immuhistochemistry och blod-DNA-analys ger information om tillståndet i retinala barriärer och deras engagemang i sjukdom (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den BRB reglerar utbyte av molekyler mellan blod och näthinnan. Dess fördelning är förknippad med olika sjukdomar såsom diabetesretinopati eller åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi visade nyligen att i ett dystrofin knock-out mus, som visar genomsläpp BRB blir näthinnan mer tillåt till genleverans medierad av adenoassocierade virala vektorer (AAV). Men trots BRB permeabilitet AAV-partiklar injiceras intraokulärt hålla begränsas till den okulära utrymmet i denna modell. Våra resultat tyder på att …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
