Abstract
Müller cellule sono le principali cellule gliali della retina. I loro finali piedi formano i limiti della retina alle membrane limitanti esterna ed interna (ILM), e in collegamento con astrociti, periciti e cellule endoteliali stabiliscono la barriera emato-retinica (BRB). BRB limita trasporto di materiale tra il flusso sanguigno e la retina mentre la ILM agisce come una membrana basale che definisce istologicamente il confine tra la retina e la cavità vitreo. Etichettatura cellule Müller è particolarmente rilevante per studiare lo stato fisico delle barriere della retina, in quanto queste cellule sono parte integrante della BRB e ILM. Sia BRB e ILM sono spesso alterati nelle malattie della retina e sono responsabili per i sintomi della malattia.
Esistono diversi metodi ben stabiliti per studiare l'integrità del BRB, quali il test blu Evans o fluorangiografia. Tuttavia questi metodi non forniscono informazioni sul grado di permeabilità BRB to molecole più grandi, in nanometri. Inoltre, essi non forniscono informazioni sullo stato di altri ostacoli retina, come la ILM. Per studiare BRB permeabilità al fianco della retina ILM, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità della BRB di molecole più grandi, pur indicando lo stato dei ILM e della matrice extracellulare proteine in stati di malattia. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. AAV5 ha un tropismo naturale fotorecettori, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo quando l'ILM è intatto (cioè, in wild-type retine). ShH10 ha un forte tropismo verso le cellule gliali e selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. ShH10 fornisce consegna del gene più efficiente in retine dove ILM è compromessa. Questi strumenti virali accoppiato con immunoistochimica e sangue-DNA analisi hanno fatto luce sulla condizione delle barriere retina nella malattia.
Introduction
Müller cellule sono il principale componente gliale della retina. Morfologicamente, che abbracciano la retina radiale e la loro endfeet, in contatto con il vitreo, affrontano la ILM e componenti segreti di quest'ultima. La ILM è una membrana basale composta da una decina di diverse proteine della matrice extracellulare (laminina, agrin, perlecan, nidogen, collagene e proteoglicani diversi solfato eparina). Durante lo sviluppo, la sua presenza è indispensabile per istogenesi retinica, la navigazione di assoni ottica, e la sopravvivenza delle cellule gangliari 1-3. Tuttavia, ILM è inessenziale in retina adulta e può essere rimosso chirurgicamente in alcune patologie, senza causare danni alla retina 4. Nella terapia genica, questa membrana diventa una barriera fisica per la trasduzione efficiente della retina mediante AAV per iniezione intravitreale 5.
Attraverso l'ampia arborizzazione dei loro processi, le cellule Müller forniscono Suppo nutrizionale e regolamentarert per entrambi i neuroni della retina e cellule vascolari. Cellule Müller sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi retinica, nella formazione e mantenimento del BRB 6. Giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari della retina, Müller cellule, astrociti e periciti formano la BRB. BRB previene alcuni sostanze di entrare i retina.In molte malattie come la retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica e malattie respiratorie, ipossia della retina provoca perdita attraverso la BRB 7-9. Questa rottura è associato ad un aumento della permeabilità vascolare che porta a edema vasogenico, distacco della retina e danni alla retina.
Cellule Müller sono strettamente associati con i vasi sanguigni e la membrana basale, svolgendo un ruolo importante sia l'integrità BRB e ILM. Di conseguenza, l'etichettatura cellule gliali Müller è particolarmente rilevante per lo studio dello stato fisico di queste barriere retiniche.
Classicoalleato, BRB permeabilità viene misurata usando il saggio blu Evans costituito da iniezione sistemica di Evans colorante blu, che lega non covalente all'albumina plasmatica. Questo test misura la perdita di albumina (proteine di dimensioni intermedie, ~ 66 kDa) dai vasi sanguigni nella retina (vedi Protocolli sezione 5) 10. In alternativa, la perdita vascolare può essere visualizzato con la fluorescenza angiografia retinica attestante l'assenza di perdite di fluoresceina (piccola molecola, ~ 359 Da, vedere Protocolli sezione 6) 11. Tuttavia, entrambi i metodi consentono la valutazione della permeabilità BRB di piccole molecole e proteine, ma non forniscono informazioni circa l'integrità ILM.
Quindi, a studiare BRB permeabilità, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità BRB di molecole più grandi (ad esempio, le particelle di AAV, 25 di diametro nm). In effetti, il nostro metodo in grado di rilevare la presenza di AAV transgene nel sangue, il che suggerisce che le particelle ~ 25 nm di diametro farebberoessere in grado di infiltrarsi nel flusso sanguigno. Questo metodo fornisce anche informazioni sulla struttura del ILM e proteine della matrice extracellulare in condizioni patologiche. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. Subretinally iniettato, AAV5 ha un tropismo naturale per fotorecettori della retina e dell'epitelio pigmentato 12, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo in wild-type retine con ILM intatto 5,13. ShH10 è una variante AAV che è stato progettato per indirizzare specificamente cellule gliali oltre neuroni 14,15. ShH10 etichette selettivamente le cellule Müller sia retine sani e malati con maggiore efficienza in retine con barriere compromesse 16. Questi strumenti virali accoppiato con immuhistochemistry e analisi del sangue-DNA forniscono informazioni sullo stato degli ostacoli retiniche e il loro coinvolgimento nella malattia (Figura 1).
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Protocol
Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati curati e trattati secondo la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research.
1. Produzione di ricombinante AAV (rAAV) per Transient trasfezione di cellule HEK-293 17,18
NOTA: Vedere McClure C, JoVE (2011) 19.
- Purificare larga scala Miniprep (almeno 1 mg / ml) dei plasmidi vettore AAV. Utilizzare 3 plasmidi. Il plasmide AAV helper trasportano i geni del capside replica e senza terminale invertita AAV ripete ITR, la cassetta di espressione del transgene trasporta la AAV ITR denominato plasmide di trasferimento, e il plasmide fornendo i geni adenovirus helper E2, E4, e VA geni RNA contemplato come pHELPER.
- Trasfezione 293 cellule con questi 3 plasmidi usano polietilenimina (o altro reagente trasfezione). Sopra 80% di efficienza di trasfezione è necessario per una buona vii rendimenti RAL.
- Purificare AAV ricombinante da 293 lisati cellulari su una pendenza iodixanolo. 15%, 25%, 40% e 60% iodixanolo viene utilizzato per ottenere il gradiente. Colleziona 40% frazione iodixanolo contenente particelle AAV, concentrare la frazione dopo ultracentrifugazione a 500.000 xg per 1 ora e buffer di scambio contro PBS (tampone fosfato salino) con il 0,001% Pluronic.
- Per determinare virale titolo genomico 20, eseguire un DNAse ProteinaseK digest seguito da QPCR. I primer avanti e invertire amplificano la regione 62 bp situata nel AAV2 ITR. Per lo standard plasmide, la sonda è marcato con FAM e ha un buco nero quencher (BHQ).
- Eseguire qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa) in un volume finale di 25 ml con 340 Nm invertire ITR fondo, 100 nM ITR avanti fondo, 100 nM sonda AAV2 ITR, 0.4 dNTPs mm, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq e mascherina 5 microlitri (standard, campione e nessun controllo modello).
- Perlo standard, utilizzare il plasmide per la trasfezione in 7 x 10 diluizioni seriali (5 ml ciascuno di 2 x 10 9 2 x 10 3 genomi / ml risultanti in una concentrazione finale 10 ottobre-4 ottobre genomi / ml).
- Iniziare il programma da una fase di denaturazione iniziale a 95 ° C per 15 min seguita da 40 cicli di denaturazione a a 95 ° C per 1 min e ricottura / estensione a 60 ° C per 1 min. Conservare a 4 ° C per una conservazione a breve termine oa -20 ° C per lunghi periodi di stoccaggio.
2. iniezione intravitreale di AAV
- Anestetizzare topi C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita del riflesso di raddrizzamento, il ritiro e la coda reflex pinch risposta che indica il corretto anestesia. Dilatare gli alunni per l'applicazione della cornea del neosynephrine 5% e il 0,5% mydriaticum collirio. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Passare un ultrafine 30 G disposable ago attraverso l'equatore e vicino al limbus, in camera vitreale (vedi Chiu K, JoVE (2007) 21). Iniettare 1 ml magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 vp di ShH10-GFP o AAV5-GFP con l'osservazione diretta dell'ago al centro della cavità vitreale (Figura 1). Utilizzare un occhio come controllo per esperimenti ILM. Iniettare entrambi gli occhi per esperimenti BRB. Applicare un trattamento topico antinfiammatoria e antibatterica sugli occhi iniettati.
- Dilatare alunni neosynephrine e mydriaticum collirio per l'imaging. Eseguire l'esame del fondo con una fotocamera fundus dell'occhio di seguire GFP (Green Fluorescent Protein) espressione 1 settimana, 2 settimane, 1 mese e 2 mesi dopo l'iniezione intravitreale (Figura 1). Sacrificio topi da CO 2 inalazione 1 a 2 mesi dopo l'iniezione.
3. Immunoistochimica
- Per criosezioni retina (Figura 1), sezionare occhi enucleati per rimuovere lens e della cornea, e l'immersione correzione in 4% paraformaldeide per 1 ora.
- Cryoprotect gli occhi fissi precedentemente a 10% di saccarosio per 1 ora a temperatura ambiente, 20% di saccarosio per un'altra ora a temperatura ambiente. Cryoprotect in soluzione di saccarosio al 30%, overnight a 4 ° C. Congelare e paraocchi incorporare in embedding resina, come Cryo-matrix. Fare 10 micron criosezioni e montare su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato e che migliorano l'aderenza del tessuto durante la colorazione.
- Permeabilize sezioni con 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 per 5 min. Lavare 2x in PBS e blocco per 1 ora a temperatura ambiente in PBS con 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- Per flatmounts retina (Figura 1), fissare gli occhi enucleati in 4% paraformaldeide per 15 min per facilitare la dissezione.
- In 15-30 min, sezionare gli occhi per rimuovere la cornea e la lente. Separare la retina da dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sclera tagliando intorno alla serrata eil nervo ottico. Immergere in 4% paraformaldeide per altri 30 minuti per fissare la retina e la proteina fluorescente in cellule retiniche trasdotte (fissaggio non deve superare 24 ore). Lavare 5 min in PBS sterile, pH 7.4.
- Cambiare il PBS al tampone di bloccaggio (PBS con 1% BSA, 2% di capra normale o siero asino, 0,5% Triton X-100), e incubare in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente oa 4 ° C durante la notte.
- Incubare tessuti con anticorpi primari in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente o in una notte a 4 ° C. Lavare 3x con PBS.
NOTA: Gli anticorpi utilizzati sono i seguenti: anti-laminina (1 / 1.000) etichettatura della ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) aste di etichettatura, anti-glutammina sintetasi clone GS-6 (1 / 1.500) di etichettatura cellule Müller , PNA Lectin (1/40) coni di etichettatura. - Incubare tessuti con diluizione 1: 500 di anticorpi secondari coniugati fluoro Alexa in tampone di bloccaggio per 1 ora (criosezioni) o 2 ore (flatmounts) presso la sala tempetura e al riparo dalla luce. Lavare 3x con PBS.
- Effettuare tagli alleviare alla retina e flatmount è su un vetrino o con il fotoricettore o cellule gangliari della retina (RGC) lato rivolto verso l'alto. Aggiungi mountingmedium acquosa, applicare il coprioggetto e conservare a 4 ° C.
- Eseguire microscopia confocale a scansione laser confocale. Acquisire le immagini in sequenza, riga per riga, per ridurre l'eccitazione e crosstalk emissione. Definire passo secondo il teorema del campionamento di Nyquist-Shannon. Utilizzare le impostazioni di esposizione che riducono al minimo i pixel troppo saturi nelle immagini finali. Elaborare immagini a 12 bit con le Figi, progetto Z-sezioni su un unico piano con la massima intensità in funzione Z-progetto ed infine convertire in modalità colore RGB a 8 bit.
4. PCR analisi di campioni di sangue del mouse
- Iniettare 100 microlitri magazzino contenente da 1 a 4 x 10 11 particelle di un AAV-GFP nella vena del pene di topi anestetizzati C57BL6J (5% di isofluranoper l'induzione in una camera stretta e 2,5% di isoflurano attraverso un cono naso durante l'intervento chirurgico) utilizzando una siringa da insulina con un ultra-fine ago 6 millimetri. Questo animale servirà come controllo positivo di far circolare le particelle AAV.
- Campione di sangue dalla coda di topo prima dell'iniezione e 3 ore, 24 ore, 2 giorni e 3 giorni dopo l'iniezione intravitreale ShH10 o dopo l'iniezione intrapenile (Figura 1). Circa il 10-20 microlitri è raccolto in tubi eparina. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo il completamento della procedura.
- Estratto DNA genomico da campioni di sangue con il kit di estrazione di vostra scelta.
- Eseguire PCR amplificazione del DNA genomico. Per questo protocollo utilizzare la seguente coppia di primer: GFP, senso 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisenso 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Il seguente programma PCR è stata effettuata: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cicli); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C in attesa.
5. Opzionale Evans Metodo Blu
NOTA: quantificare permeabilità vascolare misurando fuoriuscita di albumina dai vasi sanguigni nella retina con il metodo blu Evans 10.
- Preparare Evans blu colorante per dissoluzione in una soluzione salina normale (6 mg / ml), sonicazione per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni, e filtrazione attraverso un filtro 5 micron.
- Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1), controllare la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritiro e la risposta coda pizzico indica una corretta anestesia, e iniettare Evans blu (45 mg / kg), attraverso la vena del pene (Figura 1). Verificare che le zampe, il muso e le orecchie di topi diventano chiaramente blu dopo l'iniezione blu Evans, confermando l'assorbimento e la distribuzione del colorante.
- Anestetizzare topi C57BL6J 3 ore dopo l'iniezione del colorante con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita di righting reflex indicando una corretta anestesia. Esempio intracardiaca circa 500 ml di sangue in tubi eparina e nei profumi topi per 2 min attraverso il ventricolo sinistro con un tampone citrato (0,05 M, pH 3,5 e sciogliere 7,8 g di acido citrico e 3,8 g di citrato di sodio in 1 L di acqua distillata) preriscaldata a 37 ° C per evitare vasocostrizione. I topi sono sacrificati tramite perfusione.
- Dopo la perfusione, enucleate e con attenzione sezionare entrambi gli occhi sotto un microscopio operatorio per raccogliere le retine (vedi Sezione 3.2). Retine secco in un evaporatore centrifuga durante la notte, pesano, ed estrarre il colorante blu Evans incubando retine con 100 ml di formammide per 18 ore a 65 ° C con agitazione (100 xg). Campioni Centrifuga retina a 30K tubi filtranti omega a 20,798.5 xg per 2 ore a 4 ° C e campioni di sangue centrifugare a 20,798.5 xg per 15 min a 4 ° C.
- Usare entrambe surnatanti per misurare l'assorbanza. Determinare l'assorbanza di ciascun campione sottraendo il massimo assorbanza for Evans blu a 620 nm al minimo assorbanza a 740 nm. Calcola Evans concentrazione blu nel plasma e della retina di una curva standard di Evans blu in formammide. Esprimere BRB permeabilità in microlitro di Evans blu per grammo di retina secca per ora (ml di plasma / g retinica peso secco / hr).
6. Facoltativo Fluoresceina angiografia
NOTA: Perdita dai vasi sanguigni della retina nei topi può essere visualizzato mediante iniezione intraperitoneale di fluoresceina sodica.
- Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1) e dilatare gli alunni con collirio (neosynephrine e mydriaticum). Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Iniettare intraperitoneale 0,01-0,02 ml 10% fluoresceina sodica in 0,1 ml di soluzione fisiologica sterile per fluorangiografia.
- Raccogliere le immagini di entrambi gli occhi dopo l'iniezione utilizzando una telecamera fundus dell'occhio. Sacrificio topi da CO 2 inalazione dopo la proprocedura.
NOTA: 20 sec sono necessari per i vasi retinici a diventare visibile su angiografia. Le immagini devono essere catturato tra 3-10 min massimo dopo l'iniezione di fluorescina. I punti di fuga (se presenti) sono osservabili dopo 2.5 min. Al più tardi momenti la qualità dell'immagine è perso a causa di fluoresceina sodica diffusione nel vitreo, quindi solo immagini poco ottenuti dopo sono utilizzati per l'analisi.
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Representative Results
Probabilmente incrementata trasduzione retinica Müller cellule gliali utilizzando ShH10 se il modello animale mostra perturbazioni nella struttura del ILM (Figura 2A - B). Ad esempio, abbiamo dimostrato che, in assenza di DP71, obiettivi ShH10 particolare, ma in modo più efficiente Müller cellule gliali di iniezione intravitreale, indicando un aumento della permeabilità della ILM in questa linea di topi rispetto ai topi wild-type 16 (Figura 2C - F).
AAV5 può anche essere usata come indicatore di ILM permeabilità. AAV5, inefficace per iniezione intravitreale in topi wild-type, diventa fortemente efficace in consegna del gene di fotorecettori in topi con barriere retina compromessa come i topi DP71-null 16 o in altre degenerazioni retiniche 22 (Figura 2G - H). Questo conferma ulteriormente la disorganizzazione ILM e potenziali increas permeabilitàe nella matrice extracellulare che circonda i neuroni retinici.
Abbiamo scoperto che, la ripartizione BRB di DP71-null mice resta selettivo alle particelle AAV poiché nessuna traccia di AAV sono stati trovati in campioni di sangue di via intravitreale iniettato DP71-null mice 16 (Figura 3).
Figura 1:. Rappresentazione schematica del protocollo generale Dopo la produzione AAV, particelle vengono iniettati nel vitreo o nella vena del pene per topi adulti anestetizzati. Immagini fundus con fotocamera Micron III vengono eseguite a seguire l'espressione GFP. Il pattern di espressione GFP è analizzato su criosezioni retiniche e flatmounted retine grazie a immunoistochimica e le immagini confocale. Il passaggio attraverso la AAV BRB è valutata mediante analisi PCR su campioni di sangue provenienti da topi per via intravitreale o intrapenially iniettati, in fine di rilevare la presenza di sequenza GFP, indicatore della presenza AAV particelle nel flusso sanguigno.
Figura 2: ILM permeabilità al AAV trasduzione immagini confocale di flatmounted wild-type e retine DP71-null marcato con un anticorpo pan-laminina (A, B). (Barra della scala: 50 micron). Immagini fundus mostrano espressione GFP (C, D). Retine Flatmounted un mese dopo ShH10-GFP iniezione intravitreale (E, F). Tre ricostituzione tridimensionale (E *) dell'area indicata da un asterisco E mostra trasduzione Müller cellule gliali in verde e in rosso astrociti (anticorpo anti-GFAP). Retine Flatmounted un mese dopo l'iniezione intravitreale di AAV5-GFP (G, H) (barra della scala: 500 micron). Immagine confocale dell'area indicata da un asterisco in H mostrando fotorecettori trasdotte in segmenti esterni verdi e cono in rosso (PNA lectina colorazione) (H *). La colonna di sinistra mostra i risultati da wild-type retine mouse e la colonna centrale mostra i risultati di retine DP71-null topo. Lo schema (I) rappresenta AAV trasduzione di retina con barriere compromessi come DP71-null retina, attraverso il vitreo. Abbreviazioni: CV, vasi coroide; RPE, epitelio pigmentato retinico; PhR, fotorecettori (coni e bastoncelli); MGC, Müller cellule gliali; HC, cellule orizzontali; BC, cellule bipolari; AC, cellule amacrine; M, microglia; CE, le cellule endoteliali; P, periciti; GC, cellule gangliari; A, astrociti; ILM, membrana limitante interna; V, del vitreo; AAV, virus adeno-associato. (Re-stampa con il permesso di Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Figura 3: la permeabilità BRB particelle AAV amplificazione PCR di GFP transgene estratto da campioni di sangue del mouse.. Mouse o iniettato per via intravitreale (IVT) con ShH10-GFP o intrapenially (IP) con AAV-GFP in tempi diversi dopo l'iniezione. Corsia 5-18, numeri dispari per topi wild-type e persino numeri per topi DP71-null; corsia 2, 1 ng del plasmide AAV, PTR-SB-smCBA-hGFP; corsia 3, acqua; Lanes 5-6, il DNA del sangue prima dell'iniezione; corsie 7-8, 3 ore post-IVT; corsie 9-10, 24 ore post-IVT; corsie 11-12, 24 ore post-IP; corsie 13-14, 48 ore post-IVT; corsie 15-16, 48 ore post-IP; corsie 17-18, 72 ore post-IVT; corsie 19-20, 72 ore post-IP. Corsie 1 e 4, Invitrogen scala scaletta (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 bp. (Re-stampa con il permesso di Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
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Discussion
La BRB regola lo scambio di molecole tra sangue e retina. La sua composizione è associata a diverse malattie come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo recentemente dimostrato che in un topo distrofina knock-out, che visualizza permeabile BRB, la retina diventa più permissiva di consegna del gene mediato da vettori virali adeno-associati (AAV). Tuttavia, nonostante BRB particelle permeabilità AAV iniettato intraoculare rimanere confinata al compartimento oculare in questo modello. I nostri risultati indicano che la terapia genica per le malattie che presentano BRB permeabile non rappresenta rischi aggiuntivi di effetti collaterali sistemici. Inoltre, sostengono il fatto che altre barriere, come la ILM diventano compromesse durante la malattia della retina che permette un migliore accesso alle particelle virali. I nostri risultati ci inducono a pensare che i geni codifica AAV Reporter è un ottimo strumento per lo studio BRB permeabilità e l'integrità ILM in modelli animali di malattie della retina. Particolare, il ShH10 variante AAV, che etichette specificamente Müller glia può essere utilizzato come strumento per etichettare glia retina e riferire sullo stato della retina in risposta alla malattia. ShH10 selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. Tuttavia, sia ShH10 e altre AAV forniranno consegna del gene più efficiente in retine con barriere compromessi.
Alcuni passi critici nell'applicazione dei protocolli sopra descritti sono (1) lo sviluppo di abilità manuale per eseguire l'iniezione intravitreale più sicuro, e (2) che fissa correttamente il tessuto prima e dopo la dissezione. Studiando le barriere della retina, l'iniezione intravitreale deve essere ben eseguito che è - senza toccare l'obiettivo o la retina. Danneggiare l'obiettivo o il distacco della retina influenza la permeabilità 23,24 BRB. Inoltre danno lente impedisce l'imaging fondo. Toccando la retina può rompersi la ILM e danneggiare la struttura della retina. Per evitare di toccare la retina, l'espeMInserire dovrebbe osservare la punta della siringa Hamilton nel mezzo della cavità vitreale, davanti alla retina. Un colorante non tossico può essere incluso (come fenolo rosso o fluoresceina) nella soluzione virale per facilitare l'osservazione della iniezione di fluido nel vitreo. I danni alla retina può essere facilmente osservato durante l'imaging fundus seguendo la procedura di iniezione. Un altro passo importante è la fissazione del tessuto dopo livelli di espressione sufficienti raggiunti. Dopo enucleazione, occhi devono essere immediatamente immersi in tampone fissativo e prima permeabilizzazione tessuto un secondo fissaggio è necessaria al fine di evitare perdite GFP. Può essere utile per fendere la cornea prima di immergere l'intero occhio in fissativo - questo darà il fissativo possibilità di permeare nel vitreo. Questo passaggio può aumentare la stabilità complessiva del tessuto.
Infine, è anche importante iniettare abbastanza particelle AAV per trasdurre efficientemente retina e osservare GFP expressione sulle immagini del fondo oculare dell'occhio. La quantità ottimale di particelle AAV è di circa 10 10 -10 11 vg per occhio, sotto 10 10 particelle l'espressione GFP non è sempre osservato da imaging fondo.
Questa tecnica non darà la possibilità di osservare direttamente l'ILM o vascolare sotto la BRB. Tuttavia fornisce un modo per esaminare gli ostacoli della retina e la modifica in stati patologici, in un modo che prima non era possibile utilizzare il blu test Evans e fluorangiografia. Utilizzando AAV con specifiche proprietà di trasduzione retinici, è possibile ottenere una migliore comprensione dello stato della retina rispetto alle cellule gliali, loro matrice extracellulare e ILM. Dopo aver imparato questa tecnica, si può verificare l'efficacia di strategie terapeutiche e la loro influenza sulla BRB e permeabilità retina e andare verso una migliore comprensione della progressione della malattia e la possibilità di ripristinare condizioni normali dopo il trattamento ina modello murino della malattia della retina.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
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