Listeria monocytogenes forårsager fosterinfektioner hos gravide kvinder og meningitis hos modtagelige befolkningsgrupper. Subpopulationer af bakterier kan kolonisere hjertevæv, forårsager myocarditis hos patienter og forsøgsdyr. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver, hvordan man vurderer L. monocytogenes hjertecelleinvasion in vitro og hjertekolonisering hos inficerede dyr.
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt fakultets intracellulært patogen, der er i stand til at forårsage alvorlige invasive infektioner hos immunkompromitterede patienter, ældre og gravide kvinder. De mest almindelige manifestationer af listeriose hos mennesker omfatter meningitis, encephalitis og fosterabort. En betydelig, men langt mindre dokumenteret sequelae af invasive L. monocytogenes infektion involverer hjertet. Dødeligheden fra hjertesygdomme kan være op til 35% på trods af behandling, men meget lidt er kendt med hensyn til L. monocytogenes kolonisering af hjertevæv og dets deraf følgende patologier. Derudover er det for nylig blevet klart, at delpopulationer af L. monocytogenes har en øget kapacitet til at invadere og vokse inden for hjertevæv. Denne protokol beskriver i detaljer in vitro- og in vivo-metoder, der kan bruges til vurdering af kardiotropisme af L. monocytogenes isolater. Metoder præsenteres for infektion af H9c2 rotte hjerte myoblaster i vævskultur samt til bestemmelse af bakteriel kolonisering af hjerter af inficerede mus. Disse metoder er nyttige ikke kun til at identificere stammer med potentiale til at kolonisere hjertevæv hos inficerede dyr, men kan også lette identifikationen af bakterielle genprodukter, der tjener til at forbedre hjertecelleinvasion og / eller drive ændringer i hjertepatologi. Disse metoder giver også mulighed for direkte sammenligning af kardiotropisme mellem flere L. monocytogenes stammer.
Listeria monocytogenes er et Gram-positivt intracellulært patogen, der kan forårsage alvorlig sygdom hos modtagelige befolkningsgrupper, herunder ældre, gravide kvinder, hiv/aids-personer og personer, der får kemoterapi1. Infektion i disse populationer er ofte et resultat af indtagelse af forurenede fødevarer, og de fleste infektioner er forbundet med store fødevarebårne udbrud2,3. Hos mennesker og andre pattedyr er L. monocytogenes i stand til at translokere over tyndtarmens epitelkant og derefter transporteres til leveren4,5. Dyremodeller tyder på, at indtagede bakterier replikeres i tarmens villi og transit til leveren gennem portalvenen eller spredes via de mesenteriske lymfeknuder i blodet, hvilket fører til hæmatotogen formidling til leveren og milt6,7. I leveren og milten er bakterien i stand til at formidle optagelse i både professionelle fagocytter såvel som bosiddende parenchymale celler og etablerer hurtigt infektioner i disse organer. Efterhånden som bakteriebelastningen øges, spredes mange bakterier tilbage i blodet, hvor de er i stand til yderligere at kolonisere modtagelige væv, herunder centralnervesystemet og moderkagen (hvor de er til stede). Kolonisering af disse steder udelukker de mest almindelige manifestationer af listeriose hos mennesker, herunder meningitis, encephalitis og fosterabort2.
Udvalgte delpopulationer af L. monocytogenes har for nylig vist sig at have en øget kapacitet til at invadere og replikere i hjertevæv8. Manifestationer af hjerte involvering er varierede, og spænder fra endocarditis og pericarditis, til fulminant myocarditis komplet med ledning abnormiteter9-13. Det samlede antal L. monocytogenes hjertetilfælde om året er lavt, men kan være undervurderet, da denne facet af infektion er ikke generelt anerkendt. Kolonisering af hjertet af patogener kræver ofte værtsdispositioner såsom allerede eksisterende valvular skader eller kunstige hjerteklapper. Der er dog isolater af L. monocytogenes, der er blevet identificeret, der er bemærkelsesværdige for deres evne til at kolonisere hjerter af inficerede dyr i mangel af hjerteskader og / eller abnormiteter8.
Heri er beskrevet in vitro og in vivo metoder til vurdering af bakteriel kolonisering af hjertevæv i inficerede dyr ved hjælp af invasionsanalyser i vævskultur samt levende dyreinfektioner. Disse metoder har vist sig nyttige til ikke kun at identificere stammer med potentiale til at kolonisere hjertevæv hos inficerede dyr, men bør også være nyttige til identifikation af bakterielle genprodukter, der tjener til at forbedre hjertecelleinvasion og / eller resultere i ændringer i hjertepatologi. Disse metoder letter sammenligningen af kardiotropisme mellem flere stammer. For de metoder, der er beskrevet her, anvendes L. monocytogenes 10403S som en velunderprøvet repræsentant for en ikke-kardiotropisk stamme, og det kliniske isolate 07PF0776 bruges som et repræsentativt eksempel på en kardiotropisk stamme. Disse to stammer blev valgt til at give en sammenligning for bakteriel invasion af hjerteceller in vitro og kolonisering af hjerter af inficerede mus in vivo. Den isolere 07PF0776 er en klinisk isolere inddrives fra en mellemliggende byld, der forårsagede en dødelig arytmi i en HIV + patient8. L. monocytogenes isolater kan variere i deres virulens potentiale, og i betragtning af tilbøjeligheden til Listeria at inficere personer med immunosuppression og gravide kvinder, personer i disse populationer bør udvise forsigtighed, mens vurderingen af forskellige kliniske isolater.
L. monocytogenes er et udbredt og velkaraktereret menneskeligt patogen, der er i stand til at forårsage en række forskellige sygdoms manifestationer15. Bakterien er tidligere blevet beskrevet for sin evne til at translokere på tværs af barrierer, såsom blod-hjerne-barriere og placenta-foster barrierer, for at nå og kolonisere centralnervesystemet og udvikle fosteret, henholdsvis. Organismens in vivo-evne til at kolonisere disse væv suppleres ofte af en in vitro-evne til at inv…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud AI41816 og AI099339 (N.E.F.) og af F31AI094886-01 (P.D.M.) fra NIAID. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringskildernes officielle synspunkter.
Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |