تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا
Summary
الليستيريا monocytogenes يسبب التهابات الجنين في النساء الحوامل والتهاب السحايا في السكان المعرضين. يمكن أن تستعمر الاكتظاظ السكاني الفرعي للبكتيريا أنسجة القلب ، مما يسبب التهاب عضلة القلب في المرضى المختبر. هنا نقدم بروتوكولا يصف كيفية تقييم L. monocytogenes غزو الخلايا القلبية في المختبر والاستعمار القلبي في الحيوانات المصابة.
Abstract
الليستيريا monocytogenes هو مسببات الأمراض داخل الخلايا إيجابية الغرام التي هي قادرة على التسبب في التهابات الغازية الخطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، وكبار السن، والنساء الحوامل. المظاهر الأكثر شيوعا من الليستريات في البشر تشمل التهاب السحايا والتهاب الدماغ والإجهاض الجنيني. وهناك تتمة كبيرة ولكن أقل توثيقا بكثير من العدوى L. monocytogenes الغازية ينطوي على القلب. يمكن أن يصل معدل الوفيات الناجمة عن مرض القلب إلى 35٪ على الرغم من العلاج ، ولكن لا يعرف سوى القليل جدا فيما يتعلق ب استعمار L. monocytogenes للأنسجة القلبية والأمراض الناتجة عنها. وبالإضافة إلى ذلك، أصبح من الواضح مؤخرا أن الاكتظاظ السكاني الفرعي من L. monocytogenes لديها قدرة معززة لغزو وتنمو داخل الأنسجة القلبية. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل في المختبر وفي أساليب الجسم الحي التي يمكن استخدامها لتقييم cardiotropism من L. يعزل monocytogenes. وتقدم أساليب للعدوى من الخلايا العضلية القلبية الفئران H9c2 في زراعة الأنسجة، فضلا عن تحديد الاستعمار البكتيري لقلوب الفئران المصابة. هذه الأساليب مفيدة ليس فقط لتحديد السلالات التي يمكن أن تستعمر الأنسجة القلبية في الحيوانات المصابة ، ولكن قد تسهل أيضا تحديد المنتجات الجينية البكتيرية التي تعمل على تعزيز غزو خلايا القلب و / أو دفع التغيرات في أمراض القلب. هذه الأساليب توفر أيضا للمقارنة المباشرة من القلب بين سلالات متعددة L. monocytogenes.
Introduction
الليستيريا monocytogenes هو الممرض داخل الخلايا إيجابية غرام قادرة على التسبب في مرض شديد في السكان المعرضين، بما في ذلك كبار السن، والنساء الحوامل، والأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز، والأشخاص الذين يتلقون العلاج الكيميائي1. وكثيرا ما تكون العدوى بين هذه المجموعات نتيجة تناول منتجات غذائية ملوثة، وترتبط معظم الإصابات بتفشي المرض على نطاق واسع المنقول بالأغذية2.3. في البشر والثدييات الأخرى ، L. monocytogenes قادرة على نقل عبر الحدود الظهارية للأمعاء الدقيقة ، وبعد ذلك يتم نقلها إلى الكبد4،5. وتشير النماذج الحيوانية إلى أن البكتيريا المبتلعة تتكرر داخل الزغب المعوي وتمر إلى الكبد عبر الوريد البوابي أو تنتشر عبر الغدد الليمفاوية الميسنتريكية في مجرى الدم، مما يؤدي إلى انتشار الدم إلى الكبد والطحال6،7. في الكبد والطحال ، والبكتيريا قادرة على التوسط امتصاص في كل من الخلايا الفصيلية المهنية وكذلك الخلايا parenchymal المقيمين ، ويقيم بسرعة العدوى داخل هذه الأجهزة. مع زيادة الحمل البكتيري ، يتم تشتيت العديد من البكتيريا مرة أخرى في الدم ، حيث تكون قادرة على استعمار المزيد من الأنسجة المعرضة بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي والمشيمة (عند وجودها). استعمار هذه المواقع يحول دون المظاهر الأكثر شيوعا من الليستريات في البشر، بما في ذلك التهاب السحايا والتهاب الدماغ، والإجهاضالجنيني 2.
وقد تبين مؤخرا أن الخلايا الفرعية المختارة من L. monocytogenes لديها قدرة معززة على غزو وتكرار داخل الأنسجة القلبية8. وتتنوع مظاهر مشاركة القلب، وتتراوح بين التهاب الشغاف والتهاب التامور، لالتهاب عضلة القلب فولمينانت كاملة مع تشوهات التوصيل9-13. العدد الإجمالي لحالات القلب أحادية السيتوجينات L. في السنة منخفض ولكن قد يكون أقل من التقدير لأن هذا الجانب من العدوى غير معترف به بشكل جيد بشكل عام. استعمار القلب من قبل مسببات الأمراض غالبا ما يتطلب الاستعداد المضيف مثل الضرر الصمامي الموجودة من قبل أو صمامات القلب الاصطناعية. ومع ذلك، هناك عزلات من L. monocytogenes التي تم تحديدها التي هي ملحوظة لقدرتها على استعمار قلوب الحيوانات المصابة في غياب أي تلف القلب و / أو شذوذ8.
هنا توصف في المختبر وفي أساليب الجسم الحي لتقييم الاستعمار البكتيري للأنسجة القلبية داخل الحيوانات المصابة باستخدام المقايسات الغزو في زراعة الأنسجة، فضلا عن العدوى الحيوانية الحية. وقد أثبتت هذه الطرق فائدتها ليس فقط لتحديد السلالات التي لديها القدرة على استعمار الأنسجة القلبية في الحيوانات المصابة ، ولكن ينبغي أيضا أن تكون مفيدة لتحديد المنتجات الجينية البكتيرية التي تعمل على تعزيز غزو خلايا القلب و / أو تؤدي إلى تغييرات في أمراض القلب. هذه الأساليب تسهل مقارنة القلب بين سلالات متعددة. للأساليب الموصوفة هنا, L. monocytogenes 10403S يستخدم كممثل مدروسة جيدا من سلالة غير القلب الاستوائية ويتم استخدام عزل السريرية 07PF0776 كمثال تمثيلي لسلالة القلب والتروبيك. وقد تم اختيار هذين النوعين لتوفير مقارنة للغزو البكتيري للخلايا القلبية في المختبر والاستعمار من قلوب الفئران المصابة في الجسم الحي. عزل 07PF0776 هو عزل السريرية تعافى من خراج التدخلية التي تسببت في عدم انتظام ضربات القلب القاتلة في فيروس نقص المناعة البشرية + المريض8. L. قد تختلف عزلات أحادية السيتوجينات في إمكاناتها الفوعة، ونظرا لميل ليستريا لإصابة الأشخاص مع كبت المناعة والنساء الحوامل، والأشخاص داخل هذه المجموعات السكانية يجب توخي الحذر أثناء تقييم العزلات السريرية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes هو مسببات الأمراض البشرية واسعة الانتشار وتتميز بشكل جيد، وقادرة على التسبب في عدد من مظاهر المرض المختلفة15. وقد وصفت البكتيريا في وقت سابق لقدرتها على نقل عبر الحواجز، مثل حاجز الدم في الدماغ وحواجز المشيمة والجنين، من أجل الوصول واستعمار الجهاز العصبي المركزي والجن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منح دائرة الصحة العامة منظمة العفو الدولية 41816 وAI099339 (N.E.F.) وF31AI094886-01 (P.D.M.) من المعهد الوطني للتنمية الدولية. وتقع المحتويات على عاتق المؤلفين فقط ولا تمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمصادر التمويل.
Materials
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
