Summary
ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות. תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב במבחנה קולוניזציה לב בבעלי חיים נגועים.
Abstract
ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאי פקולטטיבי גראם חיובי המסוגל לגרום לזיהומים פולשניים חמורים בחולים immunocompromised, קשישים, ונשים בהריון. הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם כוללים דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית. סרט המשך משמעותי אך הרבה פחות מתועד של זיהום פולשני L. monocytogenes כרוך בלב. שיעור התמותה ממחלות לב יכול להיות עד 35% למרות הטיפול, אולם מעט מאוד ידוע לגבי L. monocytogenes קולוניזציה של רקמת לב ופתולוגיות וכתוצאה מכך. בנוסף, לאחרונה התברר כי תת-אוכלוסיות של L. monocytogenes יש יכולת משופרת לפלוש ולגדול בתוך רקמת הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט במבחנה ובשיטות vivo שניתן להשתמש בהם להערכת קרדיוטרופיזם של L. מונוציטוגנים מבודד. שיטות מוצגות לזיהום של myoblasts לב עכברוש H9c2 בתרבית הרקמות, כמו גם לקביעת קולוניזציה חיידקית של לבבות של עכברים נגועים. שיטות אלה שימושיות לא רק לזיהוי זנים בעלי פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אלא גם להקל על זיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים לשיפור פלישת תאי הלב ו/או לקדם שינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מספקות גם השוואה ישירה של קרדיוטרופיזם בין זנים מרובים L. monocytogenes.
Introduction
ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאיים גראם חיובי מסוגל לגרום למחלות קשות באוכלוסיות רגישות, כולל קשישים, נשים בהריון, אנשים עם HIV / איידס, ואנשים המקבליםכימותרפיה 1. זיהום באוכלוסיות אלה הוא לעתים קרובות תוצאה של בליעת מוצרי מזון מזוהמים, ורוב הזיהומים קשורים להתפרצויות מזון בקנה מידה גדול2,3. אצל בני אדם ויונקים אחרים, L. monocytogenes הוא מסוגל translocating מעבר לגבול האפיתל של המעי הדק, לאחר מכן מועבר לכבד4,5. מודלים של בעלי חיים מראים כי חיידקים שנבלעו לשכפל בתוך villi מעיים ולעבור לכבד דרך וריד הפורטל או להתפשט דרך בלוטות הלימפה mesenteric לתוך זרם הדם, המוביל הפצה המטוגנית לכבד טחול6,7. בכבד ובטחול, החיידק מסוגל לתווך ספיגה לתוך שני phagocytes מקצועי, כמו גם תאים parenchymal תושב, במהירות קובע זיהומים בתוך איברים אלה. ככל שעומס החיידקים עולה, חיידקים רבים מפוזרים בחזרה לדם, שם הם מסוגלים ליישב עוד יותר רקמות רגישות כולל מערכת העצבים המרכזית ושליה (שם קיים). קולוניזציה של אתרים אלה מונעת את הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם, כולל דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית2.
אוכלוסיות נבחרות של L. monocytogenes הוכחו לאחרונה יש יכולת משופרת לפלוש ולשכפל בתוך רקמת הלב8. ביטויים של מעורבות בלב הם מגוונים, והם נעים בין אנדוקרדיטיס ודלקת קרום הלב, כדי דלקת שריר הלב fulminant להשלים עם הפרעות הולכה9-13. המספר הכולל של מקרי לב L. monocytogenes בשנה הוא נמוך אבל עשוי להיות תחת הערכה כמו היבט זה של זיהום אינו מוכר בדרך כלל היטב. קולוניזציה של הלב על ידי פתוגנים לעתים קרובות דורש נטייה מארח כגון נזק valvular קיים מראש או שסתומי לב מלאכותיים. ישנם, עם זאת, מבודדים של L. monocytogenes כי זוהו כי הם בולטים ביכולתם ליישב את ליבם של בעלי חיים נגועים בהעדר כל נזק לב ו / או חריגות8.
להלן מתוארים במבחנה ושיטות vivo להערכת קולוניזציה חיידקית של רקמת לב בתוך בעלי חיים נגועים באמצעות מבחני פלישה בתרבית הרקמות, כמו גם זיהומים חיים בבעלי חיים. שיטות אלה הוכיחו שימושי לא רק לזיהוי זנים עם פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אבל צריך גם להיות שימושי לזיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים כדי לשפר את הפלישה לתאי לב ו / או לגרום לשינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מקלות על השוואת קרדיוטרופיה בין זנים מרובים. עבור השיטות המתוארות כאן, L. monocytogenes 10403S משמש כנציג נחקר היטב של זן שאינו קרדיוטרופי ואת המבודד הקליני 07PF0776 משמש כדוגמה מייצגת של זן קרדיוטרופי. שני זנים אלה נבחרו כדי לספק השוואה לפלישה חיידקית של תאי לב במבחנה ו קולוניזציה של לבבות של עכברים נגועים vivo. הבידוד 07PF0776 הוא מבודד קליני התאושש מורסה בין חדרית שגרמה להפרעות קצב קטלניות בחולה HIV +8. L. מונוציטוגנים מבודדים עשויים להשתנות בפוטנציאל הארסיות שלהם, ובהתחשב בנטייה ליסטריה להדביק אנשים עם דיכוי חיסוני ונשים בהריון, אנשים בתוך אוכלוסיות אלה צריכים לנקוט זהירות תוך הערכת מבודדים קליניים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תנאי אחסון ותרבות לזנים של L. מונוציטוגנים
- הכן מדיה מוצקה על ידי autoclaving המוח לב עירוי אגר (BHI) ושופך את התקשורת מותכת לתוך צלחות פטרי. אפשר את הצלחות להתייבש לילה בטמפרטורת החדר, ואז לילה שוב ב 37 מעלות צלזיוס.
- באמצעות לולאה סטרילית, להשיג מדגם קטן של L. monocytogenes מן או בעבר עשה מניות מקפיא (חיידקים מושעה 20% גליצרול במדיה נוזלית BHI, מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) או מצלחת אגר המכיל מושבות פגע בעבר לבידוד.
- באמצעות טכניקה אספטית, פס המדגם לבידוד מושבה אחת. הקפד לעקר את הלולאה בין פסים צולבים כדי למנוע נשיאה עודפת ולהבטיח את הבידוד של מושבות בודדות של המתח להיות מוערך. דגירה של הצלחות לילה ב 37 °C (69 °F).
- באמצעות לולאה סטרילית, להסיר מושבה אחת של לבודד לחסן 2 מ"ל של מרק BHI (ללא אגר) בצינור פוליסטירן 14 מ"ל.
- עבור מבחנים וזיהומים, דגירה את תרבות המרק באופן סטטי (ללא רעידות) לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. עבור גרב של מבודדים תרבותיים, דגירה תרבות המרק ב 37 °C (69 °F) עם רועד ב 180-200 סל"ד לילה. תרבויות ניתן למלא על ידי הוספת גליצרול לריכוז הסופי של 20% ואחסון צינורות אטומים ב -80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
2. אחסון ותנאי Culturing של H9c2 תאים דמויי מיובלסט לב
- לרכוש או להשיג מלאי קפוא של תאי H9c2, כמו גם בינוני הנשר שונה של דובלקו (DMEM) המכיל גלוקוז גבוה פירובט, סרום שור עוברי (FBS), L-גלוטמין (גלוט), ותערובות פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG). FBS, Glut, ו PSG צריך להיות מצויד ב -20 °C (69 °F), בעוד DMEM ניתן לאחסן ב 4 °C (69 °F). זה מועיל aliquot FBS לתוך צינורות חרוט 50 מ"ל לפני ההקפאה.
- בברדס זרימה למינארי, להפשיר שני aliquots של FBS. הוסף aliquot אחד לבקבוק אחד 500 מ"ל של DMEM, מה שהופך 10% FBS / DMEM תערובת. לזה, להוסיף 6 מ"ל של גלוט ומלאי הפתרון וכתוצאה מכך ב 4 מעלות צלזיוס. פתרון זה יכול להיות שכותרתו "DMEM ללא אנטיביוטיקה." (DMEM – Ab)
- לבקבוק 500 מ"ל שני של DMEM, להוסיף את aliquot 50 מיליליטר אחרים של FBS. לפתרון זה, להוסיף 6 מ"ל של PSG ומלאי ב 4 °C (60 °F). פתרון זה יכול להיות שכותרתו "DMEM עם אנטיביוטיקה." (DMEM +Ab)
- בעוד במכסה המנוע למינאר, להסיר 10 מ"ל של DMEM +Ab ומניחים בקבוק 25 מ"ל תרבית רקמה.
- משאירים את הבקבוק במכסה המנוע למינאר, להסיר aliquot קפוא של תאי H9c2 מאחסון חנקן נוזלי במהירות למקם את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד התרבות הפשירה.
- לרסס את הצינור עם 70% אתנול כדי לחטא, ואז לחזור למכסה המנוע. עובד במהירות כדי למזער את זמן התא DMSO מרוכז, להוסיף את aliquot מלא של תאים 10 מיליליטר של DMEM +Ab. זה מדלל את DMSO מספיק עבור הכדאיות וההקפדה על תאים בן לילה.
- מניחים את הבקבוק באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (67 °F), 5% C02, ו 95% לחות לילה.
- למחרת בבוקר, בדוק את שכבת התא כדי להבטיח דבקות. תאים צפויים להיות בין 80-100% מפגש בשלב זה.
- במכסה המנוע של תרבות הרקמות, הסר את המדיה הכלולה בתוך הבקבוק באמצעות הוואקום, והשאיר רק את התאים בתוך הבקבוק.
- מוסיפים לתאים כ-2 מ"ל של 0.25% טריפסין-אדטה ומתנדנדים בעדינות למשך כ-3 שניות.
- הפוך את הבקבוק כך פתרון טריפסין הוא כבר לא במגע עם monolayer, ולהסיר את טריפסין על ידי ואקום.
- מוסיפים 2 מ"ל שני aliquot של טריפסין לתאים, ולהעביר את הבקבוק למיקרוסקופ הפוך. התבונן בתאים תוך נדנדה עדינה של הבקבוק כדי להבטיח את המונולייר מתפזר.
- לאחר המונולאייר מפוזר, מיד לחזור למכסה המנוע תרבית הרקמה ולהוסיף 4 מ"ל של DMEM +Ab להשעיית התא.
- הסר חלק 2 מ"ל של השעיית התא, ולהוסיף אותו בקבוק תרבית רקמות 50 מ"ל המכיל 23 מ"ל של DMEM +Ab. רוק הבקבוק בעדינות, ולאחר מכן למקם אותו באינקובטור רקמה-תרבות בתנאים המפורטים בשלב 2.5.
- בדוק את התאים מדי יום עד שהם מגיעים כ 80% מפגש (כ 2.0-4.0 x 105 תאים לכל מיליליטר). חשוב מאוד כי התאים אינם הופכים להיות משולבים מדי, כפי שהם עשויים להבדיל לתוך myotubes שריר השלד כאשר מורעבים של FBS לפרקי זמן ממושכים14 ובידול זה יכול לשנות פלישה חיידקית. לפקח על התאים בזהירות ולהתחיל עם צינור חדש של תאים אם תרבות הופכת להיות confluent.
- ברגע שהתאים מגיעים 80% מפגש, הם יכולים להיות מעבר לתוך בקבוק אחר 50 מיליליטר כפי שתואר רק, או מוכן לבדיקת פלישה.
3. הכנת תאי H9c2 לבדיקת פלישה
- במכסה המנוע של תרבית הרקמות, הסר את המדיה מבקבוק של 50 מ"ל של תאי H9c2 שהגיעו ל-80% מפגש באמצעות שאיפת ואקום.
- הוסף 4 מ"ל של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA כדי monolayer ולהסיר מיד באמצעות שאיפה ואקום.
- הוסף עוד 4 מ"ל חלק של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוק ולהעביר את הבקבוק למיקרוסקופ הפוך כדי להתבונן בפיזור של monolayer.
- לאחר התאים התפזרו, לחזור למכסה המנוע ולהוסיף 4 מ"ל של DMEM – Ab לתאים. צנרת הפתרון למעלה ולמטה מבטיחה הסרה מלאה של תאים מתחתית הבקבוק.
- לאחר ההשעיה מחדש של המונולאייר, להסיר את כל ההשעיה ומניחים אותו בצינור חרוט 50 מ"ל.
- הסר חלק 20 ul של השעיה זו ולספור את מספר התאים למיליליטר באמצעות hemocytometer.
- לאחר ריכוז התאים בתמיסה נקבע, להתאים את הריכוז 2.25 x 104 תאים / מיליליטר על ידי הוספת נפח המתאים של פתרון התא DMEM טרי – Ab. הנפח הכולל של הפתרון המותאם צריך להיות 25 מ"ל.
- בעוד בשכונה, לעקר כיסויי זכוכית על ידי טבילת אותם 90% אתנול בקצרה עובר כל כיסוי דרך להבה. הוסף כל כיסוי לבאר בודדת של צלחת שטופלה בתרבית רקמה של 24 באר מיד לאחר עיקורה.
- אחרי כל בארות יש coverslip בודדים, להשתמש 25 מיליליטר פיפט להוסיף 1 מ"ל של פתרון התא מדולל לכל בארות בצלחת, ולדחוף כל coverslip למטה עם מחט סטרילית.
- בדוק כל באר באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח כמויות דומות של תאים נמצאים בכל באר. שים את צלחת 24 גם באינקובטור תרבית הרקמה לילה ב 37 °C (70 °F) ב 5% CO2 ו 95% לחות.
- למחרת בבוקר, להציג כל באר כדי להבטיח כי coverslips יש כמויות דומות של myoblasts חסידים וכי coverslips אינם צפים בבאר.
4. הכנת זנים של L. מונוציטוגנים עבור מבחני פלישה
הערה: כל עבודת המעבדה מתבצעת בהתאם להנחיות CDC Biosafety רמה 2.
- לאחר הכנת צלחת 24-well לבדיקה, להשתמש בלולאה מעוקרת כדי להסיר מושבות בודדות של הזנים להיבדק לפלישה חיידקים לחסן כל אחד לתוך צינורות בודדים 14 מיליליטר המכיל 2 מ"ל של מרק BHI.
- מניחים את הצינורות מחוסנים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס מוטה ב 45 ° ו הדגירה סטטית (ללא רועד) לילה.
- למחרת בבוקר, להסיר את צינור התרבות מן האינקובטור ומערבולת בקצרה כדי להבטיח השעיה אחידה של החיידקים.
- למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל 600 ננומטר. הקפד לאפס את הספקטרופוטומטר באמצעות מרק BHI סטרילי לפני קריאת הצפיפות האופטית.
- עבור L. monocytogenes, הצפיפות האופטית קשורה ישירות לריכוז של חיידקים לכל מיליליטר, כך צפיפות של 1.000 = 1.0 x 109 CFU לכל מיליליטר.
- לחשב את כמות התרבות הדרושה כדי להדביק 2.25 x 104 תאים עם 2.25 x 106 (MOI = 100).
- הסר את כמות התרבות הדרושה ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- לסובב את התרבות ב 19,000 x g במשך 3 דקות, ואז להשליך את supernatant. הקש על הקצה הפתוח של הצינור נגד מגבת נייר על מנת להסיר מדיה עודפת דבוק לשפה של הצינור.
- לשים מחדש את החיידקים ב 1 מ"ל של PBS סטרילי, ומערבולת כדי להבטיח ערבוב מספיק. תערובת זו צריכה להכיל כ 2.25 x 106 CFU לכל 20 ul (1.125 x 108 CFU / מיליליטר).
5. ביצוע מבחני הפלישה
- יום לפני מבחני הפלישה, הכינו צלחות 24 באר של תאי H9c2 כמתואר בסעיף 3, וגם לחסן מרק BHI סטרילי עם הזנים הרצויים של ליסטריה כמתואר בסעיף 4.
- באמצעות הפרוטוקול בסעיף 4, להכין תרבויות PBS-resuspended של הזנים כדי להיות מוערך לפלישה. הערה: טיטר זיהומיות ניתן להעריך בשלב זה על ידי ציפוי דילול של כל מדגם על מדיה מוצקה וספור מושבות לאחר דגירה לילה.
- לטעון לפחות 20 ul של הפתרון PBS-חיידקים לתוך בארות בודדות של צלחת 24-well. שים לב כי לפחות שלוש בארות בודדות נדרשות עבור כל זן על מנת להשיג תוצאות משולש, כך עד 8 זנים ניתן להעריך יחד.
- לאחר טעינת בארות עם חיידקים, בעדינות לטלטל את הצלחת כדי לעודד התפשטות הומוגנית של כל מדגם בתוך הבאר, ומניחים את צלחת 24-well בחזרה באינקובטור במשך 45 דקות של דגירה ב 37 °C (67 °F) ו 95% לחות, עם 5% CO2.
- במהלך דגירה זו, להכין aliquot של DMEM – Ab (סעיף 2) פשוט על ידי הסרת 25 מ"ל של DMEM –Ab ומניחים אותו בצינור בז 50 מ"ל (או שווה ערך).
- הוסף גנטמיצין 25 מיליליטר DMEM – Ab aliquot לריכוז של 15 UG / ml (7.5 ul של פתרון 50 מ"ג / מ"ל המניה). מניחים את הפתרון DMEM – Ab + גנט ב מרחץ מים 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות הדגירה.
- Aliquot 25 מ"ל של PBS לתוך צינור בז 50 מ"ל ומניחים את מרחץ המים 37 מעלות צלזיוס במהלך הדגירה 45 דקות.
- לאחר 45 דקות הדגירה הושלמה, להסיר את צלחת 24-well ומניחים אותו מכסה המנוע. הסר את המדיה המכילה חיידקים מכל באר על ידי שאיפת ואקום, שינוי טיפים צינור זכוכית בין זנים שונים.
- הוסף כ 1 מ"ל של PBS לכל באר על מנת לשטוף חיידקים חסידים רופף מפני השטח של התאים, ולאחר מכן להסיר את PBS באמצעות שאיפה ואקום.
- לאחר הסרה מלאה של PBS, להוסיף 1 מ"ל של DMEM –Ab +Gent לכל באר. הג'נטמיצין יהרוג רק את אותם חיידקים שנשארים מחוץ לתאים, ולכן אלה שהם תאיים יישארו בני קיימא.
- מניחים את הצלחת 24-well בחזרה לתוך החממה ולאפשר דגירה במשך שעה נוספת.
- במהלך הדגירה באורך שעה, להכין 14 מ"ל צינורות פוליפרופילן על ידי הוספת 1 מ"ל של ddH סטרילי20 לכל צינור. צינור אחד יידרש עבור כל כיסוי, כך עבור צלחת אחת 24-באר, להכין 24 צינורות בסך הכל.
- לאחר הדגירה באורך שעה, מוציאים את צלחת ה-24 באר מהחממה ומניחים אותה במכסה המנוע, יחד עם הצינורות שהוכנו בשלב 5.12.
- באמצעות פינצטה סטרילית, להסיר כל כיסוי מן הבאר שלה בהתאמה ומניחים אותו מיד בצינור בודד. הקפידו לטבול את פינצטה באתנול ולהצית אותם בין כל כריכה על מנת למנוע זיהום.
- לאחר שכל הכיסויים הוסרו והונחו בצינורות בודדים, השליכו את צלחת ה-24 באר.
- חזור לספסל ומערבולת כל צינור במשך 5-10 שניות.
- הסר חלק מכל צינור ומניחים כל דגימה בבאר בודדת של צלחת 96-well, ולאחר מכן לדלל באופן סדרתי כל מדגם באמצעות 1:10 דילול עד 1:1,000 דילול.
- בעזרת צלחות LB מחממות ויבשות, יש לאתר צלחת כל אחת מסדרת הדילול על צלחות האגר. צינור רב ערוצי יכול לשמש צלחת 5-10 כתמים μl מסדרת דילול של כל מדגם.
- גם להסיר 20 דגימות μl מכל באר לא מדוללת צלחת ספוט סכום זה ישירות על אגר LB על צלחת נפרדת מסדרת דילול. (נפח גדול יותר זה יכול לשמש כדי למנות זנים פולשניים גרוע).
- לאחר שכל הדגימות כבר מצופה נקודה, להשליך את צינורות 14 מ"ל המכילים את coverslips. מפארים את צלחת ה-96 באר ומניחים אותה בקופסת מקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לריפלוח מחדש, במידת הצורך.
- אפשר כתמים להתייבש לחלוטין. תהליך זה הוא מיהר מאוד על ידי הצבת הצלחות במכסה המנוע והסרת העפעפיים.
- לאחר הכתמים התייבשו, מניחים את הצלחות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה.
- למחרת בבוקר, לספור את מספר המושבות בכל נקודה של סדרת הדילול שעבורה ניתן להעריך בקלות את מספרי המושבות (בין 5 ל -50 מושבות) (איור 1), ולהשתמש בסדרה כדי לחשב את מספר החיידקים לכל כיסוי עבור כל זן מוערך.
6. הכנת זנים של L. מונוציטוגנים עבור זיהומים בעכבר
- בלילה שלפני ההדבקה, השתמש בלולאה מעוקרת כדי להסיר מושבות בודדות של הזנים הרצויים ולחסן כל אחד לתוך צינורות בודדים 14 מיליליטר המכילים 2 מ"ל של מרק BHI.
- מניחים את הצינורות מחוסנים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס מוטה ב 45 ° ו הדגירה סטטית (ללא רועד) לילה.
- למחרת בבוקר, להסיר את צינור התרבות מן האינקובטור ואת המערבולת בקצרה כדי להבטיח השעיה אחידה של החיידקים.
- למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל 600 ננומטר. הקפד לאפס את הספקטרופוטומטר באמצעות מרק BHI סטרילי לפני קריאת הצפיפות האופטית. (עבור L. monocytogenes, הצפיפות האופטית קשורה ישירות לריכוז של חיידקים לכל מיליליטר, כך צפיפות של 1.000 = 1.0 x 109 CFU לכל מיליליטר)
- לחשב את כמות התרבות הדרושה כדי להדביק כל חיה. זריקות בדרך כלל מכילים 200 μl של PBS עם 10,000 CFU של זן בודד, אשר מתרגם לריכוז הרצוי של 5.00 x 104 CFU / מיליליטר.
- הסר aliquot 5 μl של כל דילול סופי ולהפיץ צלחת אותו ישירות על LB אגר. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאשר את הריכוז המשמש לחיסון.
- להזריק כל השעיה CFU בתוך 1 שעה של דילול (ראה להלן).
7. חיסון L. מונוציטוגנים לעכברים באמצעות הזרקת וריד הזנב והערכת נטל חיידקי בתוך הכבד, הטחול והלב
הערה: כל העבודה בבעלי חיים מתבצעת בהתאם להנחיות CDC Biosafety רמה 2. עכברים מוזמנים בדרך כלל שבוע מראש וכלואים יחד עם 5 בעלי חיים בכלוב. עכברים רשאים להתאקלם בסביבת המעבדה החדשה במשך ארבעה ימים לפני ההזרקה. ניסויים אלה השתמשו בעכברים שוויצריים-וובסטרים בני 6-8 שבועות ששוכנו 5 בכלוב בסביבת מחסום והאכילו דיאטה לא מוגבלת.
- הכן כלוב אחד של עכברים בכל פעם על ידי הסרת המכסה ופחי מזון / מים, והנחת הכלוב תחת מנורת חום במשך חמש דקות. תהליך זה מאפשר לוורידי הזנב להתארך, מה שהופך את הזריקות לקלות יותר לביצוע.
- מוציאים בעל חיים אחד ומניחים אותו ברתמה (או צינור בז עם קצה מנותק) כדי לרסן את החיה במהלך ההזרקה.
- לנקות את אתר ההזרקה באמצעות כרית אלכוהול, ולאפשר את האלכוהול להתאדות. זה לא רק מנקה את האתר, אלא גם מאריך עוד יותר את וריד הזנב.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד במחט 27.5 מד, בעדינות להזריק את העכבר עם 200 μl של התרבות הרצויה לתוך וריד הזנב.
- השתמש גזה כדי לעצור כל דימום שעלול להתרחש כתוצאה של הזריקה, ומניחים את החיה בכלוב טרי.
- חזור על תהליך זה עבור בעלי החיים והזנים הנותרים. הקפד לתייג כל כלוב של בעלי חיים עם המתח שהם קיבלו.
- בדוק את בעלי החיים מדי יום, הסרה והקרבה של כל בעלי חיים שנראים חולים. אם אין בעלי חיים להפגין סימנים של מחלה, לאפשר את הזיהומים להמשיך במשך 72 שעות לפני להקריב את כל בעלי החיים.
- כדי להקריב, להשתמש CO2 הרדמה ממקור בבקבוקים עד כל הנשימה הפסיקו, ולאחר מכן להשתמש נקע צוואר הרחם על מנת להבטיח כי החיה מתה.
- לאחר ההקרבה, להעביר את החיות למכסה המנוע של תרבית רקמה לניתוח.
- באמצעות בלוק ניתוח, להצמיד כל רגל של החיה עם מחטים מד גדול לרסס את החיה עם 70% אתנול עד שהוא רווי.
- חותכים את העור של הבטן ואת בית החזה בחזרה באמצעות חתך בצורת Y המשתרע מן הנרתיק נפתח עד תהליך xiphoid, התקדמות ואז עד האקסילה של כל זרוע.
- משוך בחזרה את העור ולהסיר את המחטים מכל רגל כדי להחזיק את הניתוח פתוח.
- חותכים בעדינות דרך הצפק, חושפים את המעיים, הקיבה, הכבד והטחול.
- על ידי חיתוך הראשון את וריד הכבד ואת הרצועה coronal בחלק העליון של הכבד, להתחיל להסיר את הכבד. רצועות נוספות שיש להסיר נמצאות מתחת לכבד, המחבר אותו לחלק הראשון של המעי הדק, כמו גם את השרירים של הגב.
- מניחים את הכבד ב 5 מ"ל של ddH סטרילי20 בצינור בז 50 מ"ל.
- לאחר מכן, להסיר את הטחול על ידי בידודו בעדינות לחתוך את כלי הדם ואת הרצועות. הטחול יוסר בקלות רבה יותר מהכבד. מניחים את הטחול בצינור בז נפרד המכיל 5 מ"ל ddH סטרילי20.
- לאתר את הסרעפת לחתוך בעדינות לאורך בית החזה על מנת לדמיין את בית החזה. חותכים דרך תהליך xiphoid ועצם החזה לרמה של הצוואר כדי לפתוח את בית החזה, חושף את הלב והריאות.
- באמצעות מלקחיים, לתפוס את הלב בעדינות על ידי פסגתו, ולהרים אותו כך כאבי העורקים וכלי ריאות נמצאים במתח. חותכים את הכלים האלה כדי לשחרר את הלב.
- מניחים את הלב לתוך צינור בז 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של ddH סטרילי20.
- השלך את פגר העכבר, וחזור על תהליך זה עבור כל בעל חיים, באמצעות צינורות בז נקי המכיל 5 מיליליטר ddH סטרילי20 עבור כל איבר הוסר.
- לאחר שכל האיברים הוסרו, לנקות את תחנת העבודה ולחזור לספסל.
- הכן קבוצה של 5 צינורות שישמשו לניקוי ועיקור ההומוגניזר עבור כל קבוצה של איברים מחמישה עכברים(כלומר צינור אחד 5 מוגדר עבור 5 כבדים, 5 צינורות עבור 5 טחולים, ו 5 צינורות עבור 5 לבבות). ארבעה מכל אחד מהצינורות צריך להיות מלא עם 30 מיליליטר ddH סטרילי2 0,ואחד צריך להיות מלא עם 30 מיליליטר 90% EtOH.
- באמצעות TissueMaster (או homogenizer שווה ערך), לטבול את homogenizer (תוך כדי ריצה) לתוך הצינורות שהוכנו בשלב 7.21 כדלקמן כדי לנקות את החללית:
- צינור 1 (ddH2O)
5 שניות ברכבת התחתית 2 (ddH2O)
5 שניות ברכבת התחתית 3 (EtOH)
5 שניות ברכבת התחתית 4 (ddH2O)
5 שניות ברכבת התחתית 5 (ddH2O) - הומוגניזציה כבד אחד באמצעות homogenizer לפחות 2 דקות, או עד שלא חלקים גלויים של איבר להישאר. השתמש בפינצטה כדי להסיר פסולת גדולה מהגשוש.
- חזור על תהליך הניקוי המתואר בשלב 7.22
- חזור על תהליך הומוגניזציה עבור הכבדים האחרים, הקפד לשטוף את הבדיקה בין כל כבד באמצעות התהליך המתואר בשלב 7.22.
- לאחר כל הכבדים הם הומוגניים לחלוטין, להשליך את צינורות לשטוף (1-5) עבור הכבד.
- חזור על תהליך הומוגניזציה / נקי עבור הטחול והלבבות גם כן, הקפד להשתמש קבוצה חדשה של צינורות לשטוף עבור כל סדרה של איברים. אם בשלב כלשהו צינורות הכביסה הופכים עכורים, להשליך אותם ולהחליף עם צינורות חדשים כדי לסיים את הסדרה.
- לאחר כל האיברים כבר הומוגניזציה, לעשות מחזור ניקוי אחד אחרון על homogenizer ולייבש אותו היטב לאחסון.
- מניחים כ 200 μl של כל איבר לתוך באר בודדת של צלחת 96-well.
- בצע דילול סדרתי על דגימות האיברים על ידי דילול 1:10 בסדרה עד 1:10,000 דילול (כבד טחול) או עד 1:1,000 דילול (לב).
- צלחת ספוט סדרת דילול על אגר LB מחומם מראש. כמו כן להסיר 20 ul של כל איבר לא מדולל צלחת על לוחות אגר LB נפרדים על מנת למנות את CFU מאיברים קולוניאליים גרועים.
- השליכו את צינורות הבז המכילים את האיברים ההומוגנית, ועטפו את הלוחות של 96 הבאר המכילים את סדרת הדילול בפרפילם והניחו אותה בקופסת מקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
- אפשר לכתמים להתייבש. תהליך זה מואצת על ידי הנחת הצלחות במכסה המנוע והסרת העפעפיים.
- לאחר הכתמים התייבשו, מניחים את הצלחות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה.
- לספור את מספר המושבות בכל נקודה למחרת בבוקר ולהשתמש בסדרת הדילול כדי לחשב את המספר הכולל של חיידקים לכל איבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבודדים נבחרים של L. monocytogenes להפגין פלישה משופרת של תאי לב בתרבית התא במודלים העכבר של זיהום. איור 1 מציג דוגמה לאופן שבו מושבות חיידקים עשויות להופיע בעקבות ציפוי נקודתי של השעיות במדיית אגר. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של CFUs בתוך מדגם מבלי להשתמש במספר גדול של לוחות מדיה אגר. איור 2 מציג דוגמה לתרבית רקמה המבוססת על מבחנים המשווים את היכולת של Strain 10403S לפלוש לתאי לב עם היכולת של זן 07PF0776. יותר מפי שניים 07PF0776 CFU חיידקי ניתן לשחזר מתאי לב נגועים H9c2 בעקבות טיפול גנטמיצין בהשוואה לתאים נגועים 10403S. הבדלים של 2 עד 4-פי נצפו באופן שגרתי עבור זנים קרדיוטרופיים באמצעות בדיקה זו. איור 3 מראה דוגמה להתאוששות של חיידקים מהכבדים, הטחולים והלבבות של עכברים נגועים בגיל 3 ימים לאחר ההדבקה. זיהום של עכברים עם זן cardiotropic 07PF0776 או זן 10403S תוצאות במספרים דומים של חיידקים התאושש הכבדים טחולים של עכברים נגועים, אולם עכברים נגועים 07PF0776 נוטים יותר להניב מספרים לזיהוי של חיידקים מהלב ולהפגין נטל חיידקי גדול יותר באיבר זה.
איור 1: דוגמה לטכניקת ציפוי ספוט לקביעת יחידות CFUs חיידקיות. תאי H9c2 שגדלו על כיסויי זכוכית ונדבקו במונוציטוגנים L. היו lysed והמתלים היו מדוללים באופן סדרתי באמצעות 1:10 דילול עד 1:1,000 דילול (פאנל שמאלי). צינור רב ערוצי שימש צינור 10 ul מכל באר ישירות על צלחת אגר LB, ואת הצלחת היה דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס (לוח ימני). מספר החיידקים לכל כיסוי מוערכים על ידי ספירת CFU חיידקי הקשורים לדילול המתאים.
איור 2: L. monocytogenes זן 07PF0776 תערוכות פלישה משופרת של תאי לב בתרבית הרקמות. מבחני פלישה בוצעו בתאי H9c2 באמצעות MOI = 100. גרף מתאר את המספרים הממוצעים של CFUs חיידקי תאיים התאושש +/- SE מתאים נגועים 10403S (שחור) לעומת זן קרדיוטרופי 07PF0776 (כחול). ** מציין משמעות של p <0.01.
איור 3: L. monocytogenes זן 07PF0776 תערוכות פלישה משופרת של הלב במודלים זיהום עכבר. בעלי חיים חוסנו עם 10,000 CFU דרך וריד הזנב. זיהומים הורשו להתקדם במשך 72 שעות, ובשלב זה בעלי החיים הוקרבו והכבדים, הטחולים והלבבות נאספו ומעובדים כדי לקבוע CFU חיידקי לכל איבר. עיגולים מלאים מייצגים את ה- CFU המתקבל מעכברים בודדים, כאשר הערך הממוצע עבור כל בעלי החיים בקבוצה מצוין על-ידי קו +/- SE. ערכי האחוזים מציינים את מספר בעלי החיים המכילים CFU חיידקי הניתן לגילוי בתוך הלב. * מציין משמעות של p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L. מונוציטוגנים הוא פתוגן אנושי נפוץ ומאופיין היטב, המסוגל לגרום למספר ביטויי מחלה שונים15. החיידק תואר בעבר בשל יכולתו לעבור בין מחסומים, כגון מחסום הדם - מוח ומחסומי שליה-עובר, על מנת להגיע וליישב את מערכת העצבים המרכזית ואת העובר המתפתח, בהתאמה. היכולת in vivo של האורגניזם ליישב רקמות אלה הוא השלים לעתים קרובות על ידי יכולת במבחנה לפלוש לתאים המייצגים בתרבות המרכיבים את האיברים ממוקדים. לדוגמה, פלישה של תאי אפיתל מקלעת choroid קושרה עם היכולת של האורגניזם ליישב את מערכת העצבים המרכזית16; ו explants trophoblast villous שימשו כדי לייצג את מחסום אימהי-עוברי17. בפרוטוקול זה תוארו שיטות שימושיות להערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות, כמו גם להשוואת קולוניזציה חיידקית של הלב עבור מבודדים בודדים ביחס לקולוניזציה של הכבד והטחול.
פרוטוקול זה מכיל מספר צעדים קריטיים, אך בין הקריטיים ביותר הם אלה הכרוכים בשימוש ב- CFU החיידקי הנכון לזיהום של תאי תרבית רקמות הגדלים על כיסויים או זיהום של בעלי חיים. אם מספר CFU חיידקי אינו נשלט כראוי בין בארות שונות ובעלי חיים אז השוואות ישירות בין דגימות לא ניתן לבצע. חשוב לבדוק שוב את סדרת הדילול המשמשת ליצירת האינוקולה על ידי ציפוי ישיר של הדילול הסופי על לוחות מדיה על מנת להבטיח כי מספר CFU חיידקי הוערך במדויק.
תאי H9c2 המשמשים מבחנים אלה נגזרים מהמחצית התחתונה של לב עכברוש עוברי 13 יום שכלל בעיקר רקמה חדרית18. התאים להפיץ כמו מיובלסטים mononucleated ועל הגעה מפגש צלושי תרבית רקמות או מנות מתחילים ליצור מבנים צינוריים רב נוקדי. התאים יש זמן הדור של כ 30 שעות18. הרעבה בסרום של תאי H9c2 קושרה עם בידול של התאים לתאי שריר השלד, ואילו טיפול של myoblasts עם 10 nMכל- חומצה רטינואית טרנס נקשר עם בידול מיובלסט לתוך מיוציטים לב14. פרוטוקול זה התמקד L. monocytogenes הפלישה לתאים myoblast, אולם קו התא H9c2 הוא קו תאים רב תכליתי שיכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של בידול תאים מבוקר על פלישת חיידקים.
זן L. monocytogenes 07PF0776 היה מבודד במקור מחולה נגוע ב- HIV שהיה לו מעצר א-סיסטולי שאינו ניתן לחידוש עקב זיהום פולשני L. monocytogenes של הלב8. ניתוח מאוחר יותר של זן זה במודלים של זיהום עכבר הצביע על כך שיש לו יכולת משופרת למקד ולפלוש לרקמת לב. ניתוח מוגבל של מבודדים אקראיים נוספים של L. monocytogenes עולה כי תת אוכלוסיות של מבודדים חיידקיים מסוגלים להדביק את ליבם של עכברים בהיעדר כל נזק קודם רקמת לב או שסתומי לב8. מעניין, שניים מזני L. monocytogenes המאופיינים הטובים ביותר, 10403S ו- EGD, נמצאו כמתיישבים עניים של תאי לב ורקמות. רצף הגנום של מבודד 07PF0776 לא חשף את נוכחותם של איים פתוגניים חדשניים או סיפק ראיות לאשכולות גנים ייחודיים19; זה מרמז כי 07PF0776 מטרות תאי לב לפלישה באמצעות שינוי של הארסנל הקיים שלה של מוצרי גנים ארסית. ניתוח היסטוכימי ראשוני מציין כי 07PF0776 יוצר מורסות בתוך לבבות עכבר נגועים שנראים דומים למורסה שנצפתה בחולה האנושי הנגוע המקורי (נתונים לא מוצגים). אם אחרים קרדיוטרופי L. monocytogenes מבודד לגרום היווצרות מורסה לב דומה נשאר להיקבע.
הבדיקות המוצגות כאן ניתן לשנות בקלות כדי להקל על הבדיקה של היבטים שונים של זיהום. coverslips בודדים ניתן לתקן מוכתם עבור מיקרוסקופיה אור או פלואורסצנטי מבוסס, זמני הדגירה של תרבית הרקמה ניתן להגדיל למדידה והשוואה של חיידקים קצבי צמיחה תאיים, רקמות ואיברים יכול להיות מוטבע פרפין ומעובד לבדיקה מיקרוסקופית כדי לבחון היווצרות מורסה והפצה חיידקית ברמה התאית. בעת הערכת רמות של פלישת חיידקים של תאי תרבות רקמות או קולוניזציה של רקמות מארחות, יש מגבלות במונחים של הכמות המינימלית של חיידקים כל מבחנה יכולה לזהות. במבחנה מבחני פלישה יש גבול נמוך יותר של גילוי של כ 300 CFU לכל כיסוי. התאמת נפח המים המשמשים מערבולת coverslips עשוי לשפר את הגילוי של מספרים נמוכים של חיידקים, עם נפחי תמוגה התא נמוך כמו 500 μl להוכיח שימושי כדי לזהות זנים פולשניים גרוע. Coverslips עשוי להיות טבול לזמן קצר במים סטריליים כדי להסיר ג'נמיסין עודף לפני תמוגה של תאים מארחים בכמויות קטנות יותר. רמות נפח של עד 5 מ"ל או יותר ניתן להשתמש כדי למנות כראוי זנים פולשניים מאוד. בבעלי החיים, הומוגנטים איברים יכולים להיווצר בכמויות של 5 מיליליטר או 10 מ"ל של ddH20, עם כמויות נמוכות יותר להיות שימושי כדי לזהות רמות נמוכות יותר של חיידקים, כמויות גבוהות יותר כדי למנות טוב יותר איברים קולוניאליים בכבדות. טווח הגילוי המינימלי עבור איברים נגועים הוא כ 100 CFU. אם האיברים מתיישבים באופן עקבי ברמות גבוהות, שקול להשתמש בנפח גדול יותר של מים (10 מ"ל) ולבצע דילולים נוספים בתוך צלחת 96-well.
השיטות המתוארות ניתן ליישם על איברים ורקמות מחוץ ללב. מבחני פלישה וזיהומים בעכבר כגון אלה שימשו להערכת קולוניזציה בשלל אתרים, כולל השליה, המוח, כיס המרה, הכבד והמעי. שינויים בפרוטוקולים המתוארים לעיל יכולים להתבצע גם על מנת להתאים זנים hyperinvasive ו / או hypervirulent, והחלפת תאי לב עם סוגי תאים אחרים ניתן לעשות כדי להעריך פנוטיפים פלישה באתרים מחוץ למערכת הלב וכלי הדם. מאז סוגי תאים שונים שינו את הרגישות לפלישה L. monocytogenes, התאמת פרמטרים כגון MOI ואת זמני הדגירה עשוי להיות נחוץ על מנת לשחזר במדויק נתונים מן assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור מעניק AI41816 ו AI099339 (N.E.F.) ועל ידי F31AI094886-01 (P.D.M.) מ NIAID. התכנים הם באחריות המחברים בלבד ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של מקורות המימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2 kg of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12 mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14 ml Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75 cm2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
