Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Summary

Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur. Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir. Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Listeria monocytogenes, immün sistemi baskılanmış hastalarda, yaşlılarda ve hamile kadınlarda ciddi invaziv enfeksiyonlara neden olabilecek gram pozitif bir fakülte içi patojendir. İnsanlarda listeriosis'in en yaygın belirtileri menenjit, ensefalit ve fetal kürtajdır. İnvaziv L. monocytogenes enfeksiyonunun önemli ama çok daha az belgelenmiş bir sekel kalbi içerir. Kardiyak hastalıktan ölüm oranı tedaviye rağmen% 35'e kadar olabilir, ancak L. monocytogenes kardiyak dokunun kolonizasyonu ve bunun sonucunda ortaya çıkan patolojileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek olarak, son zamanlarda L. monocytogenes'in subpopulasyonlarının kalp dokusu içinde istila etme ve büyüme kapasitesine sahip olduğu ortaya çıktı. Bu protokol, L. monocytogenes izolatlarının kardiyotropizmini değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar. Doku kültüründe H9c2 sıçan kardiyak miyoblastların enfeksiyonu ve enfekte farelerin kalplerinin bakteriyel kolonizasyonunun belirlenmesi için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda kalp hücresi istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojislerindeki değişiklikleri yönlendirmeye yarayan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanmasını da kolaylaştırabilir. Bu yöntemler ayrıca birden fazla L. monocytogenes suşu arasında kardiyotropizmin doğrudan karşılaştırılmasına da neden olabilir.

Introduction

Listeria monocytogenes, yaşlılar, hamile kadınlar, HIV/ AIDS'li kişiler ve kemoterapi alan kişiler de dahil olmak üzere duyarlı popülasyonlarda ağır hastalığa neden olabilecek gram-pozitif hücre içi patojendir^1. Bu popülasyonlardaki enfeksiyon sıklıkla kontamine gıda ürünlerinin yutulması sonucu ortaya çıkan bir şeydir ve çoğu enfeksiyon büyük ölçekli gıda kaynaklı salgınlarla ilişkilidir^2,3. İnsanlarda ve diğer memelilerde, L. monocytogenes ince bağırsağın epitel sınırından geçiş yapabilir ve daha sonra karaciğere taşınabilir^4,5. Hayvan modelleri, yutulan bakterilerin bağırsak villi içinde çoğaldığını ve portal damardan karaciğere geçtiğini veya mezenterik lenf düğümleri aracılığıyla kan akışına yayıldığını, karaciğere hematojen yayılmasına yol açarak^6,7dalağı olduğunu göstermektedir. Karaciğer ve dalakta, bakteri hem profesyonel fagositlere hem de yerleşik parenkimal hücrelere alıma aracılık edebilir ve bu organlarda hızla enfeksiyonlar oluşturur. Bakteri yükü arttıkça, çok sayıda bakteri kana geri dağılır ve burada merkezi sinir sistemi ve plasenta (varsa) dahil olmak üzere hassas dokuları daha fazla kolonileştirebilir. Bu bölgelerin kolonizasyonu, menenjit, ensefalit ve fetal kürtaj dahil olmak üzere insanlarda listeriosis'in en yaygın belirtilerini önler².

L. monocytogenes'in seçilmiş alt nüfuslarının son zamanlarda kardiyak doku içinde istila etme ve çoğaltma kapasitesi gelişmiş olduğu gösterilmiştir⁸. Kalp tutulumunun belirtileri çeşitlidir ve endokardit ve perikarditten iletim anormallikleri^9-13ile tamamlanan fulminant miyokarditlere kadar değişir. Yılda L. monocytogenes kardiyak olguların genel sayısı düşüktür, ancak enfeksiyonun bu yönü genellikle iyi tanınmadığı için tahmin edilebilir. Kalbin patojenler tarafından kolonizasyonu genellikle önceden var olan valvüler hasar veya yapay kalp kapakçıkları gibi konak yatkınlıkları gerektirir. Bununla birlikte, herhangi bir kardiyak hasar ve / veya anormallik yokluğunda enfekte hayvanların kalplerini kolonileştirme kapasiteleri ile dikkat çeken L. monocytogenes izoleleri vardır⁸.

Burada, canlı hayvan enfeksiyonlarının yanı sıra doku kültüründe istila tahlilleri kullanılarak enfekte hayvanlar içindeki kardiyak dokunun bakteriyel kolonizasyonunu değerlendirmek için in vitro ve in vivo yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için değil, aynı zamanda kardiyak hücre istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojisinde değişikliklere neden olan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanması için de yararlı olmalıdır. Bu yöntemler kardiyotropinin birden fazla suş arasında karşılaştırılmasına kolaylaşır. Burada açıklanan yöntemler için L. monocytogenes 10403S kardiyotropik olmayan bir suşun iyi çalışılmış bir temsilcisi olarak, klinik izolat 07PF0776 ise kardiyotropik bir suşun temsili bir örneği olarak kullanılmaktadır. Bu iki suş, in vitro kardiyak hücrelerin bakteriyel istilası ve enfekte farelerin kalplerinin kolonizasyonu için bir karşılaştırma sağlamak için seçildi vivo. İzole 07PF0776, HIV+ hastasında ölümcül aritmiye neden olan bir müdahale apsesinden kurtarılan klinik bir^{izoledir 8}. L. monocytogenes izolatları virülans potansiyellerinde değişebilir ve Listeria'nın bağışıklık baskılayıcı ve hamile kadınları enfekte etme eğilimi göz önüne alındığında, bu popülasyonlardaki kişiler farklı klinik izolatları değerlendirirken dikkatli olmalıdır.

Protocol

1. L. monocytogenes Suşları için Depolama ve Kültür Koşulları

1. Beyin-kalp infüzyon agarını (BHI) otoklayarak ve erimiş ortamı petri plakalarına dökerek katı ortam hazırlayın. Plakaların oda sıcaklığında gece kurumasını bekleyin, sonra 37 °C'de tekrar geceleme.
2. Steril bir döngü kullanarak, daha önce yapılmış dondurucu stoklarından (BHI sıvı ortamlarında% 20 gliserolde askıya alınan bakteriler, -80 ° C'de depolanan) veya daha önce izolasyon için vurulan kolonileri içeren bir agar plakasından küçük bir L. monocytogenes örneği alın.
3. Aseptik tekniği kullanarak, tek koloni izolasyonu için örneği çizgiye çekin. Fazla taşımayı önlemek ve değerlendirilen türün bireysel kolonilerinin izolasyonunu sağlamak için çapraz çizgiler arasındaki döngüyü sterilize etmeyi unutmayın. Plakaları 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
4. Steril bir döngü kullanarak, izole bir koloniyi çıkarın ve 14 ml polistiren tüpte 2 ml BHI suyu (agarsız) aşılanın.
5. Tahliller ve enfeksiyonlar için, et suyu kültürünü statik olarak (titremeden) bir gecede 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın. Kültürlü izolatların stoklanması için, et suyu kültürünü 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve bir gecede 180-200 rpm'de sallanın. Kültürler, %20'lik son konsantrasyona gliserol eklenerek ve kapalı tüpler -80 °C'de süresiz olarak depolanarak stoklanabilir.

2. H9c2 Kardiyak Miyoblast Benzeri Hücrelerin Depolanmasını ve Kültleme Koşullarının

1. Yüksek glikoz ve piruvat içeren Dubelco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM), Fetal Sığır Serumu (FBS), L-glutamin (Glut) ve Penisilin-Streptomisin-Glutamin karışımları (PSG) içeren dondurulmuş bir H9c2 hücresi stoku satın alın veya elde edin.  FBS, Glut ve PSG -20 °C'de stoklanmalı, DMEM ise 4 °C'de saklanabilir. Donmadan önce 50 ml konik tüplere FBS'yi aliquot etmek yararlıdır.
2. Laminer akış başlığında, iki aliquots FBS çözün. Bir 500 ml'lik DMEM şişesine bir aliquot ekleyin ve% 10 FBS / DMEM karışımı yaptı. Buna, 6 ml Glut ekleyin ve elde eden çözeltiyi 4 ° C'de stokleyin. Bu çözüm "Antibiyotiksiz DMEM" olarak etiketlenebilir. (DMEM –Ab)
3. İkinci bir 500 ml DMEM şişesine, diğer 50 ml'lik FBS aliquot'unu ekleyin. Bu çözüme 6 ml PSG ekleyin ve 4 °C'de stokleyin. Bu çözüm "Antibiyotikli DMEM" olarak etiketlenebilir. (DMEM +Ab)
4. Laminar davlumbazdayken, 10 ml DMEM + Ab çıkarın ve 25 ml'lik bir doku kültürü şişesine yerleştirin.
5. Şişeyi laminar kaputta bırakarak, H9c2 hücrelerinin donmuş bir aliquotunu sıvı nitrojende depodan çıkarın ve kültür çözülene kadar tüpü hızla 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
6. Tüpü sterilize etmek için% 70 etanol ile püskürtün, sonra kaputa geri dönün. Konsantre DMSO'daki hücre süresini en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışarak, hücrelerin tam aliquot'unu 10 ml DMEM +Ab'ye ekleyin.  Bu, DMSO'yu gece hücre canlılığı ve yapışması için yeterince seyreltiyor.
7. Şişeyi bir gecede 37 °C, %5 C0₂ve %95 nemde bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
8. Ertesi sabah, yapışma sağlamak için hücre katmanını kontrol edin. Hücreler muhtemelen bu zamana kadar% 80-100 birleştiği zaman olacaktır.
9. Doku kültürü davlumbazında, vakumu kullanarak şişenin içindeki ortamı çıkarın ve sadece şişenin içindeki hücreleri bırakın.
10. Hücrelere yaklaşık 2 ml% 0.25 Trypsin-EDTA ekleyin ve yaklaşık 3 saniye boyunca hafifçe sallayın.
11. Şişeyi, tripsin çözeltisinin artık monolayer ile temas halinde olmayacak şekilde ters çevirin ve tripini vakumla çıkarın.
12. Hücrelere ikinci bir 2 ml'lik tripin aliquot ekleyin ve şişeyi ters bir mikroskop haline getirin. Monolayer'ın dağılmasını sağlamak için şişeyi hafifçe sallarken hücreleri gözlemleyin.
13. Monolayer dağıldıktan sonra, hemen doku kültürü başlığına dönün ve hücre süspansiyonuna 4 ml DMEM + Ab ekleyin.
14. Hücre süspansiyonunun 2 ml'lik bir kısmını çıkarın ve 23 ml DMEM +Ab içeren 50 ml'lik bir doku kültürü şişesine ekleyin, şişeyi hafifçe sallayın, ardından adım 2.5'te listelenen koşullarda doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
15. Hücreleri yaklaşık% 80 izdihama ulaşana kadar günlük olarak kontrol edin (ml başına yaklaşık 2.0-4.0 x^{10 5} hücre). Hücrelerin çok birleştiği bir hale gelmemesi çok önemlidir, çünkü uzun süre FBS aç kaldığında iskelet kası miyotütlerine dönüşebilirler¹⁴ ve bu farklılaşma bakteri istilasını değiştirebilir.  Hücreleri dikkatlice izleyin ve bir kültür birleşirse yeni bir hücre tüpüyle başlayın.
16. Hücreler% 80 izdihama ulaştığında, ya az önce açıklandığı gibi başka bir 50 ml şişeye geçiş yapabilir ya da istila tahlili için hazırlanabilir.

3. H9c2 Hücrelerini İstila Testine Hazırlama

1. Doku kültürü davlumbazında, vakum aspirasyonu kullanarak% 80 izdihama ulaşan 50 ml'lik bir H9c2 hücresi şişesinden ortamı çıkarın.
2. Monolayer'a 4 ml%0,25 Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve vakum aspirasyon kullanarak hemen çıkarın.
3. Şişeye % 0,25 Trypsin-EDTA'nın 4 ml'lik bir kısmını daha ekleyin ve tek katmanlının dağılımını gözlemlemek için şişeyi ters bir mikroskop uzamaya taşıyın.
4. Hücreler dağıldıktan sonra, kaputa geri dönün ve hücrelere 4 ml DMEM - Ab ekleyin. Çözeltinin yukarı ve aşağı boruya alınması, hücrelerin şişenin altından tamamen çıkarılmasını sağlar.
5. Monolayerin yeniden ıslanılmasından sonra, tüm süspansiyonu çıkarın ve 50 ml konik bir tüpe yerleştirin.
6. Bu süspansiyonun 20 ul'luk bir kısmını çıkarın ve hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını sayın.
7. Çözeltideki hücrelerin konsantrasyonu belirlendikten sonra, taze DMEM –Ab'ye uygun hücre çözeltisi hacmini ekleyerek konsantrasyonu^2,25 x 10 4 hücre/ml'ye ayarlayın. Ayarlanan çözeltinin toplam hacmi 25 ml olmalıdır.
8. Kaputtayken, cam kapakları% 90 Etanol'a batırarak ve her kapak kapağını bir alevden kısa bir süre geçirerek sterilize edin. Her kapak elini sterilize edildikten hemen sonra 24 kuyulu doku kültürü tedavi edilmiş bir plakanın tek bir kuyusuna ekleyin.
9. Tüm kuyular ayrı bir kapak ucuna sahip olduktan sonra, plakadaki kuyuların her birine 1 ml seyreltilmiş hücre çözeltisi eklemek için 25 ml'lik bir pipet kullanın ve her kapak kapağını steril bir iğne ile aşağı itin.
10. Her kuyuda benzer miktarda hücre olduğundan emin olmak için ters bir mikroskop kullanarak her kuyuya bakın. 24 kuyu plakasını bir gecede %5 CO₂ ve %95 nemde 37 °C'de doku kültürü inkübatörüne koyun.
11. Ertesi sabah, kapakların benzer miktarda yapışan mioblastlara sahip olduğundan ve kapakların kuyuda yüzmediğinden emin olmak için her birini iyi görüntüleyin.

4. İstila Testlerine L. monocytogenes Suşlarının Hazırlanması

NOT: Tüm laboratuvar çalışmaları CDC Biyogüvenlik Seviye 2 yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir.

1. 24 kuyulu plakayı test için hazırladıktan sonra, bakteri istilası açısından incelenecek suşların tek kolonilerini çıkarmak ve her birini 2 ml BHI suyu içeren 14 ml'lik tek tek tüplere aşılamak için sterilize edilmiş bir döngü kullanın.
2. Aşılanmış tüpleri 45 ° 'de eğik 37 ° C inkübatöre yerleştirin ve statik olarak (titremeden) bir gecede kuluçkaya yatırın.
3. Ertesi sabah, bakterilerin düzgün süspansiyonundan emin olmak için kültür tüpünü inkübatörden ve girdaptan kısa bir süre çıkarın.
4. 600 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu ölçün. Optik yoğunluğu okumadan önce steril BHI suyu kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayın.
5. L. monocytogenesiçin optik yoğunluk, ml başına 1.000 = 1.0 x 10⁹ CFU yoğunluğu olacak şekilde ml başına bakteri konsantrasyonu ile doğrudan ilgilidir.
6. 2,25 x 10⁴ hücreye 2,25 x 10⁶ (MOI = 100) bulaştırmak için gereken kültür miktarını hesaplayın.
7. Gereken kültür miktarını çıkarın ve 1,5 ml santrifüj tüpüne yerleştirin.
8. Kültürü 3 dakika boyunca 19.000 x g'da döndürün, ardından üst yapıyı atın. Tüpün dudağına yapışan fazla medyayı çıkarmak için tüpün açık ucuna bir kağıt havluya dokunun.
9. Bakterileri 1 ml steril PBS ve girdapta yeniden depolayarak yeterli karıştırmayı sağlayın. Bu karışım 20 ul başına yaklaşık 2,25 x^{10 6} CFU (1,125 x 10⁸ CFU/ml) içermelidir.

5. İstila TahliliNin Gerçekleştirilmesi

1. İstila testinden bir gün önce, Bölüm 3'te açıklandığı gibi 24 kuyulu H9c2 hücre plakaları hazırlayın ve ayrıca Bölüm 4'te açıklandığı gibi Listeria'nın istenen suşu ile steril BHI suyunu aşılayın.
2. Bölüm 4'teki protokolü kullanarak, istila için değerlendirilecek suşların PBS ile yeniden sulanan kültürlerini hazırlayın. Not: Enfeksiyöz titre bu noktada, her numunenin seyreltmelerinin katı ortamlara kaplanması ve gece kuluçkadan sonra kolonilerin numaralandırılması ile değerlendirilebilir.
3. PBS-bakteri çözeltisinin en az 20 ul'ını 24 kuyu plakasının bireysel kuyularına yükleyin. Üç taraflı sonuç elde etmek için her suş için en az üç ayrı kuyuya ihtiyaç duyulduğunu, bu nedenle 8'e kadar suşun birlikte değerlendirilebileceğini unutmayın.
4. Kuyuları bakterilerle yükledikten sonra, kuyu içindeki her numunenin homojen yayılmasını teşvik etmek için plakayı hafifçe sallayın ve 24 kuyu plakasını 37 ° C'de 45 dakika kuluçka ve% 95 nem için inkübatöre geri yerleştirin, % 5 CO₂ile .
5. Bu inkübasyon sırasında, sadece 25 ml DMEM – Ab çıkararak ve 50 ml'lik bir şahin tüpüne (veya eşdeğeri) yerleştirerek bir DMEM - Ab (Bölüm 2) aliquot hazırlayın.
6. Gentamisin 25 ml DMEM -Ab aliquot'a 15 ug/ml konsantrasyona (50 mg/ml stok çözeltisinin 7,5 ul'u) ekleyin. DMEM –Ab +Gent çözeltisini 45 dk kuluçka süresi boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
7. Aliquot 25 ml PBS'yi 50 ml'lik bir şahin tüpüne yerleştirin ve 45 dk kuluçka sırasında 37 °C su banyosuna yerleştirin.
8. 45 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, 24 kuyu plakasını çıkarın ve kaputun içine yerleştirin. Vakum aspirasyonu ile her kuyudan bakteri içeren ortamı çıkarın, farklı suşlar arasında cam pipet uçlarını değiştirin.
9. Hücrelerin yüzeyinden gevşek yapışan bakterileri yıkamak için her kuyuya yaklaşık 1 ml PBS ekleyin, ardından vakum aspirasyon kullanarak PBS'yi çıkarın.
10. PBS'nin tamamen kaldırılmasını takiben, her kuyuya 1 ml DMEM –Ab +Gent ekleyin. Gentamisin sadece hücrelerin dışında kalan bakterileri öldürür, böylece hücre içi olanlar canlı kalır.
11. 24 kuyu plakasını tekrar inkübatöre yerleştirin ve bir saat daha kuluçkaya yatmaya bırakın.
12. Bir saat süren kuluçka sırasında, her tüpe 1 ml steril ddH_{2 0}ekleyerek 14 ml polipropilen tüpler hazırlayın. Her kapak için bir tüp gerekecektir, bu nedenle bir 24 kuyu plakası için toplam 24 tüp hazırlayın.
13. Bir saat süren kuluçkadan sonra, 24 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve 5.12 adımında hazırlanan tüplerle birlikte kaputun içine yerleştirin.
14. Steril cımbız kullanarak, her bir örtünün içinden çıkarın ve hemen ayrı bir tüpe yerleştirin. Kirlenmeyi önlemek için cımbızları etanol içine batırdığınızdan ve her kapak arasında alevlediğinizi unutmayın.
15. Tüm kapaklar çıkarıldıktan ve ayrı tüplere yerleştirildikten sonra, 24 kuyu plakasını atın.
16. Tezgaha geri dönün ve her tüpü 5-10 saniye boyunca girdapla.
17. Her tüpten bir porsiyon çıkarın ve her numuneyi 96 kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyusuna yerleştirin, ardından 1:10 seyreltme kullanarak 1:1.000 seyreltme kadar her numuneyi seri olarak seyreltin.
18. Önceden ısıtılan ve kuru LB plakaları kullanarak, seyreltme serisinin her birini agar plakalarına nokta plakası koyun. Her numunenin seyreltme serisinden 5-10 μl lekeleri kaplamak için çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
19. Ayrıca sulandırılmamış her kuyudan 20 μl numune çıkarın ve bu miktarı doğrudan LB agar'a seyreltme serisinden ayrı bir plaka üzerinde tespit edin. (Bu büyük hacim, zayıf invaziv suşları numaralandırmak için kullanılabilir).
20. Tüm numuneler nokta kaplaması yapıldıktan sonra, kapak kapaklarını içeren 14 ml'lik tüpleri atın. 96 kuyu plakasını parafilmleyin ve gerekirse yeniden sıçrama için -80 °C'de bir dondurucu kutusuna yerleştirin.
21. Lekelerin tamamen kurumasını bekleyin. Plakaların kaputa yerleştirilmesi ve kapakların çıkarılmasıyla bu işlem büyük ölçüde aceleye getirilir.
22. Lekeler kuruduktan sonra, plakaları gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
23. Ertesi sabah, koloni sayılarının kolayca değerlendirilebileceği seyreltme serisinin her noktasındaki koloni sayısını sayın (yaklaşık 5 ila 50 koloni arasında) (Şekil 1) ve değerlendirilen her suş için kapak kılıfı başına bakteri sayısını hesaplamak için seriyi kullanın.

6. Fare Enfeksiyonları için L. monocytogenes Suşlarının Hazırlanması

1. Enfeksiyondan bir gece önce, istenen suşların tek kolonilerini çıkarmak için sterilize edilmiş bir döngü kullanın ve her birini 2 ml BHI suyu içeren bireysel 14 ml tüplere aşıleyin.
2. Aşılanmış tüpleri 45 ° 'de eğik 37 ° C inkübatöre yerleştirin ve statik olarak (titremeden) bir gecede kuluçkaya yatırın.
3. Ertesi sabah, bakterilerin düzgün bir şekilde askıya alınmasını sağlamak için kültür tüpünü inkübatörden ve girdaptan kısa bir süre çıkarın.
4. 600 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu ölçün. Optik yoğunluğu okumadan önce steril BHI suyu kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayın. (L. monocytogenesiçin optik yoğunluk, ml başına 1.000 = 1.0 x 10⁹ CFU yoğunluğu olacak şekilde ml başına bakteri konsantrasyonu ile doğrudan ilişkilidir)
5. Her hayvanı enfekte etmek için gereken kültür miktarını hesaplayın. Enjeksiyonlar tipik olarak 200 μl PBS içerir ve bireysel bir suşun 10.000 CFU'su bulunur, bu da istenen 5.00 x 10⁴ CFU/ ml konsantrasyona dönüşür.
6. Her son seyreltmeden 5 μl aliquot çıkarın ve doğrudan LB agar üzerine sürün.  Aşılama için kullanılan konsantrasyonu doğrulamak için 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
7. Her CFU süspansiyonu seyreltmenin 1 saat içinde enjekte edin (aşağıya bakın).

7. L. monocytogenes'i Kuyruk Damarı Enjeksiyonu yoluyla Farelere Aşılamak ve Karaciğer, Dalak ve Kalp İçinde Bakteri Yükünü Değerlendirmek

Not: Tüm hayvan çalışmaları CDC Biyogüvenlik Seviye 2 yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir.  Fareler genellikle bir hafta önceden sipariş edilir ve kafes başına 5 hayvanla birlikte kafeslenir. Farelerin enjeksiyondan önce dört gün boyunca yeni laboratuvar ortamına alışmasına izin verilir. Bu deneylerde, bariyer ortamında bir kafese 5'e yerleştirilen ve kısıtlanmamış bir diyetle beslenen 6-8 haftalık dişi swiss-Webster fareleri kullanıldı.

1. Kapağı ve yiyecek / su kutularını çıkararak ve kafesi beş dakika boyunca bir ısı lambasının altına yerleştirerek bir seferde bir fare kafesi hazırlayın. Bu işlem kuyruk damarlarının genişlemesini sağlayarak enjeksiyonların daha kolay gerçekleştirilmasını sağlar.
2. Bir hayvanı çıkarın ve enjeksiyon sırasında hayvanı dizginlemek için bir koşum takımına (veya ucu kesilmiş şahin tüpüne) yerleştirin.
3. Enjeksiyon bölgesini bir alkol pedi kullanarak temizleyin ve alkolün buharlaşmasına izin verin. Bu sadece bölgeyi temizlemekle kalmaz, aynı zamanda kuyruk damarını daha da genişletir.
4. 27,5 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 1 ml şırınga kullanarak, fareyi kuyruk damarına istediğiniz kültürün 200 μl'si ile hafifçe enjekte edin.
5. Enjeksiyon sonucu oluşabilecek kanamaları durdurmak için bir gazlı bez kullanın ve hayvanı taze bir kafese yerleştirin.
6. Kalan hayvanlar ve suşlar için bu işlemi tekrarlayın. Hayvanların her kafesini aldıkları suşla etiketlemeyi unutmayın.
7. Hayvanları günlük olarak kontrol edin, hasta görünen hayvanları çıkarın ve kurban edin.  Hiçbir hayvan hastalık belirtisi göstermiyorsa, tüm hayvanları kurban etmeden önce enfeksiyonların 72 saat boyunca devam etmesine izin verin.
8. Fedakârlık yapmak için, tümpirasyonlar durana kadar şişelenmiş bir kaynaktan CO₂ anestezisi kullanın, ardından hayvanın öldüğünden emin olmak için servikal çıkık kullanın.
9. Kurbandan sonra, hayvanları diseksiyon için bir doku kültürü başlığına taşıyın.
10. Bir diseksiyon bloğu kullanarak, hayvanın her bacağını büyük ölçer iğnelerle sabitlayın ve doyurulana kadar hayvana% 70 etanol püskürtün.
11. Vajinal açıklıktan xiphoid işlemine kadar uzanan ve daha sonra her kolun aksiillasına kadar ilerleyen Y şeklinde bir kesi kullanarak karın ve toraksın derisini geri kesin.
12. Cildi geri çekin ve diseksiyonu açık tutmak için iğneleri her bacaktan çıkarın.
13. Bağırsakları, mideyi, karaciğeri ve dalağını açığa çıkaran peritonun içinden hafifçe kesin.
14. İlk önce karaciğerin üst kısmındaki hepatik damarı ve koronal bağı keserek karaciğeri çıkarmaya başlayın. Çıkarılacak ek bağlar karaciğerin altında bulunur, ince bağırsağın ilk bölümüne ve sırtın kas yapısına bağlanır.
15. Karaciğeri 5 ml steril ddH₂0'a 50 ml'lik bir şahin tüpüne yerleştirin.
16. Daha sonra, dalağını izole ederek çıkarın ve vaskülat ve bağları nazikçe kesin. Dalak karaciğerden daha kolay çıkarılacaktır. Dalağını 5 ml steril ddH_{2 0}içeren ayrı bir şahin tüpüne yerleştirin.
17. Diyaframı bulun ve toraksı görselleştirmek için göğüs kafesi boyunca hafifçe kesin. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için xiphoid işlemini ve sternumu boyun seviyesine kadar kesin.
18. Toksinleri kullanarak, kalbi apeksi tarafından hafifçe tutun ve aort ve pulmoner damarlar gerginlik içinde olacak şekilde kaldırın. Kalbi serbest etmek için bu damarları kesin.
19. Kalbi 5 ml steril ddH₂0 içeren 50 ml'lik bir şahin tüpüne yerleştirin.
20. Fare karkasını atın ve çıkarılan her organ için 5 ml steril ddH_{2 0}içeren temiz şahin tüpleri kullanarak bu işlemi her hayvan için tekrarlayın.
21. Tüm organlar çıkarıldıktan sonra, iş istasyonunu temizleyin ve tezgaha geri dönün.
22. Beş fareden her organ seti için homojenizatörü temizlemek ve sterilize etmek için kullanılacak 5 tüpten oluşan bir set hazırlayın(örneğin, 5 karaciğer için bir 5 tüp seti, 5 dalak için 5 tüp ve 5 kalp için 5 tüp). Tüplerin her biri 30 ml steril ddH_{2 0}ile doldurulmalı ve biri% 30 ml 90 EtOH ile doldurulmalıdır.
23. Bir TissueMaster (veya eşdeğer homojenizatör) kullanarak, homojenizatör (çalışırken) probu temizlemek için aşağıdaki gibi 7.21 adımında hazırlanan tüplere batırın:
24. Tüp 1 (ddH₂O)
    Tüp 2'de 5 sn (ddH₂O)
    Tüp 3'te 5 sn (EtOH)
    Tüp 4'te 5 sn (ddH₂O)
    Tüp 5'te 5 sn (ddH₂O)
25. Homojenizatör kullanarak bir karaciğeri en az 2 dakika veya organın görünür kısımları kalmayana kadar homojenize edin. Sondadaki büyük kalıntıları çıkarmak için cımbız kullanın.
26. 7.22 adımında açıklanan temizleme işlemini yineleyin
27. Diğer karaciğerler için homojenizasyon işlemini tekrarlayın, 7.22 adımında açıklanan işlemi kullanarak probu her karaciğer arasında yıkadığından emin olun.
28. Tüm karaciğerler tamamen homojenleştikten sonra, karaciğer için yıkama tüplerini (1-5) atın.
29. Hem dalak hem de kalpler için homojenize / temiz işlemi tekrarlayın, her bir organ serisi için yeni bir yıkama tüpü seti kullandığınızdan emin olun. Herhangi bir noktada yıkama tüpleri bulanıklaşırsa, bunları atın ve seriyi bitirmek için yeni tüplerle değiştirin.
30. Tüm organlar homojenize edildikten sonra, homojenizatör üzerinde son bir temizleme döngüsü yapın ve depolama için iyi kurutun.
31. Her organın yaklaşık 200 μl'lik kısmını 96 kuyu plakasının tek bir kuyusuna yerleştirin.
32. 1:10.000 seyreltmeye (karaciğer ve dalak) veya 1:1.000 seyreltmeye (kalp) kadar bir seride 1:10 seyrelterek organ örnekleri üzerinde seri seyreltmeler gerçekleştirin.
33. Seyreltme serisini önceden ısıtılmış LB agar üzerine nokta plakası. Ayrıca, CFU'nun kötü kolonize edilmiş organlardan numaralandırılması için her seyreltilmemiş organ ve plakadan 20 ul ayrı LB agar plakalarına çıkarın.
34. Homojenize organları içeren şahin tüplerini atın ve seyreltme serisini içeren 96 kuyu plakasını parafilm ile sarın ve -80 °C'de bir dondurucu kutusuna yerleştirin.
35. Lekelerin kurumasını bekleyin. Plakalar kaputa yerleştirilerek ve kapaklar çıkarılarak bu işlem hızlanır.
36. Lekeler kuruduktan sonra, plakaları gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
37. Ertesi sabah her noktadaki koloni sayısını sayın ve organ başına toplam bakteri sayısını hesaplamak için seyreltme serisini kullanın.

Representative Results

L. monocytogenes'in seçilmiş izolatları, hücre kültüründe ve enfeksiyonun fare modellerinde kardiyak hücrelerin gelişmiş istilası sergiler. Şekil 1, agar ortamlarındaki süspansiyonların nokta kaplamasının ardından bakteri kolonilerinin nasıl görünebileceğine dair bir örnek göstermektedir. Bu yöntem, çok sayıda agar ortam plakası kullanmadan bir örnek içindeki CFO'ların doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Şekil 2, 10403S zorlanmasının kalp hücrelerini istila etme yeteneğini 07PF0776 suşu ile karşılaştıran doku kültürü tabanlı bir tahlil örneği göstermektedir. Gentamisin tedavisini takiben enfekte H9c2 kardiyak hücrelerden 10403S ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla iki katından fazla 07PF0776 bakteriyel CFU kurtarılabilir. Bu test kullanılarak kardiyotropik suşlar için rutin olarak 2 ila 4 kat farklılıklar gözlenir. Şekil 3, enfeksiyon sonrası 3 günde enfekte farelerin karaciğerlerinden, dalaklarından ve kalplerinden bakterilerin iyileşmesine bir örnek göstermektedir. Farelerin kardiyotropik suşu 07PF0776 veya suşu 10403S ile enfeksiyonu, enfekte farelerin karaciğerlerinden ve dalaklarından elde edilen benzer sayıda bakteri ile sonuçlanır, ancak 07PF0776 ile enfekte olan farelerin kalpten tespit edilebilir sayıda bakteri verme ve bu organda daha fazla bakteri yükü sergileme olasılığı daha yüksektir.

Şekil 1: Bakteriyel CFO'ları belirlemek için spot kaplama tekniği örneği. Cam kapaklarda yetişen ve L. monocytogenes ile enfekte olan H9c2 hücreleri lislendi ve süspansiyonlar 1:1.000 seyreltmeye (sol panel) kadar 1:10 seyreltme kullanılarak seri olarak seyreltildi. Her kuyudan 10 ul'u doğrudan lb agar plakasına borulamak için çok kanallı bir pipet kullanıldı ve plaka bir gecede 37 °C'de (sağ panel) inkübe edildi. Kapak sapağı başına bakteri sayısı, uygun seyreltme ile ilişkili bakteriyel CFU sayılarak değerlendirilir.

Şekil 2: L. monocytogenes strain 07PF0776 doku kültüründe kardiyak hücrelerin gelişmiş invazyonunu sergiler. H9c2 hücrelerinde moi = 100 kullanılarak invazyon tahlilleri yapıldı. Grafikte, 10403S (siyah) ile enfekte olmuş hücrelerden kurtarılan hücre içi bakteriyel CFO'ların ortalama sayısı ile kardiyotropik 07PF0776 suşu (mavi) açıklanmıştır. ** p <0.01'in önemini gösterir.

Şekil 3: L. monocytogenes strain 07PF0776 fare enfeksiyonu modellerinde kalbin gelişmiş istilasını sergiler. Hayvana kuyruk damarı üzerinden 10.000 CFU aşılandı. Enfeksiyonların 72 saat boyunca ilerlemesine izin verildi, bu noktada hayvanlar kurban edildi ve organ başına bakteriyel CFU belirlemek için karaciğerler, dalaklar ve kalpler toplandı ve işlendi. Düz daireler, +/- SE çizgisiyle belirtilen bir grup içindeki tüm hayvanlar için ortalama değerle, bireysel farelerden elde edilen CFU'yu temsil eder. Yüzde değerleri, kalp içinde tespit edilebilir bakteriyel CFU içeren hayvanların sayısını gösterir. * p <0.05'in önemini gösterir.

Discussion

L. monocytogenes, bir dizi farklı hastalık tezahürüne neden olabilecek yaygın ve iyi karakterize bir insan patojenidir¹⁵. Bakteri daha önce, sırasıyla merkezi sinir sistemine ve gelişmekte olan fetüse ulaşmak ve kolonileştirmek için kan-beyin bariyeri ve plasental-fetal bariyerler gibi bariyerler arasında geçiş yapabilme yeteneği ile tanımlanmıştır. Organizmanın bu dokuları kolonize etme in vivo yeteneği genellikle hedeflenen organları oluşturan kültürdeki temsili hücreleri istila etmek için bir in vitro yetenek ile tamamlanır. Örneğin, koroid pleksustaki epitel hücrelerinin istilası, organizmanın CNS^16'yıkolonileştirme yeteneği ile ilişkilendirilmiştir; ve villous trophoblast eksplantları maternal-fetal bariyeri temsil etmek için kullanılmıştır¹⁷. Bu protokolde, kültürdeki kalp hücrelerinin bakteriyel istilasını değerlendirmek ve karaciğer ve dalak kolonizasyonuna göre bireysel izoleler için kalbin bakteriyel kolonizasyonunun karşılaştırılması için yararlı olan yöntemler tanımlanmıştır.

Bu protokol bir dizi kritik adım içerir, ancak en kritik olanlar arasında, kapaklarda yetişen doku kültürü hücrelerinin enfeksiyonu veya hayvanların enfeksiyonu için doğru bakteriyel CFU'nun kullanılmasını içerenler vardır. Bakteriyel CFU numarası farklı kuyular ve hayvanlar arasında doğru şekilde kontrol edilmezse, numuneler arasında doğrudan karşılaştırma yapılamaz. Bakteriyel CFU sayısının doğru bir şekilde tahmin edildiğini garanti etmek için, medya plakalarındaki nihai seyreltmelerin doğrudan kaplanmasıyla inocula üretmek için kullanılan seyreltme serisinin iki kez kontrol etmek önemlidir.

Bu testlerde kullanılan H9c2 hücreleri, çoğunlukla ventrikül dokusunu içeren 13 günlük embriyonik sıçan kalbinin alt yarısından türetilmiştir¹⁸. Hücreler mononüklelenmiş mioblastlar olarak yayılır ve doku kültürü şişelerinde veya yemeklerinde izdiah ulaştığında çok fonksiyonlu tübüler yapılar oluşturmaya başlar. Hücrelerin yaklaşık 30 saat¹⁸nesil süresi vardır. H9c2 hücrelerinin serum açlığı, hücrelerin iskelet kas hücrelerine farklılaşması ile ilişkiliyken, mioblastların 10 nMall-trans retinoik asit ile tedavisi miyoblast farklılaşması ile kardiyak miyositlere ilişkilidir¹⁴. Bu protokol L. monocytogenes myoblast hücre invazyona odaklanmıştır, ancak H9c2 hücre hattı kontrollü hücre farklılaşması bakteri istilası üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabilecek çok yönlü bir hücre hattıdır.

L. monocytogenes strain 07PF0776 başlangıçta kalbin invaziv L. monocytogenes enfeksiyonu nedeniyle sürdürülemeyen bir asystolik arrest olan HIV ile enfekte bir hastadan izole edildi⁸. Fare enfeksiyonu modellerinde bu suşun daha sonra analizi, kalp dokusunu hedeflemek ve istila etmek için gelişmiş bir kapasiteye sahip olduğunu gösterdi. L. monocytogenes ek rastgele izolatların sınırlı bir analizi bakteriyel izolatların alt popülasyonlarının, kalp dokusunda veya kalp kapakçıklarında önceden herhangi bir hasar olmaması durumunda farelerin kalplerini enfekte edebildiğini göstermektedir⁸. İlginçtir ki, en iyi karakterize L. monocytogenes suşlarından ikisi olan 10403S ve EGD'nin kardiyak hücre ve dokunun zayıf kolonizatörleri olduğu bulunmuştur. 07PF0776 izolatının genom dizilimi, herhangi bir yeni patojenlik adasının varlığını ortaya çıkarmadı veya benzersiz gen kümelerinin kanıtını sunmadı^19; bu, 07PF0776'nın mevcut virülans gen ürünleri cephaneliğinin değiştirilmesi yoluyla kalp hücrelerini istila için hedeflediğini göstermektedir. Ön histokimyasal analiz, 07PF0776'nın enfekte fare kalplerinde, orijinal enfekte insan hastada gözlenen apseye benzer görünen apseler oluşturduğunu gösterir (veriler gösterilmez). Diğer kardiyotropik L. monocytogenes'in benzer kardiyak apse oluşumuna neden olup olmadığı belirlenmeye devam etmektedir.

Burada sunulan tahliller, enfeksiyonun farklı yönlerinin incelenmesini kolaylaştırmak için kolayca değiştirilebilir. Bireysel kapaklar ışık veya floresan bazlı mikroskopi için sabitlenebilir ve lekelenebilir, bakteri hücre içi büyüme oranlarının ölçümü ve karşılaştırılması için doku kültürü kuluçka süreleri artırılabilir, doku ve organlar hücresel düzeyde apse oluşumunu ve bakteri dağılımını incelemek için mikroskobik inceleme için parafin gömülüp işlenebilir. Doku kültürü hücrelerinin bakteri istilası veya konak dokuların kolonizasyonu seviyelerini değerlendirirken, her bir tahlilin tespit edebileceği minimum bakteri miktarı açısından sınırlamalar vardır. İn vitro invazyon tahlilleri kapak kapağı başına yaklaşık 300 CFU algılama alt sınırına sahiptir. Kapakları girdaplamak için kullanılan su hacminin ayarlanması, düşük sayıda bakterinin tespitini artırabilir, hücre lizis hacimleri 500 μl kadar düşük, zayıf invaziv suşları tespit etmek için yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Kapaklar, konak hücrelerin daha küçük hacimlerde lizizden önce fazla gentamisinini gidermek için steril suya kısa bir süre daldırılabilir. 5 ml veya daha büyük hacim seviyeleri, yüksek derecede invaziv suşları düzgün bir şekilde numaralandırmak için kullanılabilir. Hayvanlarda, organ homojenatları 5 ml veya 10 ml ddH_{2 0}hacimlerinde üretilebilir, daha düşük hacimler daha düşük bakteri seviyelerini tespit etmek için yararlıdır ve ağır kolonize organları daha iyi numaralandırmak için daha yüksek hacimlerdedir. Enfekte organlar için minimum algılama aralığı yaklaşık 100 CFU'dur. Organlar sürekli olarak yüksek seviyelerde kolonize edilirse, daha büyük bir su hacmi (10 ml) kullanmayı ve 96 kuyu plakası içinde daha fazla seyreltme yapmayı düşünün.

Açıklanan yöntemler kalp dışındaki organ ve dokulara uygulanabilir. Plasenta, beyin, safra kesesi, karaciğer ve bağırsak da dahil olmak üzere çok sayıda bölgede kolonizasyonu değerlendirmek için bu gibi istila tahlilleri ve fare enfeksiyonları kullanılmıştır. Yukarıda açıklanan protokollerin değiştirilmesi, hiperinvaziv ve/veya hipervirulent suşları karşılamak için de yapılabilir ve kardiyovasküler sistemin dışındaki bölgelerde invazyon fenotiplerini değerlendirmek için kalp hücrelerinin diğer hücre tipleriyle değiştirilmesi yapılabilir. Farklı hücre tipleri L. monocytogenes istilasına karşı duyarlılıkları değiştirdiğinden, tahlillerden verileri doğru bir şekilde kurtarmak için MOI ve kuluçka süreleri gibi parametrelerin ayarlanması gerekebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Difco	BHI Broth Base	237200	2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2 kg of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12 mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14 ml Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75 cm2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum