Protocol
一般的なガイダンス：動物実験は、動物によって課せられたガイドラインおよび規則に従って（科学的処置）法1986このプロトコルと多くの上で実行することができます付属のビデオプロトコル標準UUOとR-UUO両方のためのもの、で行ったマウス系統。添付のビデオでは、両方の手順は、8週齢のオスのC57BL / 6マウスで実行されます。代表的な結果のセクションで提示されたデータは、オスのFVB / Nマウスから得た。
注：このプロトコルは、左尿管を利用して、標準的なUUO及びR-UUOを実行する方法ビデオの詳細を伴うが、しかし、同じ技術を容易に右尿管にも適用することができる。
1.動物の準備および開腹
- 無菌（オートクレーブ処理）楽器や消耗品を持つすべての手順を実行します。
- 麻酔腹腔内に塩酸ケタミン（70mgの/ kg）及びメデトミジン塩酸塩（1mgの/ kg）を注入マウス。注意：結果の麻酔薬平面の持続時間は4時間で、全く補足麻酔は必要ありません。
- 反射神経例えば、つま先のピンチの損失によって麻酔の深さを確認してください。
- 切開領域周辺の毛を削除し、希薄クロルヘキシジン溶液の適用を介して手術のために腹部の皮膚を準備します。
- 仰臥位で加熱された外科パッドの上にマウスを置き、低粘着性接着テープを使用してパッドに手足を固定する。
- 手順の間に、加熱された手術用パッドの結果として、熱傷の兆候がないマウスを監視します。可能であれば、非電気的熱源を使用しています。
- 塩酸ブプレノルフィン（0.06mg / kg）を皮下注射によって鎮痛を投与し、角膜の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用する。
- 正中開腹と腹腔へのアクセスを得るために組織分離ハサミを使って無血管白線の切開を行います。
- マウスをドレープコリブリを挿入切開に開創。
2.片側尿管閉塞
- 滅菌綿棒を使用すると、腹腔の右側に向かって腸を移動させることによって、左尿管を露出し、湿らせたドレープでそれらをカバーしています。
- 角度付き鉗子を使用すると、隔離し、左尿管を持ち上げます。
- 尿管閉塞を作成するには、どこにでも膀胱と腎盂の間に6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。長期実験のために、すべての腹部の手術のために吸収性縫合糸を使用しています。あるいは、結紮クリップは、尿管にも適用することができる。
- 尿管から膀胱を単離するために、2本の縫合糸の間に尿管を分割。
- 慎重に腹腔内に腸を交換してください。
- 第4節に記載されている手順に従ってください - 術後の回復とケア切開を閉じ、麻酔を逆にする。
Reversibl 3.準備E片側尿管閉塞
- 手術のためにマウスを準備し、上記の手順1.1から2.2で詳述するように、左尿管を隔離する。
- 逆にすることができる尿管閉塞を作成するには、膀胱に近い6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。これは尿管の周りの場所に柔らかい壁のプラスチックチューブを固定するために使用されるように、長いアッパー縫合糸の一端を残します。
- それは尿管に適用されるように開放スプレイすることができるように柔らかい肉プラスチック管5mmの長さの縦方向のスリットを作る。 1ミリメートルと2ミリメートルの外径の内径を有する任意の柔らかい壁シリコーンプラスチック管を使用することができる。
- 尿管の周りに優しく柔らかい壁のプラスチックチューブを置きます。それは尿管の周りに閉鎖された後、長い縫合糸は、チューブのスリットの中心から出ていることを確認してください。
- 尿管を囲む柔らかい肉の管の周りに6 / O黒編み絹縫合糸の長さを置き、ネクタイ一回。今、縦方向にそれが以前に結ばれた縫合糸の上に位置するように、管全体に、チューブのスリットの中央から出てくる、縫合糸の長い方の端を置く。
- チューブおよび尿管の周りの場所で長い縫合糸端を固定する二回のチューブの周囲に位置する縫合糸を結ぶ。
注：尿管およびソフト薄肉プラスチックチューブ上の癒着形成を防止するために、接着還元溶液は、チューブの周りの領域に適用することができる。 - 慎重に腹腔内に腸を交換してください。
4.術後の回復とケア
- 5 / O黒編み絹縫合糸を使用したブランケットステッチで腹膜を閉じて、金属製の皮膚クリップを使用して皮膚に近似している。
- 術後感染のリスクを最小限にするために、そのような腹部の皮膚にヨウ素/アルコール溶液のような防腐剤を加える。
- 部分的に皮下アチパメゾール塩酸塩（2mgの/ kg）で麻酔を逆転。 1mlを皮下注射することにより、流体を投与は、生理食塩水を温めた。
- それが意識を回復するまでマウスを監視します。
- マウスは24時間29℃に保たれ、加熱ボックスに回復することを許可します。湿らせた食品は、流体および栄養摂取を促進するために提供することができる。
- 通常は7日、障害物の所望のレベルを誘導するために回復するマウスのままにしておきます。
- 長期的な回復実験のために、継続的な鎮痛を提供する。マウスよりも長い7日間回復される場合、皮膚クリップを手術後7日を削除します。
- 閉塞の所望のレベルが誘発された後、いずれかの以下に説明するように、UUOを逆転、または頸椎脱臼によってマウスを安楽死させると組織病理学分析のために腎臓を収集する。
5.リバーシブル片側尿管閉塞
- R-UUOを実行するには、手順で説明するように手術のために、R-UUOのための準備が行われたマウスを、準備10.1から1.7。
- 存在する場合、皮膚クリップを削除して、腹腔へのアクセスを得るために腹膜に縫合糸を分割または削除。注：尿管は、長期実験皮膚クリップの妨げされている場合は、アプリケーション以下の7日間を除去されている必要があります。
- マウスを準備し、ステップ1.8から2.2で説明したように、左尿管を隔離する。
- 角度付き鉗子を使用して、形成された可能性の肉芽腫組織から柔らかい壁のプラスチックチューブを解放する。
- メスで閉塞尿管の周りにプラスチックチューブを保持している縫合糸を切り、チューブを外す。
- 左の腎臓における水腎症の存在を評価することによって成功したUUOを確認し、腎臓にも淡い表示されます。
- 縫合糸の間に尿管を分割します。
- 滅菌ガーゼの小片に、腎臓に付着し、尿管の残りの長さを置きます。これは尿管aから排出されます尿沈渣と死細胞を収集するために使用されますND腎盂縫合糸が除去されると。
- 上記の尿管を分割したが、近くに、縫合糸と腎臓は、ガーゼの上に排出させる。膀胱に最も近い、そのまま、下縫合のままにしておきます。これは、尿が膀胱から腹腔に漏れないことを確実にすることである。
- 尿管と腎盂が排出されると、尿管の残りの長さの最後に長い6 / O黒編組絹縫合糸を適用する。これは、後の膀胱尿管吻合部を補助するために使用される。
- 膀胱に尿管の残りの長さを吻合するには、以下の手順に従ってください。
- それは元の位置の前方に位置し、腎臓の上に位置するように尿管を回します。
- それは膀胱の方向に出てくるような尿管の端から縫合糸2ミリメートルをタッキングシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントを置きます。縫合糸が筋層に残り、尿管の内腔に入らないように注意してください。タッキング縫合糸ウィルlは、膀胱内の尿管を固定するために使用すること。
- 膀胱を通してチャネルを作成するには、それが膀胱の正面（腹側）壁の方に出るように、膀胱を通して斜めに21G針を渡す。
- 21G針のベベルで目の針を休ま。膀胱を通して目の針を導くために21G針を使用してください。目の針は、膀胱を通って尿管を取るために使用される。
- 9 / Oタッキング縫合糸を渡し、膀胱内と外のエントリポイントに隣接した膀胱壁を介して第切開部を介して、ステップ5.11.2で尿管に適用される。尿管、膀胱を通過したらこれは、膀胱に尿管を固定するために結ばれます。
- 目の針を介してステップ5.10で尿管の一端に印加長い6 / O黒編組絹縫合糸を配置します。
- 慎重に尿管が膀胱を通って引っ張られることを確実にしながら、膀胱の外に目を針を撤回。
- 尿管が目から出たらEの膀胱は、目の針を削除し、バック膀胱へ後退を防止するために、尿管の終わりに長い縫合糸にクランプを適用する。
- 膀胱内に場所内の尿管を固定するには、手順5.11.5で適用9 / Oポリアミドモノフィラメントタック縫合糸を、ネクタイ。
- しっかりと膀胱内の尿管を固定するエントリポイントの周りの2箇所に段階5.11.2と5.11.5で説明したように、追加のシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントタイ縫合糸を適用します。
- 開いたハサミの裏を使用して、緊急尿管のより多くを露出するために戻って少し膀胱壁を押してください。
- 尿管の端部に位置する長い縫合上記の尿管を分割します。尿管、膀胱の体内に後退する必要があります。これは、尿管の開放管腔を確認し、膀胱内の開口部から流れ出る尿を観察することが通常である。
- 9 / Oポリアミドモノフィラメント縫合糸で膀胱の出口傷を閉じます。
- 慎重に腸を交換腹腔。
- ステップ4.1から4.8に詳述術後ケアを提供。
- 腎臓は通常、7日、圧縮解除されるまで、マウスが回復することを許可します。
- 実験の終了時点で、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させると組織病理学的分析のために腎臓を収集します。
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Representative Results
腎臓の変化の外観が著しく尿管閉塞に続く、それはより薄いと時間との触診に緊張した（ 図1）となる。障害物に尿管の近位および腎盂の増加拡張があります。腎臓は腎皮質と髄質の著しい間伐結果として長期の閉塞閉塞性腎症の増加期間としてますます萎縮になる。尿管閉塞の逆転後、腎臓の色が血流が増加し、組織浮腫が解消するように暗くなる。彼らは長期の膨満の期間（図1）の結果として、わずかに「だぶだぶ」残るかもしれないが、腎臓の尿管と腎盂の拡張が治まる。組織損失の程度が障害物の持続期間に依存するが、組織の萎縮の要素が避けられないとして、脱遮ら腎臓は反対側の腎臓よりも一般的に小さくなっている。
通常の非操作するネイティブ腎臓の組織学は、多くの細管が明らかに（ 図2）内腔に識別を持つ尿細管間質のコンパクトな細管に囲まれた糸球体を明らかにする。尿管閉塞以下尿管および腎盂（ 図1）の膨張及び拡張は、組織切片の組織学に容易に明らかである尿細管（ 図2に矢印拡張細管）の拡張を増加させることによって達成される。糸球体は、尿細管間質に限局傷害や瘢痕化と、このモデルで正常な外観を呈する。いくつかの細管（ 図2）に拡張したままになることがありますが、管状膨満と拡張の漸進的かつ重要な解像度は、尿管閉塞の救済を以下の通り。
ネイティブ、UUOとR-UUOの腎臓、腎盂と尿管の図1.外観。オスFVBマウスは、7日間一方的な尿管閉塞（UUO）を受けた。マウスは、どちらかを犠牲にされたか、UUOは、その後（R-UUO）逆転と犠牲の前に7日間解凍腎臓た。画像は、屠殺時に採取し、ネイティブ、UUOとR-UUO腎臓の腎臓、腎盂、尿管と膀胱の外観を表したものである。ネイティブ腎臓と比較してUUOの腎臓は水腎と色が淡い表示されます。腎盂と尿管が「だぶだぶ」若干残るものの、脱閉塞に続いてR-UUO腎臓が解凍されている。 R-UUOの尿管が原因で膀胱への事前の再吻合に遮られた部分の除去にUUOとネイティブ腎臓よりも短くなっていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.ネイティブ、UUOとR-UUO腎臓の代表的な組織学。オスFVBマウスは、7日間一方的な尿管閉塞（UUO）を受けた。マウスは、どちらかを犠牲にされたか、UUOは、その後（R-UUO）逆転と犠牲の前に7日間解凍するために許可された腎臓た。代表的な顕微鏡写真（倍率：×200）対照の非操作さネイティブ腎臓、UUO腎臓とR-UUO腎臓からのH＆E染色された腎臓切片の。正常な腎臓の健康間質は、通常のコンパクトな細管で構成されている。矢印で示した細管の数がUUO後7日目で有意な拡張を示す。対照的に、尿細管拡張が著しくUUOの逆転後7日目に減少する。「空白>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Disclosures
著者らは、開示する、競合または競合する利害を有していない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
