Protocol
إرشادات عامة: أجريت التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي تفرضها الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986. وهذا البروتوكول والتي يمكن القيام بها في كثير المصاحبة للبروتوكول الفيديو هي لكل من UUO القياسية وR-UUO، سلالات الماوس. في الفيديو المرافق، يتم تنفيذ كل من الإجراءات على الذكور C57BL / 6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع. تم الحصول على البيانات المقدمة في قسم نتائج ممثلة من FVB الذكور / ن الفئران.
ملاحظة: هذا البروتوكول والمرافق تفاصيل الفيديو كيفية إجراء UUO القياسية وR-UUO الاستفادة من الحالب الأيسر، إلا أن نفس الأساليب يمكن بسهولة أن تطبق على الحالب الأيمن.
1. إعداد الحيوانية والبطن
- تنفيذ كافة الإجراءات العقيمة مع (تعقيمها) الأدوات والمواد الاستهلاكية.
- حقن هيدروكلوريد الكيتامين (70mg / كغ)، وهيدروكلوريد medetomidine (1mg / كغ) البريتونى لتخديرالماوس. ملاحظة: مدة من الطائرة التخدير الناتجة 4 ساعة ومطلوب أي تخدير التكميلي.
- تأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان ردود الفعل على سبيل المثال، قرصة أخمص قدميه.
- إزالة كل الشعر المحيطة بمنطقة شق وإعداد جلد البطن لعملية جراحية عن طريق تطبيق محلول مخفف الكلورهيكسيدين.
- ضع الماوس على وسادة الجراحية ساخنة في موقف ضعيف وتحديد أطرافه إلى لوحة باستخدام المنخفض تك شريط لاصق.
- خلال هذا الإجراء، مراقبة الماوس لعلامات الحروق الحرارية نتيجة لوحة الجراحية ساخنة. إذا كان ذلك ممكنا استخدام مصدر الحرارة غير كهربائية.
- إدارة مسكن عن طريق الحقن تحت الجلد البوبرينورفين هيدروكلوريد (0.06mg / كلغ) وتطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف القرنية.
- جعل البطن خط الوسط وشق من ألبا اوعائي الخط باستخدام الأنسجة فصل مقص للوصول إلى التجويف البريتوني.
- ثنى الماوس وإدراج COLIBRIضام في شق.
2. من جانب واحد الحالبي إعاقة
- باستخدام براعم القطن المعقم فضح الحالب الأيسر من تشريد الأمعاء نحو الجانب الأيمن من التجويف البطني وغطاء لهم مع الستائر مبلل.
- باستخدام ملقط الزاوية عزل ورفع الحالب الأيسر.
- لخلق انسداد الحالب، ligate الحالب الأيسر مرتين مع 6 / O مضفر الأسود الحرير خياطة في أي مكان بين المثانة والحوض الكلوي. لإجراء التجارب على المدى الطويل، واستخدام الخيط للامتصاص لجميع العمليات الجراحية في البطن. بدلا من ذلك، مقطع ligating يمكن تطبيقها على الحالب.
- لعزل المثانة من الحالب، تقسيم الحالب بين الغرز اثنين.
- استبدال بعناية الأمعاء في التجويف البريتوني.
- اتبع الخطوات المذكورة في القسم 4 - الإنعاش والعناية بعد العملية لإغلاق الجرح وعكس التخدير.
3. إعداد لReversiblالبريد جانب واحد الحالبي إعاقة
- إعداد الماوس لإجراء عملية جراحية وعزل الحالب الأيسر كما هو مفصل في خطوات 1،1-2،2 أعلاه.
- لخلق انسداد الحالب التي يمكن عكسها، ligate الحالب الأيسر مرتين مع 6 / O السوداء مضفر الحرير خياطة قريبة من المثانة. ترك واحدة من نهاية الخيط العلوي دام وسوف تستخدم هذه لترسيخ أنابيب بلاستيكية لينة الجدران في مكان حول الحالب.
- جعل شق طولي في طول 5MM من لينة أنابيب بلاستيكية الجدران بحيث يمكن مفلطحة مفتوحة للسماح لها ليتم تطبيقها على الحالب. أي الجدران لينة سيليكون أنابيب بلاستيكية، مع القطر الداخلي من 1MM وقطرها الخارجي من 2mm في، يمكن استخدامها.
- وضع أنابيب بلاستيكية لينة الجدران بلطف حول الحالب. تأكد من أن خياطة طويلة تبرز من وسط الشق في أنابيب مرة واحدة يتم إغلاقه في جميع أنحاء الحالب.
- ضع بطول 6 / O مضفر الأسود الحرير خياطة حول أنابيب الجدران لينة أرفق الحالب وربطة عنقمرة واحدة. الآن ضع نهاية فترة طويلة من خياطة، الخارجة من وسط شق في الأنابيب، طولي عبر أنابيب بحيث انها تقع على رأس خياطة مرتبطة في السابق.
- ربط الخيط تقع حول أنابيب مرتين لترسيخ أنابيب وخياطة نهاية فترة طويلة في مكان حول الحالب.
ملاحظة: لمنع تشكيل التصاق على الحالب وأنابيب بلاستيكية لينة الجدران، حلا للحد من التصاق يمكن تطبيقها على المنطقة المحيطة الأنابيب. - استبدال بعناية الأمعاء في التجويف البريتوني.
4. بعد العملية الإنعاش والعناية
- إغلاق الصفاق مع غرزة بطانية باستخدام 5 / O مضفر الأسود الحرير خياطة وتقريب الجلد باستخدام مقاطع الجلد المعدنية.
- لتقليل خطر العدوى بعد العمليات الجراحية، وتطبيق مطهر مثل محلول اليود / الكحول على الجلد في منطقة البطن.
- التخدير عكس جزئيا مع هيدروكلوريد atipamezole (2mg / كلغ) تحت الجلد. إدارة السوائل عن طريق الحقن تحت الجلد من 1 مل تحسنت المالحة.
- مراقبة الماوس حتى تعافى ذلك الوعي.
- السماح الماوس لاستعادة في مربع ساخنة يحتفظ بها في 29 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ويمكن أيضا أن توفر الغذاء مبلل لتشجيع تناول السوائل والتغذية.
- ترك الماوس لاستعادة للحث على المستوى المطلوب من إعاقة، وعادة 7 أيام.
- للتجارب التعافي على المدى الطويل، وتقديم المسكنات الجارية. إذا كان الماوس التي سيتم استردادها لفترة أطول من 7 أيام، وإزالة لقطات الجلد 7 أيام بعد الجراحة.
- مرة واحدة وقد تم يسببها المستوى المطلوب من إعاقة، إما عكس UUO، كما هو موضح أدناه، أو الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وجمع الكلى لتحليل التشريح المرضي.
5. عكسية من جانب واحد الحالبي إعاقة
- لإجراء R-UUO إعداد الماوس، التي مرت استعدادا لR-UUO، لإجراء عملية جراحية كما هو موضح في الخطوات من 10،1-1،7.
- إذا كان موجودا، وإزالة لقطات الجلد وتقسيم أو إزالة الغرز في الصفاق للوصول إلى تجويف البطن. ملاحظة: إذا تم عرقلة الحالب لفترة طويلة الأجل مقاطع الجلد التجربة كان ينبغي إزالتها 7 أيام بعد التطبيق.
- إعداد الماوس وعزل الحالب الأيسر كما هو موضح في الخطوات 1،8-2،2.
- باستخدام ملقط الزاوية، تحرير لينة أنابيب بلاستيكية الجدران من أي نوع من الأنسجة حبيبية التي ربما تكون قد تشكلت.
- قطع خياطة عقد أنابيب بلاستيكية حول الحالب المتعسرة مع مشرط وإزالة الأنبوب.
- تأكيد نجاح UUO من خلال تقييم لوجود موه الكلية في الكلية اليسرى، وينبغي أيضا تظهر الكلى شاحب.
- تقسيم الحالب بين الغرز.
- ضع طول المتبقية من الحالب، التي تعلق على الكلى، على قطعة صغيرة من الشاش المعقم. وسوف تستخدم هذه لجمع الرواسب البولية والخلايا الميتة التي سوف تستنزف من الحالب لالثانية تتم إزالة الحوض الكلوي مرة واحدة خياطة.
- تقسيم الحالب أعلاه، ولكن قرب، خياطة وتسمح الكلى لاستنزاف على الشاش. ترك الدنيا خياطة، الأقرب إلى المثانة، سليمة. هذا هو لضمان عدم تسرب البول والمثانة من وإلى التجويف البريتوني.
- مرة واحدة وقد استنزفت الحالب والحوض الكلوي، وتطبيق طويلة 6 / O الأسود مضفر الحرير خياطة إلى نهاية طول المتبقي من الحالب. وسوف تستخدم هذه للمساعدة في الحالب إلى المثانة مفاغرة أجريت في وقت لاحق.
- اتبع الخطوات التالية ليتفاغر طول المتبقية من الحالب في المثانة:
- تحويل الحالب بحيث تقع الأمامي إلى موقعها الأصلي وتقع على الكلى.
- وضع واحدة 9 / O مادة البولي أميد حيدة تغير اتجاهها خياطة 2 ملم من نهاية الحالب بحيث يظهر في اتجاه المثانة. الحرص على ضمان أن تبقى خياطة في معطف العضلات ولا تدخل لمعة الحالب. وفيل تغير اتجاهها خياطةأن تستخدم ل لترسيخ الحالب في المثانة.
- لإنشاء قناة من خلال المثانة، وتمرير إبرة 21G قطريا من خلال المثانة بحيث خروجها باتجاه أمامي (البطني) جدار المثانة.
- راحة إبرة العينين في شطبة من الإبرة 21G. استخدام إبرة 21G لتوجيه الإبرة العينين من خلال المثانة. وسوف تستخدم إبرة العينين اتخاذ الحالب من خلال المثانة.
- تمرير تغير اتجاهها خياطة 9 / O، وتطبيقها على الحالب في الخطوة 5.11.2، من خلال شق الأول في المثانة والخروج من خلال جدار المثانة المجاور لنقطة الدخول. وبمجرد تمرير الحالب من خلال المثانة تكون مرتبطة هذه لترسيخ الحالب إلى المثانة.
- ضع طويلة 6 / O مضفر سوداء خياطة الحرير تطبيقها على نهاية الحالب في الخطوة 5.10 من خلال إبرة العينين.
- سحب بعناية الإبرة العينين من المثانة مع ضمان أن يتم سحبها الحالب أيضا من خلال المثانة.
- مرة واحدة يخرج الحالب من عشرالبريد المثانة إزالة الإبرة العينين وتنطبق المشبك للخياطة طويلة في نهاية الحالب لمنع التراجع مرة أخرى في المثانة.
- لترسيخ الحالب داخل مكان في المثانة، وتعادل 9 / O مادة البولي أميد حيدة تك خياطة، وتطبق في خطوة 5.11.5.
- تطبيق واحد 9 / O مادة البولي أميد خيوط إضافية حيدة التعادل كما هو موضح في الخطوات 5.11.2 و 5.11.5 في موقعين حول نقطة الدخول إلى ترسيخ الحالب داخل المثانة.
- استخدام الجزء الخلفي من مقص فتح، ودفع جدار المثانة إلى الوراء قليلا لفضح أكثر من الحالب الناشئة.
- تقسيم الحالب فوق خياطة طويلة تقع في نهاية الحالب. الحالب يجب أن تتراجع إلى الجسم من المثانة. ومن المعتاد لمراقبة البول المتدفقة من فتحة في المثانة، مما يؤكد التجويف مفتوحة من الحالب.
- إغلاق الخروج الجرح في المثانة مع 9 / O مادة البولي أميد حيدة خياطة.
- استبدال الأمعاء بعناية فيالتجويف البريتوني.
- توفير الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو مفصل في الخطوات 4،1-4،8.
- السماح الماوس لاستعادة حتى يتم ضغط الكلى، وعادة 7 أيام.
- عند نقطة نهاية التجريبية، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وجمع الكلى لتحليل الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ظهور التغييرات الكلى بشكل ملحوظ يلي الحالبي عرقلة وأنه يصبح أكثر شحوبا ومتوترة لملامسة مع الزمن (الشكل 1). هناك توسع المتزايد للالداني الحالب إلى عرقلة والحوض الكلوي. يصبح الكلى على نحو متزايد ضامر كما مدة زيادات اعتلال الكلية معرقلة مع إعاقة لفترات طويلة مما أدى إلى تخفيف ملحوظ للقشرة الكلى والنخاع. بعد عكس انسداد الحالب، واللون في الكلى يصبح أكثر قتامة مع تزايد تدفق الدم ويقرر وذمة الأنسجة. وتوسع الحالب والكلى الحوض في الكلى ينحسر على الرغم من أنها قد تبقى قليلا "الفضفاضة" نتيجة لفترة انتفاخ لفترات طويلة (الشكل 1). الكلى-عرقلت دي هو عادة أصغر من الكلى المقابل كعنصر من ضمور الأنسجة أمر لا مفر منه على الرغم من أن درجة فقدان الأنسجة سيتوقف على مدة العرقلة.
الأنسجة في الكلى الأصلي غير التلاعب طبيعي يكشف الكبيبات محاطة الأنابيب المدمجة من tubulointerstitium مع العديد من الأنابيب التي لها مميزا التجويف واضحا (الشكل 2). وبعد الحالبي عرقلة انتفاخ وتوسع الحالب والحوض الكلوي (الشكل 1) يرافقه زيادة توسع من الأنابيب الكلوية وهذا واضح بسهولة على الأنسجة من أقسام الأنسجة (الأنابيب المتوسعة arrowed في الشكل 2). الكبيبات يحمل مظهر طبيعي في هذا النموذج مع اصابة وتندب تقتصر على tubulointerstitium. قرار تدريجي وكبير من انتفاخ أنبوبي وتوسع يتبع تخفيف من انسداد الحالب على الرغم من بعض الأنابيب قد تبقى المتوسعة (الشكل 2).
الشكل 1. مظهر، UUO وR-UUO الكلى والحوض الكلوي الأم والحالب. الفئران FVB ذكر خضع انسداد الحالب من جانب واحد (UUO) لمدة 7 أيام. تم الفئران إما التضحية أو بعد ذلك عكس UUO (R-UUO) والكلى مخفف لمدة 7 أيام قبل تضحية. وتوضح الصور مظهر من الكلى والحوض الكلوي والحالب والمثانة من الأصلي، UUO وR-UUO الكلى حصادها في وقت التضحية. وبالمقارنة مع الكلى الأصلي يظهر الكلى UUO موه الكلية وشاحب اللون. وعقب دي-انسداد الكلى R-UUO ومخفف على الرغم من أن الحوض الكلوي والحالب تبقى قليلا "الفضفاضة". لاحظ أن الحالب R-UUO أقصر من UUO والكلى الأصلي بسبب إزالة جزء عرقلت مسبق لإعادة مفاغرة في المثانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الأنسجة التمثيلية للالأم، UUO وR-UUO الكلى. الفئران FVB ذكر خضع انسداد الحالب من جانب واحد (UUO) لمدة 7 أيام. تم الفئران إما التضحية أو كان UUO ثم عكس (R-UUO) والكلى السماح للضغط لمدة 7 أيام قبل تضحية. photomicrographs التمثيلية (التكبير: X200) من H & E الملون أقسام الكلى من سيطرة غير التلاعب-الكلى الأصلي، UUO الكلى وR-UUO الكلى. وتتألف الخلالي صحية في الكلى العادي من الأنابيب المدمجة العادية. وهناك عدد من الأنابيب التي أشار إليها السهام تظهر توسع كبير في يوم 7 التالية UUO. في المقابل، يتم تقليل توسع أنبوبي بشكل ملحوظ في 7 أيام بعد عكس UUO.على بياض "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المتنافسة أو المصالح الكشف عن متضاربة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
