Protocol
הדרכה כללית: ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות שהוטלו על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. פרוטוקול זה והפרוטוקול הנלווה וידאו עבור שני UUO סטנדרטי וR-UUO, שיכול להתבצע על רבים זני עכבר. בסרטון הנלווה, שני ההליכים מתבצעים על C57BL / 6 עכברי זכרים בגילי 8 שבועות. הנתונים שהוצגו בסעיף תוצאות הנציג התקבלו מFVB / n עכברי זכרים.
הערה: פרוטוקול זה ונלווה פרטי וידאו כיצד לבצע UUO סטנדרטי וR-UUO ניצול השופכן השמאל, לעומת זאת יכול בקלות להיות מיושמת באותה הטכניקה כדי השופכן תקין.
1. הכנת בעלי החיים וlaparotomy
- לבצע את כל ההליכים עם מכשירים סטריליים (autoclaved) ומתכלים.
- להזריק קטמין הידרוכלוריד (70mg / kg) וhydrochloride medetomidine (1 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally להרדיםהעכבר. הערה: משך מטוס הרדמה וכתוצאה מכך הוא 4 שעות ולא נדרשת הרדמה משלימה.
- אשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן הרפלקסים למשל, קמצוץ הבוהן.
- הסר את כל השיער המקיף את אזור החתך ולהכין את עור הבטן לניתוח באמצעות יישום של פתרון chlorhexidine לדלל.
- הנח את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במצב שכיבה ולתקן את הגפיים לכרית באמצעות סרט דבק נמוך סימון.
- במהלך ההליך, לפקח על העכבר לסימני כוויות תרמית כתוצאה מהכרית כירורגית המחוממת. אם אפשר להשתמש במקור חום לא חשמלי.
- לנהל משכך כאבים על ידי הזרקה תת עורית של hydrochloride עצירות (0.06mg / קילוגרם) ולהחיל חומר סיכה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית.
- הפוך laparotomy קו האמצע וחתך של alba linea avascular באמצעות מספריים רקמה מפרידה כדי לקבל גישה לחלל הצפק.
- לעטוף את העכבר והכנס COLIBRIמפשק לתוך החתך.
חסימת 2. חד-צדדי Ureteric
- שימוש בניצני כותנה מעוקר לחשוף את השופכן שהותיר עקירת המעיים לכיוון הצד הימני של חלל הבטן ומכסה אותם עם וילונות לחים.
- בעזרת מלקחיים זווית לבודד ולהרים את השופכן השמאל.
- כדי ליצור חסימת ureteric, לקשור השופכן שמאל פעמיים עם 6 / O תפר משי שחור קלוע בכל מקום בין שלפוחית השתן ואגן כליה. בניסויים לטווח ארוכים, להשתמש בתפר נספג עבור כל ניתוחי הבטן. לחלופין, קליפ ligating יכול להיות מיושם על השופכן.
- כדי לבודד את שלפוחית השתן משופכן, לחלק את השופכן בין שני התפרים.
- להחליף את המעיים בזהירות לתוך חלל הצפק.
- בצע את השלבים המפורטים בסעיף 4 - שחזור לאחר ניתוח וטיפול כדי לסגור את החתך ולהפוך את ההרדמה.
3. הכנה לReversiblחסימת הדואר חד צדדי Ureteric
- הכן עכבר לניתוח ולבודד את השופכן השמאל כמפורט בשלבים 1.1-2.2 לעיל.
- כדי ליצור חסימת ureteric שיכול להיות הפוכה, ולקשור השופכן שמאל פעמיים עם 6 / O תפר משי שחור קלוע קרוב לשלפוחית השתן. השאר קצה אחד של התפר העליון עוד זה ישמש לעגן את צינורות פלסטיק הרכים מוקפי חומה במקום סביב השופכן.
- הפוך חריץ אורכי באורך 5 מ"מ של צינורות פלסטיק מוקפי חומה רך כזה שניתן פשק אותה פתוח כדי לאפשר לו להיות מיושם בדרכי השתן. כל צינורות פלסטיק סיליקון מוקפי חומה רכה, עם קוטר פנימי של 1 מ"מ וקוטר חיצוני של 2 מ"מ, ניתן להשתמש.
- מניחים את צינורות פלסטיק מוקפי חומה הרכה בעדינות סביב השופכן. ודא שהתפר הארוך עולה ממרכז החריץ בצינור לאחר שהוא נסגר סביב השופכן.
- מניחים באורך של 6 / O תפר משי שחור קלוע סביב הצינור המוקף חומה הרכה המקיף את השופכן ולקשורפעם אחת. עכשיו מקום סוף התפר הארוך, מתעורר ממרכז החריץ בצינור, longitudinally פני צינורות כך שהוא נמצא בחלק העליון של התפר קשור בעבר.
- לקשור את התפר ממוקם סביב הצינור פעמיים כדי לעגן את צינורות וסופו של דבר התפר הארוך במקום סביב השופכן.
הערה: כדי למנוע היווצרות הידבקות בשופכן וצינורות פלסטיק המוקף חומה הרכה, פתרון הפחתת הידבקות יכול להיות מיושם על האזור סביב הצינור. - להחליף את המעיים בזהירות לתוך חלל הצפק.
שחזור 4. לאחר ניתוח וטיפול
- סגור את הצפק עם שמיכת תפר באמצעות 5 / O תפר משי שחור קלוע ולהתקרב לעור באמצעות קליפים עור מתכתיים.
- כדי למזער את הסיכון לזיהום לאחר ניתוח, חל כגון חיטוי כתמיסת יוד / אלכוהול לעור הבטן.
- חלקית הרדמה הפוכה עם hydrochloride atipamezole (2 מ"ג / קילוגרם) תת עורי. לנהל נוזלים על ידי הזרקה תת עורית של 1 מיליליטר חימם מלוח.
- לפקח על העכבר עד שהוא חזר להכרתו.
- אפשר העכבר כדי להתאושש בקופסא מחוממת שמרה על 29 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. יכול להיות גם סיפק מזון טבול לעודד צריכת נוזלים ותזונה.
- השאר את העכבר כדי להתאושש כדי לגרום לרמה רצויה של חסימה, בדרך כלל 7 ימים.
- בניסויים התאוששות לטווח ארוך, לספק משככי כאבים מתמשכים. אם העכבר הוא להיות התאושש למשך זמן ארוך יותר מ -7 ימים, להסיר את סרטוני עור 7 ימים לאחר ניתוח.
- ברגע שהרמה הרצויה של חסימה כבר מושרה, או להפוך את UUO, כפי שיתואר להלן, או להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולאסוף את הכליות לניתוח histopathology.
חסימת 5. הפיך חד צדדי Ureteric
- כדי לבצע R-UUO להכין עכבר, שעבר הכנה לR-UUO, לניתוח כפי שמתואר בשלבים 10.1-1.7.
- אם הווה, להסיר את סרטוני העור ולחלק או להסיר את התפרים בהצפק כדי לקבל גישה לחלל הבטן. הערה: אם השופכן כבר חסום לקטעי עור ניסוי ארוך טווח צריך להיות מודח 7 ימים לאחר יישום.
- הכן את העכבר ולבודד את השופכן השמאלי כמתואר בשלבים 1.8-2.2.
- בעזרת מלקחיים זווית, לשחרר את צינורות פלסטיק הרכים מוקפי חומה מכל רקמת granulomatous שאולי נוצרה.
- חותך את התפר מחזיק צינורות הפלסטיק סביב השופכן החסום עם אזמל ולהסיר את הצינור.
- לאשר UUO המוצלח על ידי הערכה לנוכחות של הידרונפרוזיס בכליה השמאלית, הכליות אמורות להופיע חיוורות גם.
- מחלקים את השופכן בין התפרים.
- הנח את האורך הנותר של השופכן, שצורף לכליות, על פיסה קטנה של גזה סטרילית. זה ישמש כדי לאסוף את משקעי השתן ותאים מתים שיהיה לנקז מהשופכןnd אגן כליה אחת התפר הוסר.
- מחלקים את השופכן לעיל, אך קרוב, התפר ולאפשר הכליות לניקוז על גבי הגזה. השאר את התפר התחתון, קרוב לשלפוחית השתן, ללא פגע. זו היא להבטיח כי לא שתן ידלוף משלפוחית השתן ולתוך חלל הצפק.
- ברגע שהשופכן ואגן כליה כבר סחוט, להחיל תפר משי ארוך 6 / O שחור קלוע לסוף האורך הנותר של השופכן. זה ישמש כדי לסייע לשופכן להשקת שלפוחית השתן שבוצעה מאוחר יותר.
- בצע את השלבים הבאים לanastomose האורך הנותר של השופכן לתוך שלפוחית השתן:
- הפעל השופכן כך שהוא נמצא קדמי למקומו המקורי ושקרים על הכליות.
- מניחים תפר Tacking יחיד 9 / O monofilament פוליאמיד 2 מ"מ מהקצה של השופכן כך שהוא עולה לכיוון שלפוחית השתן. תשמור על מנת להבטיח שהתפר נשאר במעיל שרירי ולא להיכנס ללום שופכן. Wil תפר Tackingl לשמש כדי לעגן את השופכן בשלפוחית השתן.
- ליצירת ערוץ דרך שלפוחית השתן, לעבור מחט 21G באלכסון דרך שלפוחית השתן כך שעם יציאתו לכיוון הקדמי הקיר (הגחון) של שלפוחית השתן.
- לנוח מחט עיניים בשיפוע של מחט 21G. השתמש במחט 21G כדי להנחות את מחט העיניים דרך שלפוחית השתן. מחט העיניים תשמש לקחת השופכן דרך שלפוחית השתן.
- לעבור תפר Tacking 9 / O, שהוחל על שופכן בשלב 5.11.2, דרך החתך הראשון בשלפוחית השתן והחוצה דרך קיר שלפוחית השתן הסמוך לנקודת הכניסה. ברגע שהשופכן עובר דרך שלפוחית השתן זה יהיה קשור לעגן את השופכן לשלפוחית השתן.
- הנח את התפר הארוך 6 / O שחור קלוע המשי להחיל את הסוף של השופכן בשלב 5.10 דרך מחט העיניים.
- לסגת בזהירות את מחט העיניים מחוץ לשלפוחית תוך הבטחה שהשופכן גם משך דרך שלפוחית השתן.
- ברגע שהשופכן עולה מהשלפוחית השתן דואר להוציא את מחט העיניים ולהחיל מהדק לתפר הארוך בסוף השופכן כדי למנוע נסיגה לאחור לתוך שלפוחית השתן.
- לעגן את השופכן בתוך מקום בשלפוחית השתן, לקשור את תפר נקודת סימון monofilament 9 / O פוליאמיד, הוחל בשלב 5.11.5.
- החל תפרי יחיד נוספים 9 פוליאמיד / O עניבת monofilament כמתואר בשלבים 5.11.2 ו5.11.5 בשני מקומות סביב נקודת הכניסה לעגן את השופכן בשלפוחית השתן בתקיפות.
- שימוש בחלק האחורי של מספריים נפתחו, לדחוף את קיר שלפוחית השתן מעט לאחור כדי לחשוף יותר של השופכן המתהווה.
- מחלקים את השופכן מעל התפר הארוך ממוקם בקצה של השופכן. שופכן צריכה לחזור לגוף של שלפוחית השתן. זה רגיל להתבונן שתן זורם מתוך הפתח בשלפוחית השתן, המאשר את לומן הפתוח של השופכן.
- סגור את פצע היציאה בשלפוחית השתן עם תפר monofilament פוליאמיד 9 / O.
- בזהירות להחליף את המעיים לחלל הצפק.
- לספק טיפול שלאחר ניתוח, כמפורט בצעדים 4.1-4.8.
- אפשר העכבר כדי להתאושש עד הכליה ביטול דחיסת, בדרך כלל 7 ימים.
- בנקודת סיום הניסוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולאסוף את הכליות לניתוח histopathological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המראה של השינויים בכליות במידה ניכר בעקבות חסימת ureteric והוא הופך להיות חיוור ומתוח למישוש עם זמן (איור 1). יש הרחבה הולכת וגדל של הפרוקסימלי שופכן לחסימה ואגן הכליה. הכליות הופכת יותר ויותר מכולה כמשך עליות נפרופתיה חסימתית עם חסימה ממושכת וכתוצאה מכך דילול ניכר של קורטקס ומדולה הכליות. בעקבות ביטול חסימת ureteric, הצבע של הכליה הופך כהה יותר עם עלייה בזרימת דם ופותר בצקת רקמה. הרחבה של אגן הכליה שופכן ושל הכליה שוככת למרות שהם עשויים להישאר מעט 'רחבים' כתוצאה מתקופת ההתנפחות ממושכת (איור 1). הכליות-חסום de היא בדרך כלל קטנות יותר מהכליות נגדי כאלמנט של ניוון רקמה הוא בלתי נמנע למרות שהתואר של אובדן רקמה יהיה תלוי בתקופת החסימה.
היסטולוגיה של הכליה האם אינה מניפולציה הנורמלית מגלה glomeruli מוקפת tubules הקומפקטי של tubulointerstitium עם צינוריות רבות שיש להבחין לומן ניכר (איור 2). בעקבות חסימת ureteric ההתנפחות והרחבה של השופכן ואגן כליה (איור 1) מלווה על ידי הגדלת הרחבה של צינוריות הכליה שהיא בקלות לידי ביטוי בהיסטולוגיה של סעיפי רקמות (tubules מורחב מחודד באיור 2). Glomeruli להפגין מראה נורמלי במודל זה עם פציעה וצלקות מוגבלות לtubulointerstitium. רזולוציה הדרגתית ומשמעותית של ההתנפחות והתרחבות צינורי כדלקמן ההקלה של חסימת ureteric למרות שחלקם צינוריות עשויות להישאר מורחבות (איור 2).
איור 1. מראה של, כליות UUO וR-UUO, אגן כליה יליד ושופכן. עכברי FVB זכר עברו חסימה חד-צדדית ureteric (UUO) למשך 7 ימים. עכברים הוקרבו או או UUO לאחר מכן התהפך (R-UUO) וכליות ביטול דחיסת למשך 7 ימים לפני ההקרבה. תמונות ממחישות את המראה של הכליות, אגן, שופך כליות ושלפוחית השתן של כליות שנקטפו בעת הקרבת ילידים, UUO וR-UUO. בהשוואה לילידי כליות כליות UUO מופיעה hydronephrotic וחיוור בצבע. בעקבות דה-חסימת כליות R-UUO יש דחיסה למרות האגן ושופכן כליות יישארו מעט 'רחב'. שים לב שהשופכן R-UUO הוא קצר יותר מאשר UUO והכליות האם בשל הסרת החלק החסום לפני השקה מחדש לתוך שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. היסטולוגיה נציג של כליות ילידים, UUO וR-UUO. עכברי FVB זכר עברו חסימה חד-צדדית ureteric (UUO) למשך 7 ימים. עכברים הוקרבו או או UUO לאחר מכן התהפך (R-UUO) והכליות מותרת לשחרר לחץ למשך 7 ימים לפני ההקרבה. photomicrographs נציג (הגדלה: X200) של H & E מוכתמת סעיפי כליות מכליות שליטה הלא מניפולציות ילידים, כליות UUO וכליות R-UUO. Interstitium הבריא של הכליה הנורמלית מורכב מצינוריות קומפקטיות רגילות. מספר tubules שצוין על ידי החצים להציג התרחבות משמעותית ביממה 7 הבאים UUO. בניגוד לכך, התרחבות צינורי מצטמצמת במידה ניכרת ב7 ימים הבאים היפוך UUO.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים לא מתחרים או סותר אינטרסים לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Spring Scissors – straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Toothed forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Angled forceps x 2 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Colibri 3 cm wire retractor | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Castroviejo needle holder with lock | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Castroviejo micro needle holder with lock | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| OPMI pico microscope | Carl Zeiss | S100 | |
| Heat electronic pad | Cozee Comfort | n/a | |
| 6/O silk braided suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| 9/O Dafilon (polyamide) suture | B-Braun | G1111434 | |
| 5/O braided silk suture | Harvard Apparatus | 51-7680 | |
| Regular bevel needle, 1 inch, 21G | Becton, Dickinson and Company | 305175 | |
| 1 ml syringe slip tip | Becton, Dickinson and Company | 300184 | |
| Wypall paper swabs | Kimberley-Clark | L40 | Sterilised (Autoclave) |
| Cotton wool buds | Johnson and Johnson | n/a | Sterilised (Autoclave) |
| Plain drapes | Guardian | CB03 | Sterilised (Autoclave) |
| Soft wall silicone rubber tubing | Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm | ||
| (Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Povidone-iodine 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Ketamine hydrochloride | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100mg/ml solution |
| (Domitor) Medetomidine hydrochloride | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1mg/ml |
| (Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride | Alsto Animal Health | Vm 00063/4002 | 0.3mg/ml |
| (Antisedan) Atipamezole hydrochoride | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5mg/ml |
| (Adept) 4% Icodextrin | Baxter | Adhesion reduction solution | |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 |
References
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75, 1145-1152 (2009).
- Kipari, T., et al. Nitric oxide is an important mediator of renal tubular epithelial cell death in vitro and in murine experimental hydronephrosis. Am J Pathol. 169, 388-399 (2006).
- Henderson, N. C., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol. 172, 288-298 (2008).
- Kitamoto, K., et al. Effects of liposome clodronate on renal leukocyte populations and renal fibrosis in murine obstructive nephropathy. J Pharmacol Sci. 111, 285-292 (2009).
- Tapmeier, T. T., et al. Reimplantation of the ureter after unilateral ureteral obstruction provides a model that allows functional evaluation. Kidney Int. 73, 885-889 (2008).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16, 3623-3630 (2005).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F1024-F1032 (2010).
- Heikkila, J., Holmberg, C., Kyllonen, L., Rintala, R., Taskinen, S. Long-term risk of end stage renal disease in patients with posterior urethral valves. J Urol. 186, 2392-2396 (2011).
- Ravanan, R., Tomson, C. R. Natural history of postobstructive nephropathy: a single-center retrospective study. Nephron Clin Pract. 105, c165-c170 (2007).
- Bascands, J. L., Schanstra, J. P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 68, 925-937 (2005).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298, F357-F364 (2010).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. Endogenous BMP-7 is a critical molecular determinant of the reversibility of obstruction-induced renal injuries. Am J Physiol Renal Physiol. 301, F1293-F1302 (2011).
- Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Hruska, K. A., Austin, P. F. The BMP-7-Smad1/5/8 pathway promotes kidney repair after obstruction induced renal injury. J Urol. 185, 2523-2530 (2011).
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ T cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836-989 (2013).
- Haque, M. E., et al. Longitudinal changes in MRI markers in a reversible unilateral ureteral obstruction mouse model: preliminary experience. J Magn Reson Imaging. 39, 835-841 (2014).
- Bai, Z. M., et al. Arterially transplanted mesenchymal stem cells in a mouse reversible unilateral ureteral obstruction model: in vivo bioluminescence imaging and effects on renal fibrosis. Chinese Med J. 126, 1890-1894 (2013).
- Chaabane, W., et al. Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction (UUO). Am J Physiol Renal Physiol. 304, F432-F439 (2013).
- Thornhill, B. A., Burt, L. E., Chen, C., Forbes, M. S., Chevalier, R. L. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new model of ureteropelvic junction obstruction. Kidney Int. 67, 42-52 (2005).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
