Abstract
Durante bacteriemia Streptococcus pneumoniae puede trasladar a través del endotelio vascular en el miocardio y formar bacterias llenos discretas lesiones microscópicas (microlesiones) que son notable debido a la ausencia de la infiltración de células inmunes. Debido a su liberación de productos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesiones se cree que contribuyen a la insuficiencia cardíaca que se observa con frecuencia durante la enfermedad neumocócica invasiva fulminante en adultos. En esto se demuestra un protocolo para la infección experimental de ratón que lleva a la formación reproducible microlesión cardíaco dentro de 30 horas. La instrucción es proporcionada en la identificación microlesión en hematoxilina y eosina secciones de corazón de colores y las distinciones morfológicas entre microlesiones principios y finales se destacan. La instrucción es proporcionada en un protocolo para la verificación de S. pneumoniae dentro microlesiones utilizando anticuerpos contra el polisacárido capsular de neumococo ymicroscopía de inmunofluorescencia. Por último, se proporciona un protocolo de intervención antibiótico que rescata los ratones infectados y para la detección y evaluación de la formación de cicatrices en los corazones de los ratones convalecientes. Juntos, estos protocolos facilitar la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión cardiaca neumocócica, muerte de los cardiomiocitos, la remodelación cardiaca como resultado de la exposición a S. pneumoniae, y la respuesta inmune a los neumococos en el corazón.
Introduction
La hospitalización de adultos para la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) conlleva un riesgo documentado de eventos cardiacos adversos que contribuyen a la mortalidad 1-4. En un estudio reciente de Corrales-Medina et al. Se encontraron complicaciones cardíacas que se asocia con y / o responsable del 27% de las muertes por neumonía asociada a 3. Streptococcus pneumoniae (neumococo), la causa más común de la PAC y la sepsis 5, se ha asociado directamente con eventos cardíacos adversos en hasta el 19% de los pacientes adultos ingresados 6. Eventos cardíacos adversos asociados con la neumonía son la insuficiencia nuevo o empeorado cardíaca congestiva, arritmias, infarto de miocardio y en orden decreciente de frecuencia 6.
En un reciente artículo de PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae se encontró que era capaz de traslocación a través del endotelio vascular cardíaco, la entrada en el myocardium, y la formación de lesiones microscópicas no purulentas discretas (microlesiones) llenos de bacterias en los ventrículos durante la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) 7. Se observó evidencia de formación microlesión cardiaca en muestras cardíacas de los primates no humanos y personas que habían sucumbido a la infección neumocócica. Asimismo, los ratones infectados experimentalmente desarrollaron de manera reproducible microlesiones cardíacas. En los ratones, el tamaño y el número microlesión se correlacionó positivamente con la duración y la gravedad de la bacteriemia, los niveles de troponina cardíaca en el suero, y la electrofisiología cardiaca aberrante. La translocación bacteriana en el corazón se encontró que se produzca a través de los mismos mecanismos responsables de la translocación del neumococo través de la barrera sangre-cerebro y el desarrollo de la meningitis neumocócica, es decir, la proteína de unión a colina-A mediada por invasión de células endoteliales vasculares en un receptor de laminina y de plaquetas receptor del factor de -activating manera dependiente de 8. Microlesformación de iones también requiere la neumolisina neumocócica toxina formadora de poros que se encontró para matar a los cardiomiocitos 7.
Microlesiones cardíacos neumocócicas son distintos del purulenta de partes blandas y abscesos cardíacas que son causadas por otras bacterias Gram-positivas, incluido el Staphylococcus aureus. Estos se caracterizan por una sola focos de bacterias rodeadas por los neutrófilos y 9,10 deposición de fibrina. Microlesiones formado por S. pneumoniae son de menor tamaño, distribuidos a lo largo de un corazón afectado, y carecen de infiltrados de células inmunes. Durante las primeras etapas de la infección, microlesiones causadas por S. pneumoniae aparecen como áreas de tejido dañado o inflamado evocador de las muestras patológicas de la cardiomiopatía. Algunos monocitos se pueden observar durante este tiempo, sin embargo, su presencia es de corta duración y las lesiones se convierten rápidamente necrótico en apariencia y llena de bacterias, mientras que al mismo tiempo continuar a GRujo de tamaño hasta la muerte del animal o la intervención antimicrobiana. Es importante destacar que, en el plazo de 3 días de la intervención a los antibióticos, profusa infiltración de células inmunes se observa en el antiguo sitio de la lesión y esto va acompañado de robusto depósito de colágeno. La remodelación cardiaca similar se ha reportado que ocurre después de un infarto junto con consecuencias duraderas sobre la función cardíaca 11-15. Por lo tanto, microlesiones son una posible explicación para los eventos cardíacos adversos que ocurren durante el IPD y, posiblemente, el aumento de la incidencia de la mortalidad relacionada con el corazón en personas convalecientes que han sobrevivido al episodio de la enfermedad.
En este documento, se proporciona la instrucción en el modelo experimental de ratón de IPD y formación de la lesión cardiaca y la visualización de microlesiones cardíacos en las primeras y últimas etapas de la infección. El protocolo para la detección de la deposición de colágeno en los animales que han sido salvados por la intervención antimicrobiana se demuestra. El objetivo de este artículo es facilitar la investigación de otros investigadores sobre este importante y novedoso patología neumocócica.
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Protocol
NOTA: Todos los experimentos con ratones fueron revisados y aprobados por los Comités Use y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio (protocolo # 13032-34-01C). Cuidado de los animales y los protocolos experimentales se adhirieron a la Ley Pública 89-544 (Ley de Protección de los Animales) y sus modificaciones, directrices servicios de salud pública, y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos).
1. Infección
- Obtener ratones BALB / c de ambos sexos entre las edades de 10 a 12 semanas de edad.
NOTA: S. pneumoniae serotipo 4 cepa TIGR4 es un aislado clínico virulento que ha sido secuenciado 16. - Crecer TIGR4 en caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C en 5% de CO 2 hasta alcanzar una densidad óptica (OD) 620 de 0,5 (correspondiente a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colonias [CFU / ml)]. Sedimentar la cultura neumocócica por centrifugación durante 10 min a 3, 500 xg y eliminar el sobrenadante usando una línea de vacío. Suspender y bacterias con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) se diluye hasta una concentración final de 1,0 x 10 4 CFU / ml.
- El uso de una cámara de inducción, anestesiar a los ratones con 2,5% de isoflurano vaporizado en oxígeno. Confirme estado anestesiado por pizca dedo del pie suave con pinzas romas.
- Sosteniendo el ratón anestesiado por su pescuezo y en posición vertical con una mano, se inyectan cada ratón por vía intraperitoneal (ip) con 100 l de la S. pneumoniae suspensión con una jeringa con una aguja de calibre 27-30 (correspondiente a una dosis de prueba de 1,0 x 10 3 CFU). Coloque la parte posterior del ratón en su jaula. Los ratones normalmente despiertan 30-40 segundos después de la inyección.
- Deje que la infección de proceder por lo menos 24 (anticipada) o 30 (avanzado) hr.
- La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2. Realizar dislocación cervical para garantizar ratón ha fallecido. La eutanasia se ve confirmado por la eliminacióndel corazón en el paso 1.6.
- Desinfectar la cola con un algodón con alcohol y cortar una sección de 2.3 mm. Recoger 2 l de sangre en serie y diluir la sangre de 10 veces en PBS que contenía heparina sódica 1 U / ml cinco veces. Placa de diluciones en serie en una placa de agar sangre de soja tríptico y se incuba durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. El siguiente extrapolar días de la colonia cuenta el nivel de bacteriemia.
- Inmovilizar el ratón en una posición supina sobre una plataforma quirúrgica. Rocíe el pecho con etanol al 70% y secar. Con unas tijeras quirúrgicas y pinzas abren la cavidad torácica, retire la caja torácica, y seccionar el diafragma para exponer el corazón y los pulmones. Con unas tijeras cortan los vasos sanguíneos conectados al corazón y los impuestos especiales suavemente el corazón con cuidado para evitar hematomas con fórceps.
- Enjuague el corazón con PBS y luego se coloca en casetes de recogida de muestras de tejido tal que las secciones coronales se obtendrían durante el corte del tejido. Para la inclusión en parafina, place los cassettes en 10% de solución amortiguadora de formalina y al día siguiente para enviar inclusión en parafina.
- Alternativamente congelación ultrarrápida usando Compuesto OCT dentro de un criomolde que se ha colocado en hielo seco.
2. La visualización de las lesiones cardiacas y neumococos dentro de las lesiones
- Reduzca secciones cardíacos incluidos en parafina de tal manera que las 4 cámaras del corazón son visibles en cada sección de tejido. Cortar las diapositivas en espesor de 5 micras.
- Desparafinar y mancha diapositivas con hematoxilina y eosina (H & E) utilizando métodos estándar 17.
- Ver H & E manchadas secciones cardiacas utilizando un microscopio de luz a baja (100X, 200X) y alta (aceite de inmersión: 400X, 1.000X) aumentos. Caracterizar corazones la presencia de microlesiones en el miocardio. En este caso, la adquisición de H & E imágenes utilizando un microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con un 100X 1.3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar.
NOTA: en las primeras etapas l cardiacaesions son discriminados por su apariencia de color diferencial y en algunos casos la presencia de células inmunes (monocitos y granulocitos) lo que parecen ser los monocitos. En lesiones avanzadas, en particular los que se observan en 30 h, las células inmunes son lesiones vacuolas como ausentes y grandes se observan en su lugar. Es importante observar que mientras que puede ocurrir la afluencia de células inmune durante las primeras etapas del desarrollo de la lesión cardiaca no parece ser un requisito.
3. inmunofluorescencia microscopía para neumococos dentro microlesiones
- Sección corazón en criomoldes con micrótomo hasta un espesor de 5 micras y secciones lugar en portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Permitir secciones cardiacas congelados se descongelen y secar al aire. Fijar secciones durante 10 min en 10% de formalina tamponada neutra (pH 6.8 a 7.2 a 25 ° C).
- Lavado de los portaobjetos (3x) en PBS durante 5 min, permeabilizar durante 15 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS, luego se lava de nuevo en PBS.
- Secti tejido Bloquear en el portaobjetos con 10% de suero de cabra en PBS durante 1 hora.
- Se lavan los portas con PBS, tapa e incubar las secciones cardiacas con conejo anti-serotipo 4 neumococo antisuero a escala 1: 1000 en PBS con 10% de suero de cabra durante 2 horas a 37 ° C.
NOTA: Para los controles negativos investigadores deben utilizar antisuero de conejo ingenuo - Después de lavar con PBS, la cubierta e incubar las secciones con 10% de suero de cabra-PBS con cabra anti-conejo FITC anticuerpo conjugado a 1: 2000 durante 30 minutos a 37 ° C.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenilindol) a 5 mg / ml para la visualización de los núcleos eucariotas. Lave y montar las secciones de tejido con Fluorsave.
- Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema de microscopía confocal, tanto en baja y alta magnificación. Ajuste la apertura numérica en consecuencia para obtener resultados óptimos. Aquí, adquirir imágenes fluorescentes utilizando un sistema confocal con un objetivo 60X apertura numérica 1,42.
- Comience con ratones infectados ip con 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 como se indica anteriormente en el paso 1.
- A partir de las 30 horas después de la infección, administrar farmacéutica ampicilina grado ip (80 mg / kg de peso corporal) en 100 l de solución salina cada 12 horas durante 36 horas. Recoge los corazones en el punto de tiempo deseado y el proceso como se describe en el paso 1.6 para la inclusión en parafina y el tejido, el corte.
5. El colágeno Detección Deposición
- El uso de xileno y lavados de alcohol graduadas con agua, Desparafinar y tejidos hidrato secciones desionizada utilizando métodos estándar 17. Tratar secciones con ácido acuoso 0,2% fosfomolıbdico durante 5 minutos y enjuagar con agua desionizada durante 5 min.
- Secciones mancha con 0,1% rojo sirio en ácido pícrico durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Lavar las secciones en ácido clorhídrico 0,01 N durante 3 min y enjuagar el uso de etanol al 70% durante 1 min.
- DeshidrataciónTA El secciones usando el idéntico pero el orden de lavados al descrito en 5.1 revertir, deshidratar secciones cardiacas en el aumento y la clasificación concentraciones de etanol y después xileno.
- Secciones de tejido monte con una solución de montaje para la evaluación microscópica.
- Para identificar las regiones del depósito de colágeno, examinar secciones de tejido teñido de áreas de tinción de lectura profunda en condiciones de baja y alta magnificación utilizando un microscopio de luz. Cualquier área dentro de los ventrículos del corazón, que es de color rojo es un área donde el colágeno se ha depositado. Áreas sin esta mancha roja son sitios de tejido sano que carecen de la deposición de colágeno. Aquí, adquirir Picro Sirius Red imágenes teñidas utilizando un microscopio equipado con un objetivo 20X apertura numérica 0.5.
NOTA: Las manchas rojas atrio en los tejidos sanos.
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Representative Results
Visualización de microlesiones por H & E
Se observaron microlesiones cardíacos en los ventrículos del H & E manchadas secciones cardíacas de ratones con IPD tras su desafío ip con TIGR4. La Figura 1 muestra el aumento en el tamaño de estas lesiones entre 24 y 30 horas después de la infección (hpi), con un mayor número de hematoxilina teñidas (es decir, púrpura-azul) neumococos visible dentro de la lesión. Microlesiones se caracterizaron por una morfología vacuolar, más densa eosina (rojo) tinción de los cardiomiocitos en las células inmediatamente adyacentes al sitio de la lesión, diplococos dentro de las lesiones, y una ausencia general de las células inmunes. Aproximadamente la mitad de las lesiones eran adyacentes a los vasos sanguíneos visibles. Entre 24 y 30 hpi microlesiones hicieron más numerosos y sustancialmente mayores. Al 30 hpi bacterias extracelulares menudo se podían ver el streaming de una lesión entre las células.
Visualizatien de S. pneumoniae Utilizando inmunofluorescencia microscopía
Para visualizar y confirmar que S. pneumoniae eran de hecho dentro de las lesiones, se utilizó la tinción de inmunofluorescencia para el serotipo 4 de polisacárido capsular que se produce por TIGR4 (Figura 2). Las imágenes capturadas mostraron la presencia de agregados apretadas y densas de S. pneumoniae en sitios microlesión.
Evidencia de cicatrización cardíaca
Tinción Picro Sirius Red se realizó en secciones cardíacas de ratones que habían sido rescatados con ampicilina y los controles no infectados. En antibióticos rescatado ratones convalecientes, hubo un aumento dramático en la presencia y la intensidad de la mancha Picro Sirius roja con bandas de transmisión de lo que parecen ser los antiguos sitios de lesión en los ventrículos (Figura 3). En contraste, los ventrículos en secciones de control fueron sin teñir que indica que la deposición de colágeno estaba ausente (No mostrado).
En conjunto, estos resultados demuestran la capacidad de visualizar microlesiones cardiacas en ratones con severa IPD y para acceder a la formación de cicatriz resultante en los ventrículos usando procedimientos histológicos estándar. Es importante destacar que microlesiones cardiacas son invariablemente vinculados a títulos altos de S. pneumoniae y el tiempo necesario para mediar su formación.
Figura 1: Detección de microlesiones en secciones cardiacas H & E manchadas Imágenes representativas (1.000 x) de microlesiones cardíacos observados en 24 hor y 30 horas después de la infección.. Barras de escala Negro corresponden a 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: detección de inmunofluorescencia de S. pneumoniae dentro de microlesiones cardíacas. microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra el serotipo 4 de polisacárido capsular (verde) confirmó la presencia de S. pneumoniae dentro de microlesiones cardíacas. Los núcleos se tiñeron de color azul con DAPI. Barra blanca escala corresponden a 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La deposición de colágeno en un antiguo sitio microlesión cardiaca en un ratón de convalecencia imagen Representante (200X) que muestra una Picro Sirius Red manchada microlesión cardíaco en el ventrículo de un ratón 5 días después de la intervención de antibióticos en el.la enfermedad neumocócica invasiva. El color rojo indica el depósito de colágeno. Barra de escala Negro corresponde a 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe, un método altamente reproducible para inducir S. pneumoniae mediada microlesiones cardíacas en ratones durante IPD y las técnicas para su visualización se demuestra. Los ratones se infectan con una dosis de bacterias que supera el umbral del sistema inmune para el despacho, dando lugar a bacteremia de alto grado, similar a la que ocurre durante la sepsis humana, y conduce a la translocación bacteriana eventual en el miocardio. Por razones aún desconocidas, S. pneumoniae en el corazón es capaz de replicarse undeterred por la respuesta inmune del huésped. Este es el tema de la investigación en curso y esta publicación puede facilitar otros investigadores en sus esfuerzos por participar.
Tinción H & E permite la visualización microlesión utilizando microscopía de luz estándar desde cardiomiocitos mancha de color rosa a rojo, mientras que microlesiones cardíacos y las bacterias dentro de la mancha azul a púrpura profundo. Este fuerte contraste permite una fácil detectien de las microlesiones en las etapas posteriores de la infección cuando las lesiones son más grandes. Con el fin de verificar la presencia de S. pneumoniae dentro de las microlesiones cardíacos, se realizó la microscopía de inmunofluorescencia utilizando antisuero contra el serotipo 4 polisacárido capsular que se lleva por TIGR4. Es importante destacar que, el anticuerpo anti-capsular específica que se debe utilizar depende del serotipo de la cepa neumocócica que se utiliza para el desafío experimental. Alternativamente, los investigadores también pueden utilizar anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente contra neumolisina, la toxina formadora de poros de S. pneumoniae, o que los componentes de detectar de la pared celular neumocócica (es decir, TEPC-15). Si bien estos anticuerpos detectan neumococos dentro del corazón, la experiencia sugiere que los anticuerpos contra el polisacárido capsular proporcionan las imágenes más convincentes 7.
S. pneumoniae formación microlesión cardiaca mediada requiere la interacción dela adhesina de unión a colina neumocócica proteína A con la proteína de host receptor de laminina para la adhesión bacteriana a las células endoteliales vasculares y la interacción de fosforilcolina de la pared celular de bacterias con el anfitrión activador de plaquetas receptor del factor de la transmigración a través de la célula bacteriana 7,8. Por tanto, es importante tener en cuenta que la formación de microlesión está estrechamente vinculada a la carga infecciosa y el tiempo, lo que aumenta la frecuencia y la duración de estas interacciones y permite tiempo para que las bacterias de replicar y lesiones visibles para desarrollar. Hemos determinado que una dosis infecciosa ip mayor que 1,0 x 10 3 UFC de S. cepa pneumoniae TIGR4 resulta en la muerte demasiado rápida del ratón y, como la formación de lesiones mal resultado. Por debajo de esta eliminación espontánea dosis infecciosa se produce en algunos ratones y en otros se observa retraso en la aparición de la enfermedad grave. Sin embargo, para los ratones expuestos a 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 entre 24 y 36 horas,Las lesiones se acumulan rápidamente en número y crecer en tamaño de forma continua hasta que el ratón se convierte moribunda. Por lo tanto, la dosis infecciosa de la cepa infectante debe ser titulada para replicar un estado similar de la enfermedad con un estado moribundo en desarrollo en no menos del 30 hpi. Es importante destacar que, hemos observado repetidamente la formación de lesión cardiaca en ratones que fueron infectados por vía intranasal con 1,0 x 10 7 CFU y vía intratraqueal con 1,0 x 10 5 UFC de TIGR4. Siguiendo estos desafío rutas desarrollo de enfermedad grave se produjo en momentos posteriores. También se observó la formación de microlesión con otras cepas virulentas de S. pneumoniae, tales como serotipo 2 aislado de D39, aunque a diferentes frecuencias. Por lo tanto, las lesiones no son un resultado de la infección por la ruta IP o específico para TIGR4, pero en lugar atados a la duración y la gravedad del episodio de la enfermedad. En esto le recomendamos para infectar ratones ip ya que esta ruta desafío ofrece el más alto grado de reproducibilidad. Si un diffcepa erent de S. pneumoniae se utiliza o se desea una ruta infecciosa diferente, los investigadores deben tratar de bacteriemia en niveles> 10 5 UFC ml de sangre por lo menos durante 24 horas.
Intervención antimicrobiana permite el estudio de los eventos que ocurren durante la convalecencia, modelando un ser humano en la unidad de cuidados intensivos. Vale la pena señalar que no todos los ratones sobreviven a pesar del tratamiento antimicrobiano y confirmaron la eliminación de bacterias. Los investigadores deben esperar que las tasas de supervivencia entre el 50-60% y, como tal, debe ajustar el tamaño de la cohorte de acuerdo para hacer frente a la pérdida de animales. El monitoreo regular de los animales después de 24 horas es muy recomendable para garantizar el cumplimiento Institucional aprobado protocolos animales. Tinción Picro Sirius Red es una técnica simple y estándar que se utiliza para visualizar la deposición de colágeno. En este documento, se demuestra cómo esta mancha puede ser utilizado para examinar la remodelación cardiaca en los ventrículos del corazón después de un infectiou traumáticaepisodio s. Picro Sirius Red fue elegido sobre otras técnicas comúnmente usadas para visualizar la deposición de colágeno, tales como "tricrómico de Masson", debido a la fuerte contraste que ofrecía entre el colágeno depositado y el tejido circundante. Esto ha demostrado ser tremendamente útil para evaluar la extensión de la deposición de colágeno del miocardio después de antibióticos en forma cuantitativa utilizando software como ImageJ.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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