Abstract
במהלך בקטרמיה Streptococcus pneumoniae יכול translocate פני האנדותל של כלי הדם לשריר הלב ויוצר פגיעות מלאות חיידקים דיסקרטיים מיקרוסקופיות (microlesions) כי הם ראויים לציון בשל היעדר חדירת תאי מערכת חיסון. בשל שחרורם של מוצרי cardiotoxic, S. pneumoniae בתוך microlesions הם חשבו לתרום לאי ספיקת הלב שלעתים קרובות נצפתה במהלך המחלה דלקת ריאות פולשנית רועמת במבוגרים. מסמך זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לזיהום עכבר ניסיוני שמוביל להיווצרות לשחזור microlesion לב בתוך 30 שעות. הדרכה ניתנת על זיהוי microlesion בhematoxylin & Eosin חלקי לב מוכתמים והבחנות מורפולוגיות בין microlesions המוקדם והמאוחר מודגשים. הדרכה ניתנת על פרוטוקול לאימות של ס ' pneumoniae בתוך microlesions באמצעות נוגדנים נגד פוליסכריד קופסית דלקת ריאות ומיקרוסקופיה immunofluorescent. אחרון, פרוטוקול להתערבות אנטיביוטי שמציל עכברים נגועים ולזיהוי וההערכה של היווצרות צלקת בלבם של עכברי הבראה מסופק. יחד, פרוטוקולים אלה יקלו על החקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס פלישת דלקת ריאות לב, מות cardiomyocyte, שיפוץ לב כתוצאה מחשיפה לS. pneumoniae, ואת התגובה החיסונית לpneumococci בלב.
Introduction
אשפוז של מבוגרים לנרכשו בקהילת דלקת ריאות (CAP) נושא סיכונים מתועדים לאירועים לבביים שליליים שתורמים לתמותה 1-4. במחקר שנערך לאחרונה על ידי אל-המדינה קוראלס et. סיבוכים לבביים נמצאו להיות קשורים ו / או אחראי למותם של 27% הקשורים לדלקת ריאות 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), הגורם השכיח ביותר של CAP ואלח דם 5, נקשר ישירות עם אירועים לבביים שליליים בכמה ש-19% מהחולים מבוגרים הודה 6. אירועים לבביים חמורים הקשורים לדלקת ריאות כוללים כישלון חדש או הורע ספיקת לב, הפרעות קצב, ואוטם שריר לב כדי להקטין תדירות של 6.
במאמר פתוגנים PLoS האחרון על ידי אל בראון ואח., S. pneumoniae נמצא מסוגל טרנסלוקציה דרך האנדותל של כלי דם של הלב, הכניסה לmyocardiuמ ', והיווצרותם של הנגעים דיסקרטיים שאינם מוגלתיים מיקרוסקופיים (microlesions) מלאים בחיידקים בחדרי הלב במהלך מחלה פולשנית דלקת ריאות (IPD) 7. עדות להיווצרות microlesion לב נצפתה בדגימות לב מפרימטים שאינם בני אדם ואנשים שנכנעו לזיהום דלקת ריאות. כמו כן, עכברים נגועים בניסוי reproducibly פיתחו microlesions לב. בעכברים, גודל microlesion ומספר היה מתואם חיובי עם המשך והחומרה של בקטרמיה, רמות טרופונין הלבבי בסרום, וelectrophysiology לב חריג. טרנסלוקציה חיידקים ללב נמצאה להתרחש דרך אותם המנגנונים אחראים לטרנסלוקציה של pneumococcus פני מחסום דם-המוח וההתפתחות של דלקת קרום מוח דלקת ריאות, כלומר הפלישה, חלבון קושר כולין בתיווך של תאי האנדותל של כלי דם בקולט Laminin וטסיות דם אופן תלוי הקולטן לגורם -activating 8. Microlesהיווצרות היון נדרשה גם pneumolysin רעלן דלקת ריאות יוצרים הנקבובית שנמצא להרוג cardiomyocytes 7.
microlesions לב דלקת ריאות נבדלים ממוגלתיות רקמות רכות ומורסות לב שנגרמות על ידי חיידקים גראם-חיובי אחרים, כולל Staphylococcus aureus. אלו מאופיינים במוקדים בודדים של חיידקים מוקפים נויטרופילים ו9,10 תצהיר הפיברין. Microlesions שהוקם על ידי ס ' pneumoniae הם קטנים בגודל, בפריסה לב מושפע, וחסר מחלחל תא חיסון. בשלבים המוקדמים של זיהום השלבים, microlesions נגרמים על ידי ס ' pneumoniae מופיע כאזורי של רקמה פגועה או מודלקת מזכירה את הסימנים פתולוגיים של cardiomyopathy. מונוציטים מסוימים עשויים להיות שנצפו בתקופה זו, אך נוכחותם היא קצרה מועד ונגעים הפכו במהירות נימקי במראה ומלא בחיידקים ובמקביל ממשיך משויףow בגודל עד מותו של בעלי החיים או התערבות מיקרוביאלית. חשוב לציין, בתוך 3 ימים של התערבות אנטיביוטיקה, חדירת תאי מערכת חיסון פזרני הוא ציין באתר הנגע לשעבר וזה מלווה בתצהיר קולגן חזק. שיפוץ לב דומה דווח להתרחש בעקבות אוטם יחד עם השלכות ארוכות טווח על תפקוד לב 11-15. לפיכך, microlesions מהווה הסבר אפשרי לאירועים הלבביים השלילי המתרחשים במהלך IPD ואולי השכיחות המוגברת של תמותה הקשורה ללב באנשי הבראה ששרדו את פרק המחלה.
במסמך זה, הוראה מסופקת על מודל העכבר הניסיוני של IPD והיווצרות נגע לב ויזואליזציה של microlesions לב בזיהום המוקדם ומאוחר שלבים. הפרוטוקול לזיהוי של תצהיר קולגן בבעלי חיים שנשמרו על ידי התערבות מיקרוביאלית הפגין. המטרה של מאמר זה היא facilitate המחקר של חוקרים אחרים על פתולוגיה דלקת ריאות החשובה והרומן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ניסויי העכבר היו נבדקו ואושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז בסן אנטוניו (# 13032-34-01C פרוטוקול). טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי דבקו משפט ציבורי 89-544 (צער בעלי החיים Act), על תיקוניו, הנחיות שירותי בריאות ציבוריות, והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (ארה"ב המחלקה לשירותי בריאות ואדם).
1. זיהום
- להשיג עכברי BALB / c משני המינים בין גילאי 10-12 שבועות של גיל.
הערה: ס זן pneumoniae זן 4 TIGR4 הוא לבודד קליני ארסי שכבר רצף 16. - לגדול TIGR4 במרק טוד יואיט על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עד שמגיע צפיפות אופטית (OD) 620 של 0.5 (המקביל ל 1.0 x 10 8 יחידות מושבה להרכיב מיליליטר / [CFU]). גלולה תרבות דלקת הריאות על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 3, XG 500 ולהסיר את supernatant באמצעות קו ואקום. להשעות ולדלל חיידקים עם תמיסת מלח סטרילית פוספט שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 1.0 x 10 4 CFU / ml.
- שימוש בחדר אינדוקציה, להרדים עכברים עם 2.5% isoflurane מתאדה בחמצן. אשר מדינה בהרדמה על ידי קמצוץ הבוהן עדין עם פינצטה הבוטה.
- מחזיק את העכבר בהרדמה בעורף וזקוף עם יד אחת, להזריק כל עכבר intraperitoneally (IP) עם ש '100 μl ההשעיה pneumoniae באמצעות מזרק עם מחט 27-30 מד (המקביל למינון אתגר של 1.0 x 10 3 CFU). הנח את גב העכבר בכלוב שלה. עכברים בדרך כלל מתעוררים 30-40 שניות לאחר הזרקה.
- לאפשר הזיהום להמשיך לפחות 24 (מוקדמת) או 30 שעות (מתקדמות).
- להרדים את העכברים על ידי CO 2 מחנק. בצע נקע בצוואר הרחם על מנת להבטיח עכבר נפטר. המתת חסד הוא אישור נוסף על ידי ההסרהשל הלב בשלב 1.6.
- לחטא את הזנב עם ספוגית אלכוהול ולגזור סעיף 2-3 מ"מ. אסוף 2 μl דם וסדרתי לדלל את הדם של פי 10 בPBS המכיל הפרין סודיום 1 פעמים U / ml חמש. דילולים צלחת סידוריים על צלחת אגר דם סויה tryptic דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. להסיק למחרת ממושבה סופר את הרמה של בקטרמיה.
- לשתק את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמה כירורגית. תרסיס החזה עם 70% אתנול ומייבשים. בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים לפתוח את חלל החזה, להסיר את כלוב הצלעות, ותחצה את הסרעפת כדי לחשוף את הלב וריאות. מספריים באמצעות לחתוך את כלי הדם קשורים ללב ולעדינות בלו הלב בזהירות כדי למנוע שטפי דם עם מלקחיים.
- יש לשטוף את הלב עם PBS ולאחר מכן למקם לקלטות אוסף דגימת רקמה כך שסעיפי העטרה היו מתקבלים בחתך רקמה. להטבעת פרפין, PLACe הקלטות ב 10% פתרון שנאגר פורמלין ולמחרת לשלוח להטבעת פרפין.
- לחלופין הקפאת הבזק באמצעות מתחם אוקטובר בתוך cryomold שהושם על קרח יבש.
2. ויזואליזציה של פצעים לב וPneumococci בתוך נגעים
- צמצם את חלקי לב-מוטבע פרפין כך ש4 חדרי הלב גלויים בכל קטע רקמה. חותך שקופיות בעובי של 5 מיקרומטר.
- שקופיות Deparaffinize וכתם עם hematoxylin וeosin (H & E) תוך שימוש בשיטות סטנדרטית 17.
- צפה בH & E מוכתמת חלקי לב באמצעות מיקרוסקופ אור בנמוך (100X, 200X) ו- (טבילת שמן: 400X, 1,000X) גבוהה בהגדלה. לאפיין את לב לנוכחות של microlesions בשריר הלב. כאן, לרכוש תמונות H & E באמצעות מיקרוסקופ 2 Zeiss Axioskop מצויד במטרת הצמצם 1.3 Plan-NEOFLUAR מספרית 100X.
הערה: בשלבים המוקדמים l לבesions מופלה על ידי הופעת ההפרש שלהם בצבע ובמקרים מסוימים הנוכחות של תאי מערכת חיסון (מונוציטים וגרנולוציטים) מה שנראים כמונוציטים. בנגעים מתקדמים, במיוחד אלה ראו בשעה 30, תאי מערכת חיסון הם נגעים כמו vacuole-נעדרו וגדולים הם נצפו במקום שלהם. חשוב לציין כי בעוד שזרם תא חיסון בשלבים המוקדמים של התפתחות נגע לב השלבים יכול להתרחש זה לא נראה דרישה.
3. Immunofluorescent מיקרוסקופי Pneumococci בתוך Microlesions
- לב סעיף בcryomolds עם microtome בעובי של 5 חלקי מיקרומטר ומקום על גבי שקופיות זכוכית טעונות חיובי. לאפשר סעיפי לב קפוא להפשיר ואוויר יבש. לתקן סעיפים במשך 10 דקות ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (pH 6.8-7.2 של 25 מעלות צלזיוס).
- לשטוף שקופיות (3x) בPBS במשך 5 דקות, permeabilize במשך 15 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS, ולאחר מכן לשטוף שוב בPBS.
- secti רקמת בלוק בשקופיות עם סרום עיזים 10% ב- PBS במשך שעה 1.
- יש לשטוף את שקופיות עם PBS, מכסים ודגירת סעיפי לב עם ארנב נגד זן 4 antiserum pneumococcus ב 1: 1000 ב- PBS עם סרום עיזים 10% לשעה 2 ב 37 ° C.
הערה: לבקרות שליליות חוקרים צריכים להשתמש antiserum ארנב הנאיבי - לאחר שטיפה עם PBS, מכסים ודגירה קטעים עם עז 10% בסרום-PBS עם נוגדן מצומדות FITC נגד ארנב עז בשעה 1: 2,000 למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- בעקבות ההוראה של היצרן, השתמש DAPI (4 ', 6 Diamidino-2-Phenylindole) בשעה 5 מ"ג / מיליליטר להדמיה של גרעינים אוקריוטים. לשטוף והר סעיפי רקמות עם FluorSave.
- לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת מיקרוסקופ confocal בהגדלה שניהם נמוכה וגבוהה. התאם את מספרי הצמצם בהתאם כדי להשיג תוצאות אופטימליות. כאן, לרכוש תמונות ניאון באמצעות מערכת confocal עם מטרת צמצם מספרית 60x 1.42.
- תתחיל עם ip הנגוע עכברים עם 1.0 x 10 3 CFU של TIGR4 כפי שצוין קודם לכן בשלב 1.
- החל מהשעה 30 לאחר פגיעת שעות, לנהל ip אמפיצילין הכיתה תרופות (80 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) ב100 מלוח μl כל 12 שעות במשך 36 שעות. לאסוף לבבות בנקודת הזמן הרצוי והתהליך כמתואר בשלב 1.6 להטבעת פרפין ורקמה, חתך.
5. קולגן הפקדת איתור
- שימוש בקסילן ושוטף אלכוהול מדורג עם קטעי מים, deparaffinize ורקמת מימה deionized תוך שימוש בשיטות סטנדרטית 17. פנק את החלקים עם 0.2% חומצת phosphomolybdic מימית במשך 5 דקות ולשטוף עם מים deionized במשך 5 דקות.
- חלקי כתם עם 0.1% אדומים סיריוס בחומצה picric לשעה 2 בטמפרטורת חדר.
- לשטוף חלקים ב0.01 N חומצה הידרוכלורית במשך 3 דקות ולשטוף באמצעות אתנול 70% דקות 1.
- Dehydrate החלקים באמצעות זהה אך הפוך סדר שוטף שלהותווה ב5.1, ליבש חלקי לב בהגדלת ומדורגים ריכוזי אתנול אז קסילן.
- סעיפי רקמות הר עם פתרון הרכבה להערכה מיקרוסקופית.
- כדי לזהות אזורים של בתצהיר קולגן, לבחון קטעי רקמה צבעוניים לאזורים של מכתים קריאה עמוק בהגדלה נמוכה וגבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור. אזור כלשהו בתוך חדרי הלב של הלב שהוא אדום הוא אזור שבו קולגן הופקד. אזורים ללא הכתם האדום הזה הם אתרים של רקמה בריאה החסרים בתצהיר קולגן. במסמך זה, לרכוש Picro סיריוס אדום תמונות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ מצויד מטרת צמצם מספרית 20X 0.5.
הערה: הכתמים האדומים אטריום ברקמות בריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ויזואליזציה של Microlesions על ידי H & E
microlesions לב נצפה בחדרי הלב של H & E המוכתמות חלקי לב מעכברים עם IPD הבא אתגר ה- IP שלהם עם TIGR4. איור 1 מדגימה את העלייה בגודל של נגעים אלה בין פוסט-זיהום 24 ו -30 שעות (HPI), עם מספר גדול יותר של hematoxylin pneumococci -stained (כחול-סגול כלומר,) גלוי בתוך הנגע. Microlesions התאפיינו במורפולוגיה כמו vacuole-, צפוף eosin (אדום) הכתמה של cardiomyocytes בתאים מייד בסמוך לאתר הנגע, diplococci בתוך הנגעים, והעדר כללי של תאי מערכת חיסון. כמחצית הנגעים היו בסמוך לכלי דם גלויים. בין 24 ו -30 HPI microlesions הפך רב יותר ומשמעותי יותר. ליום 30 בHPI חיידקים תאיים יכולים לעתים קרובות ניתן לראות הזרמה מנגע בין תאים.
Visualizatiבו של ס ' pneumoniae שימוש Immunofluorescent מיקרוסקופית
כדי להמחיש ולאשר שס pneumoniae אכן היה בתוך נגעים, כתמי immunofluorescent לזן 4 פוליסכריד קופסית שמופק על ידי TIGR4 (איור 2) היה בשימוש. תמונות שנתפסו הראו הנוכחות של אגרגטים צפופים ודחוס של ס ' pneumoniae בתוך אתרי microlesion.
עדות להצטלקות לב
צביעת Picro סיריוס האדומה בוצעה על סעיפי לב מעכברים שחולצו עם אמפיצילין ובקרות נגוע. בעכברי הבראה אנטיביוטיות הציל, חלה עלייה דרמטית בנוכחות והעצמה של כתם Picro סיריוס האדום עם להקות הזרמה ממה שנראה כאתרי נגע לשעבר בחדרי הלב (איור 3). בניגוד לכך, את החדרים בסעיפי שליטה היו בלא כתם המצביעים על כך בתצהיר קולגן נעדר (לא מוצג).
יחד תוצאות אלו מראות את היכולת לדמיין microlesions לב בעכברים עם IPD החמור ולגשת היווצרות צלקת כתוצאה בחדרי הלב באמצעות נהלים היסטולוגית סטנדרטיים. חשוב לציין, microlesions לבם תמיד צמוד לtiters הגבוה של ס ' pneumoniae והזמן דרוש כדי לתווך היווצרותם.
איור 1: איתור של microlesions בסעיפי לב H & E מוכתמת נציג תמונות (1,000X) של microlesions לב שנצפה ב 24 Hor ו -30 שעות שלאחר זיהום.. ברים בקנה מידה שחורה מתאים ל-10 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קבצים / ftp_upload / 52,590 / 52590fig2.jpg "/>
איור 2: זיהוי Immunofluorescent של ס ' pneumoniae בתוך microlesions לב. מיקרוסקופיה Immunofluorescent באמצעות נוגדן נגד 4 פוליסכריד סרוטיפ קופסית (ירוק) אישרה את נוכחותו של ס ' pneumoniae בתוך microlesions לב. הגרעינים הוכתמו כחולים עם DAPI. סרגל קנה מידה לבן מתאים ל-20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תצהיר קולגן באתר microlesion לב לשעבר בעכבר הבראה תמונת נציג (200X) מראה Picro סיריוס אדום מוכתם microlesion לב בחדר של עכבר 5 ימים לאחר התערבות אנטיביוטיקה ב.מחלת דלקת ריאות vasive. אדום מציין בתצהיר קולגן. סרגל קנה מידה שחור מתאים ל-20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדוח זה, שיטה לשחזור מאוד כדי לגרום לS. pneumoniae תיווך microlesions לב בעכברים במהלך IPD והטכניקות להדמיה שלהם באו לידי ביטוי. עכברים נגועים במינון של חיידקים שעולה סף של המערכת החיסונית לקבלת אישור, שמוביל לבקטרמיה בדרגה גבוהה, דומה לזו המתרחשת במהלך אלח דם אדם, ומוביל לטרנסלוקציה חיידק לשריר הלב. מסיבות שעדיין לא ידועות, S. pneumoniae בלב הוא מסוגל לשכפל לא נרתע מהתגובה החיסונית המארח. זה הוא הנושא של חקירה מתמשכת ופרסום זה עשוי להקל על חוקרים אחרים במאמציהם להשתתף.
צביעת H & E מאפשרת ראית microlesion באמצעות מיקרוסקופ אור רגילה מאז ורוד כתם cardiomyocytes לאדום, ואילו microlesions לב והחיידקים בתוך כתם כחול לסגול עמוק. ניגוד חריף זה מאפשר detecti קלעל של microlesions בשלבים מאוחר יותר של זיהום כאשר הנגעים גדולים יותר. כדי לוודא את נוכחותו של ס ' pneumoniae בתוך microlesions הלב, מיקרוסקופיה immunofluorescent באמצעות antiserum נגד זן 4 פוליסכריד קופסית שמתבצעת על ידי TIGR4 בוצעה. חשוב לציין, הנוגדן אנטי קופסית הספציפית שיש להשתמש תלוי בסרוטיפ של זן דלקת הריאות המשמש לאתגר ניסיוני. לחלופין, חוקרים יכולים גם להשתמש בנוגדנים חד-שבטיים זמינים מסחרי נגד pneumolysin, רעל יוצרים הנקבובית של ס ' pneumoniae, או רכיבים המזהים את דופן תא דלקת ריאות (כלומר, TEPC-15). בעוד נוגדנים אלה לזהות pneumococci בתוך הלב, ניסיון העבר מצביע על כך שנוגדנים נגד פוליסכריד קופסית לספק תמונות משכנעות ביותר 7.
S. pneumoniae היווצרות microlesion לב בתיווך מחייבת את האינטראקציה שלadhesin דלקת ריאות כולין מחייב חלבון עם קולט Laminin חלבון מארח להידבקות חיידקים לתאי האנדותל של כלי דם והאינטראקציה של קיר phosphorylcholine תא חיידק עם קולטן גורם מארח טסיות דם-הפעלה לגלגול חיידקים דרך התא 7,8. לכן חשוב לציין כי היווצרות microlesion קשורה קשר הדוק לניטל זיהומיות וזמן, דבר המגדיל את התדירות ומשך זמן של אינטראקציות אלה ומאפשר זמן לחיידקים כדי לשכפל ונגעים גלויים לפתח. אנחנו קבענו בעבר כי מינון זיהומיות ip העולה על 1.0 x 10 3 CFU של ס ' זן pneumoniae TIGR4 מסתיים במוות מהיר מדי של העכבר וכהיווצרות נגע עניה תוצאה. להלן אישור מינון זיהומיות זה ספונטני מתרחש בכמה עכברים ובאחרים התגובה מאוחרת של מחלה קשה הוא ציינה. עם זאת, לעכברי תיגר עם 1.0 x 10 3 CFU של TIGR4 בין 24 ו -36 שעות,נגעים במהירות לצבור במספר ולגדול בגודל ברציפות עד לעכבר הופך גוסס. כך, המינון זיהומיות של זן ההדבקה צריך להיות טיטרציה לשכפל מדינה דומה של מחלה עם מדינה גוססת פיתוח בלא פחות מ -30 HPI. חשוב לציין, שראינו שוב ושוב היווצרות נגע לב בעכברים שהיו נגועים intranasal עם 1.0 x 10 7 CFU וintratracheally עם 1.0 x 10 5 CFU של TIGR4. בעקבות פיתוח מסלולים אלה אתגר של מחלה חמורה התרחש בנקודות זמן מאוחר יותר. אנו הבחנו גם בהיווצרות microlesion עם זנים אלימים אחרים של ס ' pneumoniae, כגון סרוטיפ 2 D39 בודד, אם כי בתדרים שונים. לפיכך, נגעים אינם תוצאה של הזיהום בדרך ip או ספציפית לTIGR4, אך במקום זאת קשור למשך וחומרת המחלה הפרק. במסמך זה אנו ממליצים להדביק ip עכברים מאז מסלול אתגר זה מציע את התואר הגבוה ביותר של שחזור. אם הבדלזן erent של ס ' pneumoniae משמש או מסלול זיהומיות שונה הוא רצוי, חוקרים צריכים לשאוף לבקטרמיה ברמות> 10 מיליליטר 5 CFU של דם לפחות 24 שעות.
התערבות מיקרוביאלית מאפשרת הלימוד של אירועים המתרחשים בתקופת החלמה, דוגמנות אנושית בהגדרת יחידה לטיפול נמרצת. ראוי לציין כי לא כל העכברים לשרוד למרות טיפול אנטי-מיקרוביאלי ואישרו שחרור חיידקים. חוקרים צריכים לצפות שיעורי הישרדות בין 50-60% ובתור שכזו צריכה להתאים את גודל המדגם בהתאם להתמודד עם האובדן של בעלי חיים. ניטור קבוע של בעלי חיים לאחר 24 שעות מומלץ ביותר על מנת להבטיח עמידה במוסדית אישר פרוטוקולים של בעלי חיים. צביעת Picro סיריוס האדומה היא טכניקה פשוטה וסטנדרטית המשמשת כדי לחזות בתצהיר קולגן. במסמך זה, הוא הראה כיצד כתם זה יכול לשמש כדי לבחון שיפוץ לב בחדרי הלב של הלב הבא infectiou טראומטיהפרק של. Picro סיריוס אדום נבחר על פני שיטות נפוצות אחרות כדי לחזות בתצהיר קולגן, כגון "Trichrome הכתם של האסון", בגלל הניגוד החריף הציע בין קולגן שהופקד והרקמה הסובבת. זה הוכיח להיות מאוד שימושי בעת הערכת היקף בתצהיר קולגן שריר לב לאחר אנטיביוטיקה בצורה כמותית באמצעות תוכנה כגון ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
