Abstract
Au cours de la bactériémie à Streptococcus pneumoniae peut déplacer à travers l'endothélium vasculaire dans le myocarde et former bactéries remplis lésions microscopiques discrets (microlésions) qui sont remarquables en raison de l'absence d'infiltration de cellules immunitaires. En raison de leur libération de produits cardiotoxiques, S. pneumoniae dans les microlésions sont pensés pour contribuer à l'insuffisance cardiaque qui est fréquemment observée au cours de la maladie invasive à pneumocoques chez les adultes fulminate. Ici, on fait preuve d'un protocole pour l'infection expérimentale de la souris qui conduit à la formation de reproductibles microlesion cardiaque dans les 30 heures. L'enseignement est dispensé sur l'identification des microlesion dans hématoxyline & éosine sections cardiaques colorées et les distinctions morphologiques entre microlésions début et la fin sont mis en évidence. Instruction est prévu sur un protocole de vérification de S. pneumoniae dans les microlésions utilisant des anticorps contre le pneumocoque et le polysaccharide capsulairemicroscopie immunofluorescence. Enfin, un protocole d'intervention antibiotique qui sauve souris infectées et pour la détection et l'évaluation de la formation de cicatrices dans les cœurs de souris convalescence est fourni. Ensemble, ces protocoles seront faciliter les enquêtes sur les mécanismes moléculaires sous-jacents invasion cardiaque à pneumocoques, la mort des cardiomyocytes, le remodelage cardiaque à la suite d'une exposition à S. pneumoniae, et la réponse immunitaire à la pneumocoques dans le cœur.
Introduction
L'hospitalisation des adultes pour la pneumonie communautaire (PAC) comporte un risque documentée d'événements cardiaques indésirables qui contribue à la mortalité 1-4. Dans une étude récente de Corrales-Medina et al. Complications cardiaques ont été trouvés à être associé et / ou responsables de 27% des décès par pneumonie associée à trois. Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), la cause la plus commune de la PAC et de la septicémie 5, a été directement associé à des événements cardiaques indésirables dans autant que 19% des patients adultes admis 6. Événements cardiaques indésirables associés à la pneumonie comprennent l'insuffisance nouvelle ou aggravée cardiaque congestive, arythmies, l'infarctus du myocarde et par ordre de fréquence décroissante 6.
Dans un article récent PLoS Pathogens par Brown et al., S. pneumoniae a été trouvé être capable de translocation à travers l'endothélium vasculaire cardiaque, l'entrée dans la myocardium, et la formation de lésions microscopiques non purulentes discrètes (microlésions) remplis de bactéries dans les ventricules cours de la maladie invasive à pneumocoque (IIP) 7. Preuve de la formation de microlesion cardiaque a été observée dans les échantillons cardiaques à partir des primates non humains et les personnes qui avaient succombé à l'infection pneumococcique. De même, les souris infectés expérimentalement reproductible développés microlésions cardiaques. Chez les souris, la taille et le nombre de microlesion était positivement corrélée avec la durée et la gravité de la bactériémie, les niveaux de troponine cardiaque dans le sérum et l'électrophysiologie cardiaque aberrante. Translocation bactérienne dans le cœur a été trouvé à se produire à travers les mêmes mécanismes responsables de la translocation du pneumocoque à travers la barrière hémato-encéphalique et le développement de la méningite à pneumocoques, ce est à dire, la protéine de liaison à la choline Une invasion médiée par des cellules endothéliales vasculaires dans un récepteur de la laminine et des plaquettes activant le récepteur du facteur manière dépendante 8. Microlesformation d'ions également nécessaire la pneumolysine pneumococcique toxine porogène qui a été trouvé pour tuer les cardiomyocytes 7.
Microlésions cardiaques pneumocoques sont distinctes de la purulente des tissus mous et des abcès cardiaques qui sont causées par d'autres bactéries Gram-positives, y compris Staphylococcus aureus. Ceux-ci sont caractérisés par un seul des foyers de bactéries entourées par les neutrophiles et les dépôts de fibrine 9,10. Microlésions formé par S. pneumoniae sont de plus petite taille, répartis dans un cœur touché, et manquent des infiltrats de cellules immunitaires. Au cours des premiers stades de l'infection, microlésions provoquées par S. pneumoniae apparaissent comme des zones de tissus endommagés ou enflammée rappelle les signes pathologiques de la cardiomyopathie. Certains monocytes peuvent être observés pendant cette période, mais leur présence est de courte durée et des lésions nécrotiques devenir rapidement en apparence et rempli de bactéries tout en continuant à grow taille jusqu'à la mort de l'animal ou de l'intervention antimicrobienne. Il est important, dans les 3 jours d'intervention antibiotique, profuse infiltration de cellules immunitaires est observée à l'ancien site de la lésion et cela est accompagné par le dépôt de collagène robuste. Remodelage cardiaque similaire a été signalé à se produire suite à un infarctus le long avec des conséquences durables sur la fonction cardiaque 11-15. Ainsi, microlésions sont une explication possible pour les événements cardiaques indésirables qui se produisent pendant IPD et éventuellement l'augmentation de l'incidence de la mortalité cardiaque chez les personnes liées de convalescence qui ont survécu à l'épisode de la maladie.
Ici, l'enseignement est dispensé sur le modèle expérimental chez la souris des IPD et la formation de la lésion cardiaque et la visualisation des microlésions cardiaques au début et à la fin stades de l'infection. Le protocole pour la détection de dépôts de collagène chez les animaux qui ont été sauvées par la antimicrobien est démontrée. Le but de cet article est de faciliter la recherche d'autres enquêteurs sur cette importante et nouvelle pathologie pneumocoque.
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Protocol
NOTE: Toutes les expériences de souris ont été examinées et approuvées par l'Institutional Animal Care et l'utilisation des comités de l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio (protocole # 13032-34-01C). Les soins et protocoles expérimentaux adhéré à la Public Law 89-544 (Animal Welfare Act) et ses amendements, directives des services de santé publics, et le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (US Department of Health and Human Services).
1. Infection
- Obtenir des souris BALB / c des deux sexes âgés de 10 à 12 semaines d'âge.
REMARQUE: S. pneumoniae sérotype 4 souche TIGR4 est un isolat clinique virulente qui a été séquencé 16. - TIGR4 croître dans le bouillon Todd-Hewitt à 37 ° C dans 5% de CO2 jusqu'à atteindre une densité optique (DO) de 0,5 620 (correspondant à 1,0 x 10 8 unités formant des colonies [CFU / ml)]. Pellet la culture pneumococcique par centrifugation pendant 10 minutes à 3, 500 xg et retirer le surnageant en utilisant une ligne de vide. Suspension de bactéries et diluer avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) à une concentration finale de 1,0 x 10 4 cfu / ml.
- L'utilisation d'une chambre d'induction, anesthésier les souris avec 2,5% d'isoflurane dans de l'oxygène vaporisé. Confirmez état anesthésié par douce pincée d'orteil avec des pincettes contondants.
- En tenant la souris anesthésiée par sa nuque et droit avec une main, injecter chaque souris par voie intrapéritonéale (ip) avec 100 pi de la S. pneumoniae suspension en utilisant une seringue avec une aiguille de calibre 27 à 30 (correspondant à une dose de 1,0 x 10 3 CFU de provocation). Placez le dos de la souris dans sa cage. Souris réveillent généralement 30-40 sec après l'injection.
- Laisser l'infection se dérouler pendant au moins 24 (début) ou 30 (avancé) h.
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2. Effectuer dislocation cervicale pour assurer la souris a décédée. L'euthanasie est en outre confirmée par éliminationdu coeur à l'étape 1.6.
- Désinfectez la queue avec un tampon imbibé d'alcool et couper une section de 2-3 mm. Recueillir 2 ul de sang et le sang dilué en série 10 fois dans du PBS contenant de l'héparine de sodium 1 U / ml à cinq reprises. Plate dilutions en série sur une plaque de gélose au sang de soja tryptique et incuber une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2. Le lendemain extrapoler à partir de la colonie compte le niveau de bactériémie.
- Immobiliser la souris dans une position en décubitus dorsal sur une plate-forme chirurgicale. Pulvériser la poitrine avec 70% d'éthanol et sécher. Avec des ciseaux et des pinces chirurgicales ouvrent la cavité thoracique, retirez la cage thoracique, et sectionner le diaphragme pour exposer le cœur et les poumons. L'aide de ciseaux coupent les vaisseaux sanguins reliés au cœur et Accise doucement le coeur avec soin pour éviter des ecchymoses avec une pince.
- Rincer le cœur avec du PBS et placer dans des spécimens de tissu de collecte de cassettes telles que des coupes coronales seraient obtenues pendant le sectionnement du tissu. Pour la paraffine, plaCE les cassettes dans 10% solution tamponnée-formol et le lendemain pour envoyer inclusion dans la paraffine.
- Alternativement gel flash utilisant octobre composé dans un cryomoule qui a été placé sur de la glace sèche.
2. Visualisation des lésions cardiaques et les pneumocoques dans les lésions
- Couper sections cardiaques paraffine de sorte que les quatre chambres du coeur sont visibles dans chaque section de tissu. Couper diapositives à une épaisseur de 5 um.
- Déparaffiner et taches diapositives avec hématoxyline & éosine (H & E) en utilisant des méthodes standard 17.
- Voir H & E colorées sections cardiaques en utilisant un microscope optique à basse (100X, 200X) et haute (immersion d'huile: 400X, 1,000X) grossissements. Caractériser les coeurs de la présence de microlésions dans le myocarde. Ici, acquérir H & E des images en utilisant un microscope Zeiss Axioskop 2 équipé d'un objectif numérique 100X 1.3 ouverture Plan-Neofluar.
NOTE: À stades précoces l cardiaqueesions sont discriminés par leur différentiel apparence colorée et dans certains cas, la présence de cellules immunitaires (monocytes et granulocytes) ce qui semble être les monocytes. Dans les lésions avancées, en particulier ceux observés à 30 h, les cellules immunitaires sont des lésions des vacuoles comme absents et grands sont observés à leur place. Il est important de noter que si l'afflux des cellules immunitaires au cours des stades précoces du développement de lésion cardiaque peut se produire, il ne semble pas être une exigence.
3. immunofluorescence Microscopie pour les pneumocoques dans les microlésions
- Section cœur cryomoules avec microtome sur une épaisseur de 5 sections de um et placer sur des lames de verre chargées positivement. Permettre aux sections cardiaques décongeler et l'air sec. Fixer les sections pendant 10 minutes dans 10% de formaline tamponnée neutre (pH 6.8 à 7.2 à 25 ° C).
- Laver les lames (3x) dans du PBS pendant 5 min, perméabiliser pendant 15 min dans 0,2% de Triton X-100 dans du PBS, puis laver à nouveau dans du PBS.
- secti de tissus de bloc sur sur des lames avec 10% de sérum de chèvre dans du PBS pendant 1 heure.
- Rincer les lames avec du PBS, couvrir et laisser incuber sections cardiaques de lapin anti-pneumocoque de sérotype 4 antisérum au 1: 1000 dans du PBS avec du sérum de chèvre 10% pendant 2 heures à 37 ° C.
NOTE: Pour les contrôles négatifs enquêteurs doivent utiliser naïve antisérum de lapin - Après lavage avec du PBS, couvrir et incuber les sections avec 10% de sérum de chèvre-PBS avec de chèvre anti-anticorps de lapin conjugué à FITC à 1: 2000 pendant 30 min à 37 ° C.
- Suivant les instructions du fabricant, utiliser DAPI (4 ', 6 Diamidino-2-phénylindole) à 5 mg / ml pour la visualisation des noyaux eucaryotes. Laver et monter les coupes de tissus avec FluorSave.
- Acquérir des images fluorescentes en utilisant un système de microscope confocal à un grossissement à la fois basse et haute. Réglez l'ouverture numérique en conséquence pour obtenir des résultats optimaux. Ici, acquérir des images fluorescentes en utilisant un système confocal avec un objectif d'ouverture numérique 1,42 60X.
- Commencez avec des souris infectées par ip 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 comme indiqué précédemment à l'étape 1.
- À partir de 30 h après l'infection, administrer pharmaceutique ampicilline grade ip (80 mg / kg de poids corporel) dans 100 pi de solution saline toutes les 12 heures pendant 36 heures. Recueillir les cœurs au point de temps désiré et procédé tel que décrit dans l'étape 1.6 pour inclusion dans la paraffine et le tissu, la coupe.
5. Le dépôt de collagène de détection
- Utilisation de xylène et lavages d'alcool classés avec des sections de l'eau désionisée, Déparaffiner et de tissus d'hydrate utilisant des méthodes standards 17. Traiter sections avec de l'acide aqueuse à 0,2% phosphomolybdique pendant 5 minutes et rincer à l'eau déminéralisée pendant 5 min.
- sections de tache avec 0,1% Sirius Rouge dans l'acide picrique pendant 2 heures à la température ambiante.
- Laver les coupes dans acide chlorhydrique 0,01 N pendant 3 minutes et rincer à l'aide de 70% d'éthanol pendant 1 min.
- DehydraTe les sections utilisant le identiques, mais afin de lavages à celle décrite au paragraphe 5.1 inverser, déshydrater sections cardiaques à augmenter et les concentrations d'éthanol gradué puis xylène.
- Coupes de tissus Mont avec une solution de montage pour évaluation microscopique.
- Pour identifier les régions du dépôt de collagène, d'examiner des coupes de tissus colorés pour les zones de coloration de lecture profonde sous grossissement basse et haute en utilisant un microscope optique. Toute zone dans les ventricules du cœur qui est rouge est une zone où le collagène a été déposé. Les zones sans cette tache rouge sont des sites de tissus sains qui ne ont pas le dépôt de collagène. Ici, acquérir Picro Sirius Red images colorées en utilisant un microscope équipé d'un objectif d'ouverture numérique 20X 0,5.
REMARQUE: Les taches rouges atrium dans les tissus sains.
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Representative Results
Visualisation des microlésions par H & E
Microlésions cardiaques ont été observés dans les ventricules de H & E colorées sections cardiaques de souris avec IPD après leur défi ip avec TIGR4. La figure 1 montre l'augmentation de la taille de ces lésions entre post-infection 24 et 30 h (HPI), avec une plus grande nombre de hématoxyline -stained (c.-à-bleu-violet) pneumocoques visible au sein de la lésion. Microlésions sont caractérisées par une morphologie analogue à vacuole, plus dense éosine (rouge) coloration des cardiomyocytes dans les cellules immédiatement adjacentes au site de la lésion, diplocoques dans les lésions, et une absence générale de cellules immunitaires. Environ la moitié des lésions étaient adjacents aux vaisseaux sanguins visibles. Entre 24 et 30 hpi microlésions devenus plus nombreux et beaucoup plus importante. Au 30 hpi bactéries extracellulaires pourraient souvent être vu en streaming à partir d'une lésion entre les cellules.
Visualizatisur de S. pneumoniae Utilisation immunofluorescence Microscopie
Pour visualiser et confirmer que S. pneumoniae était bien dans les lésions, la coloration immunofluorescente pour le sérotype 4 polysaccharide capsulaire produite par TIGR4 (figure 2) a été utilisé. Les images capturées ont montré la présence d'agrégats serrés et denses de S. pneumoniae dans les sites de microlesion.
Preuve de cicatrices cardiaque
Picro Rouge Sirius coloration a été effectuée sur des coupes cardiaques de souris qui avaient été récupérés avec de l'ampicilline et témoins non infectés. Chez les souris de convalescence aux antibiotiques sauvé, il y avait une augmentation spectaculaire de la présence et l'intensité de la tache Picro Sirius Rouge avec des bandes en streaming à partir de ce qui semble être les anciens sites de lésion dans les ventricules (figure 3). En revanche, dans les ventricules sections de commande sont non colorées, indiquant que le dépôt de collagène était absent (Pas montré).
Ensemble, ces résultats démontrent la capacité de visualiser des microlésions cardiaques chez des souris avec de graves IPD et d'accéder à la formation de cicatrice résultante dans les ventricules en utilisant des procédures histologiques standard. Surtout, microlésions cardiaques sont toujours liés à des titres élevés d'S. pneumoniae et le temps nécessaires pour atténuer leur formation.
Figure 1: Détection des microlésions dans les sections cardiaques H & E colorées images représentatives (1,000X) de microlésions cardiaques observés à 24 hor et 30 h post infection.. Barres d'échelle noir correspondent à 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: la détection par immunofluorescence de S. pneumoniae dans les microlésions cardiaques. microscopie par immunofluorescence en utilisant un anticorps contre le sérotype 4 polysaccharide capsulaire (vert) a confirmé la présence de S. pneumoniae dans les microlésions cardiaques. Les noyaux ont été colorées en bleu avec du DAPI. Blanc barre d'échelle correspond à 20 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: dépôt de collagène sur un ancien site de microlesion cardiaque chez une souris de convalescence Représentant l'image (200X) montrant une Picro Sirius Rouge teinté microlesion cardiaque dans le ventricule d'une souris cinq jours après l'intervention antibiotique dans.maladie pneumococcique invasive. Rouge indique le dépôt de collagène. Noir barre d'échelle correspond à 20 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, une méthode hautement reproductible pour induire S. pneumoniae médiée microlésions cardiaques chez des souris au cours IPD et les techniques pour leur visualisation est démontrée. Les souris sont infectées avec une dose de bactéries qui dépasse le seuil du système immunitaire pour le dédouanement, conduisant à une bactériémie de haute qualité, similaire à celle qui se produit pendant le sepsis humain, et conduit à la translocation bactérienne éventuelle dans le myocarde. Pour des raisons encore inconnues, S. pneumoniae dans le cœur est capable de se répliquer sans se laisser décourager par la réponse immunitaire de l'hôte. Ce est l'objet de l'enquête en cours et cette publication pourrait faciliter d'autres chercheurs dans leurs efforts pour participer.
Coloration H & E permet la visualisation de microlesion utilisant la microscopie optique standard depuis cardiomyocytes tache rose au rouge, alors que microlésions cardiaques et les bactéries dans le bleu de la tache au violet foncé. Ce contraste permet detecti facilesur des microlésions à des stades ultérieurs de l'infection lorsque les lésions sont plus grandes. Afin de vérifier la présence de S. pneumoniae dans les microlésions cardiaques, la microscopie par immunofluorescence en utilisant un antisérum contre le sérotype 4 polysaccharide capsulaire qui est porté par TIGR4 a été effectuée. Fait important, l'anticorps anti-capsulaire spécifique qui doit être utilisé dépend du sérotype de la souche pneumococcique qui est utilisé pour la provocation expérimentale. Alternativement, les enquêteurs peuvent également utiliser des anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce contre la pneumolysine, la toxine de formation de pores de S. pneumoniae, ou qui détectent les composants de la paroi cellulaire pneumococcique (par exemple, TEPC-15). Bien que ces anticorps détectent pneumocoques dans le cœur, l'expérience passée montre que les anticorps contre le polysaccharide capsulaire fournissent les images les plus irrésistibles 7.
S. pneumoniae formation de microlesion cardiaque médiation nécessite l'interaction dela choline pneumococcique adhésine de liaison de la protéine A avec la protéine de l'hôte récepteur laminine pour l'adhérence bactérienne aux cellules endotheliales vasculaires et de l'interaction de la paroi cellulaire des bactéries phosphorylcholine avec le récepteur du facteur d'activation des plaquettes hôte pour la transmigration à travers la cellule bactérienne 7,8. Il est donc important de noter que la formation de microlesion est étroitement liée à la charge et le temps infectieuse, ce qui augmente la fréquence et la durée de ces interactions et permet de temps pour les bactéries de se répliquer et de lésions visibles à se développer. Nous avons déjà déterminé que la dose infectieuse ip supérieure à 1,0 x 10 3 UFC de S. pneumoniae souche TIGR4 entraîne la mort trop rapide de la souris et comme un pauvre formation de lésions de résultat. En dessous de cette dose infectieuse jeu spontané chez certaines souris et dans d'autres apparition tardive de la maladie grave est observée. Pourtant, pour les souris éprouvées avec 1,0 x 10 3 UFC de TIGR4 entre 24 et 36 heures,lésions se accumulent rapidement en nombre et croissent en taille continuellement jusqu'à ce que la souris devient moribonde. Ainsi, la dose infectieuse de la souche infectante besoin d'être titrée à reproduire un état de maladie similaire avec un état moribond en développement dans pas moins de 30 HPI. Surtout, nous avons observé à plusieurs reprises la formation de lésions cardiaques chez des souris qui ont été infectées par voie intranasale avec 1,0 x 10 7 CFU et intra-trachéale avec 1,0 x 10 5 CFU de TIGR4. Suite à ces défi itinéraires développement de la maladie grave se est produite à des moments plus tard. Nous avons également observé la formation de microlesion avec d'autres souches virulentes de S. pneumoniae, comme isolat de sérotype 2 D39, mais à des fréquences différentes. Ainsi, les lésions ne sont pas à la suite de la voie d'infection IP ou spécifique à TIGR4, mais liés à la durée et de la gravité de l'épisode de la maladie. Ici, nous conseillons d'infecter des souris ip depuis cette route de défi offre le plus haut degré de reproductibilité. Si un diffsouche de S. érents pneumoniae est utilisé ou un itinéraire infectieuse différente est souhaitée, les enquêteurs devraient viser bactériémie à des niveaux> 10 5 UFC ml de sang pendant au moins 24 h.
Intervention antimicrobienne permet l'étude des événements qui se produisent pendant la convalescence, la modélisation un être humain dans le cadre de l'unité de soins intensifs. Il est à noter que toutes les souris survivent malgré un traitement antimicrobien et confirmés clairance bactérienne. Les enquêteurs doivent se attendre à des taux de survie entre 50-60% et en tant que telle devrait ajuster la taille de la cohorte en conséquence pour faire face à la perte d'animaux. Un suivi régulier des animaux après 24 heures est fortement recommandé d'assurer le respect institutionnel approuvé les protocoles d'animaux. Picro Sirius Rouge coloration est une technique simple et standard utilisé pour visualiser le dépôt de collagène. Ici, il est démontré comment cette tache peut être utilisé pour examiner le remodelage cardiaque dans les ventricules du cœur suite à une infectiou traumatiques épisode. Picro Sirius Rouge a été choisi sur les autres techniques couramment utilisées pour visualiser le dépôt de collagène, comme «trichrome de Masson», parce que le contraste aigu qu'elle offrait entre le collagène déposé et les tissus environnants. Cela se est avéré être extrêmement utiles pour évaluer l'étendue de dépôt de collagène myocardique suivante antibiotique de façon quantitative à l'aide de logiciels tels que ImageJ.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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