Abstract
خلال تجرثم الدم العقدية الرئوية يمكن نقل من عبر البطانة الوعائية في عضلة القلب وتشكيل البكتيريا مليئة منفصلة آفات مجهرية (microlesions) التي هي ملحوظا نظرا لعدم وجود تسلل الخلايا المناعية. بسبب إطلاق سراحهم من المنتجات للقلب، S. ويعتقد الرئوية ضمن microlesions للمساهمة في فشل القلب الذي كثيرا ما لوحظ خلال إنفجر داء المكورات الرئوية الغازية في البالغين. وهنا يتجلى بروتوكول للعدوى الماوس التجريبي الذي يؤدي إلى استنساخه تشكيل آفة دقيقة قلبية في غضون 30 ساعة. وتقدم تعليمات حول تحديد آفة دقيقة في الهيماتوكسيلين ويوزين أقسام القلب الملون والفروق الشكلية بين microlesions المبكرة والمتأخرة وتسليط الضوء عليها. يتم توفير التعليمات على بروتوكول للتحقق من S. الرئوية ضمن microlesions باستخدام الأجسام المضادة ضد المكورات الرئوية السكاريد المحفظة والمجهري مناعي. وأخيرا، يتم توفير بروتوكول للتدخل المضادات الحيوية التي تنقذ الفئران المصابة وللكشف وتقييم تشكيل ندبة في قلوب الفئران نقاهة. معا، وهذه البروتوكولات تسهيل التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الغزو القلب الرئوية، والموت cardiomyocyte، وإعادة عرض القلب نتيجة التعرض لS. الرئوية، والاستجابة المناعية للالمكورات الرئوية في القلب.
Introduction
الاستشفاء من الكبار لالمكتسبة من المجتمع الالتهاب الرئوي (CAP) يحمل مخاطر موثقة للأحداث القلب السلبية التي تساهم في وفيات 1-4. . تم العثور على المضاعفات القلبية في دراسة حديثة أجرتها كوراليس-المدينة المنورة آخرون أن يرتبط و / أو مسؤولة عن 27٪ من الوفيات المرتبطة بالتهاب رئوي 3. العقدية الرئوية (المكورة الرئوية)، والسبب الأكثر شيوعا لCAP والإنتان 5، ارتبط مباشرة مع الأحداث السلبية في القلب ما يصل إلى 19٪ من المرضى البالغين اعترف 6. الأحداث القلب السلبية المرتبطة بالتهاب رئوي تشمل فشل جديد أو ساءت القلب الاحتقاني، عدم انتظام ضربات القلب، واحتشاء عضلة القلب في المرتبة الثانية من حيث التردد 6.
في مقال بلوس مسببات الأمراض الأخيرة من جانب براون وآخرون، تم العثور S. الرئوية لتكون قادرة على النبات من خلال البطانة الوعائية القلبية، دخول myocardiuم، وتشكيل آفات مجهرية غير صديدي منفصلة (microlesions) مليئة البكتيريا في البطينين خلال داء المكورات الرئوية الغازية (IPD) 7. وقد لوحظ دليل على تشكيل آفة دقيقة في القلب في القلب عينات من الرئيسيات غير البشرية والأفراد الذين قد استسلمت للعدوى المكورات الرئوية. وبالمثل، الفئران المصابة تجريبيا وضعت بتكاثر microlesions القلب. في الفئران، فقد ارتبط حجم آفة دقيقة وعدد بإيجابية مع مدة وشدة تجرثم الدم، ومستويات التروبونين القلبي في الأمصال، والكهربية القلب الشاذة. تم العثور على النبات البكتيرية في قلب أن يحدث من خلال نفس الآليات المسؤولة عن النبات من المكورات الرئوية عبر حاجز الدم في الدماغ وتطوير التهاب السحايا بالمكورات الرئوية، أي بروتين ملزمة الكولين وغزو بوساطة خلايا بطانة الأوعية الدموية في مستقبلات Laminin وصفائح الدم -activating مستقبلات عامل بطريقة تعتمد 8. Microlesيتطلب تشكيل أيون أيضا إلى تشكيل المسام المكورات الرئوية السم pneumolysin أنه تم العثور على قتل العضلية (7).
microlesions القلب الرئوية تختلف من قيحية لينة الأنسجة وخراجات القلب التي تنتج عن غيرها من بكتيريا إيجابية الغرام بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية. وتتميز هذه البؤر من قبل واحد من البكتيريا وتحيط بها العدلات وترسب الفيبرين 9،10. Microlesions التي شكلتها S. الرئوية هي أصغر في الحجم، موزعة في جميع أنحاء قلب المتضررين، وتفتقر تتسرب الخلايا المناعية. خلال المراحل المبكرة من العدوى، microlesions الناجمة عن S. الرئوية تبدو وكأنها مناطق التالفة أو الملتهبة الأنسجة تذكر من علامات المرضية من اعتلال عضلة القلب. يمكن ملاحظة بعض وحيدات خلال هذا الوقت، ولكن وجودهم هو لم يدم طويلا والآفات تصبح بسرعة الناخر في المظهر ومليئة البكتيريا في الوقت الذي تواصل في الوقت نفسه إلى GRآه في الحجم حتى موت الحيوان أو تدخل مضادات الميكروبات. الأهم من ذلك، خلال 3 أيام من تدخل المضادات الحيوية، لوحظ وافر تسلل الخلايا المناعية في موقع الآفة السابق وهذا يترافق ترسب الكولاجين القوي. تم الإبلاغ عن إعادة القلب مماثل أن يحدث بعد احتشاء جنبا إلى جنب مع عواقب دائمة على وظيفة القلب 11-15. وهكذا، microlesions هي تفسيرا محتملا للأحداث القلب السلبية التي تحدث أثناء IPD وربما زيادة في معدل الوفيات المرتبطة القلب في الأفراد النقاهة الذين نجوا الحلقة المرض.
هنا، يتم توفير تعليم على نموذج الفأر تجريبية من IPD وتشكيل الآفة القلبية وتصور microlesions القلب في المراحل المبكرة والمتأخرة من العدوى. ويتجلى بروتوكول للكشف عن ترسب الكولاجين في الحيوانات التي تم حفظها من قبل تدخل مضادات الميكروبات. والهدف من هذه المقالة هو وacilitate البحث من المحققين الآخرين على هذا علم الأمراض الرئوية المهم ورواية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استعراض جميع التجارب الماوس والموافقة عليها من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدم في جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو (بروتوكول # 13032-34-01C). رعاية الحيوان والبروتوكولات التجريبية تلتزم القانون 89-544 العامة (قانون رعاية الحيوان) وتعديلاته، والمبادئ التوجيهية خدمات الصحة العامة، ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (وزارة الصحة والخدمات الإنسانية).
1. العدوى
- الحصول BALB / ج الفئران من كلا الجنسين الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا من العمر.
ملاحظة: S. الرئوية المصلي 4 سلالة TIGR4 هو عزل السريري الخبيثة التي تم التسلسل 16. - تنمو في TIGR4 تود هيويت مرق في 37 ° C في CO 2 5٪ حتى وصلت الكثافة البصرية (OD) 620 0.5 (الموافق 1.0 × 10 8 مستعمرة [كفو] / مل). بيليه الثقافة المكورات الرئوية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3، 500 x ج وإزالة طاف باستخدام سطر فراغ. تعليق وتمييع البكتيريا مع الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة (PBS) إلى تركيز النهائي من 1.0 × 10 4 CFU / مل.
- باستخدام غرفة الاستقراء، تخدير الفئران مع 2.5٪ الأيزوفلورين تبخيرها في الأكسجين. تأكيد حالة تخدير التي كتبها طيف قرصة اصبع القدم مع ملاقط حادة.
- عقد الماوس تخدير من قبل القفا وتستقيم مع يد واحدة، حقن كل فأر داخل الصفاق (IP) مع 100 ميكرولتر من S. الرئوية تعليق باستخدام حقنة مع 27-30 إبرة قياس (الموافق لجرعة التحدي المتمثل في 1.0 × 10 3 CFU). وضع الجزء الخلفي الماوس في قفصه. الفئران عادة توقظ 30-40 ثانية بعد الحقن.
- السماح للعدوى والمضي قدما لمدة 24 على الأقل (المبكر) أو 30 (المتقدمة) ساعة.
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الاختناق. أداء خلع عنق الرحم للتأكد من الماوس والمتوفى. تأكيد القتل الرحيم بمزيد من إزالةمن القلب في الخطوة 1.6.
- تطهير الذيل مع مسحة الكحول وقص جزء 2-3 ملم. جمع 2 ميكرولتر من الدم وتمييع متسلسل الدم 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني يحتوي هيبارين الصوديوم 1 U / مل خمس مرات. لوحة زيتية التخفيفات التسلسلية على لوحة أجار الصويا الدم واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. استقراء اليوم التالي من مستعمرة بحساب مستوى تجرثم الدم.
- لشل حركة الماوس في موقف ضعيف على منصة الجراحية. رش الصدر مع 70٪ من الإيثانول واتركها حتى تجف. باستخدام مقص جراحي وملقط فتح تجويف الصدر، وإزالة القفص الصدري، والقطع الحجاب الحاجز لفضح القلب والرئتين. قطع باستخدام مقص الأوعية الدموية متصلة القلب والمكوس بلطف القلب مع الحرص على تجنب كدمات بالملقط.
- شطف القلب مع PBS ثم وضع في أشرطة جمع عينة الأنسجة بحيث أقسام الاكليلية ويمكن الحصول على خلال باجتزاء الأنسجة. لتضمين البارافين، جيش التحرير الشعبى الصينىCE الأشرطة في 10٪ من محلول الفورمالين مخزنة-وفي اليوم التالي لإرسال البارافين التضمين.
- بدلا من ذلك تجميد فلاش باستخدام مجمع أكتوبر ضمن cryomold التي تم وضعها على الثلج الجاف.
2. التخيل من القلب الآفات الرئوية وضمن آفات
- خفض أقسام القلب وجزءا لا يتجزأ من البارافين مثل أن 4 غرف القلب واضحة في كل قسم الأنسجة. قطع الشرائح في سمك من 5 ميكرون.
- Deparaffinize وصمة عار الشرائح مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) باستخدام أساليب القياسية 17.
- مشاهدة H & E الملون أقسام القلب باستخدام المجهر الضوئي في انخفاض (100X، 200X) وارتفاع (الغمر النفط: 400X، 1،000X) تكبير. تميز قلوب لوجود microlesions في عضلة القلب. هنا، واكتساب H & E الصور باستخدام 2 المجهر زايس Axioskop مجهزة 100X 1.3 العددية الهدف فتحة خطة-NEOFLUAR.
ملاحظة: في المراحل المبكرة ل القلبيتم التمييز esions التي كتبها التفاضلي مظهرها الملونة، وفي بعض الحالات وجود الخلايا المناعية (وحيدات والمحببة) ما يبدو أن حيدات. في الآفات المتقدمة، ولا سيما تلك التي ظهرت في 30 ساعة، الخلايا المناعية هي ويلاحظ آفات تشبه فجوة غائبة والكبيرة في مكانها. ومن المهم أن نلاحظ أنه في حين يمكن أن يحدث تدفق الخلايا المناعية خلال المراحل الأولى من التنمية الآفة القلبية أنه لا يبدو أن هناك شرط.
3. مناعي المجهري للالرئوية ضمن Microlesions
- قسم القلب في cryomolds مع مشراح لسمك من 5 ميكرون ومكان أقسام على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة. السماح أقسام القلب المجمدة لذوبان الجليد والهواء الجاف. إصلاح أقسام لمدة 10 دقيقة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (الرقم الهيدروجيني 6،8-7،2 عند 25 ° C).
- تغسل شرائح (3X) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، permeabilize لمدة 15 دقيقة في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، ثم يغسل مرة أخرى في برنامج تلفزيوني.
- secti الأنسجة كتلة على على الشرائح مع 10٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
- شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني، والغطاء واحتضان أقسام القلب مع الأرنب مكافحة المصلي 4 المكورة الرئوية مصل في 1: 1،000 في برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل الماعز لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة لعناصر التحكم السلبية يجب استخدام المحققين السذاجة مصل الأرنب - بعد غسل مع PBS، والغطاء واحتضان المقاطع مع 10٪ الماعز المصل PBS مع الماعز المضادة للأرنب FITC الضد مترافق في 1: 2،000 لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- بعد تعليمات الشركة الصانعة، واستخدام دابي (4، 6- Diamidino-2-Phenylindole) في 5 ملغ / مل لرؤية نوى حقيقية النواة. غسل وجبل أقسام الأنسجة مع FluorSave.
- الحصول على صور الفلورسنت باستخدام نظام المجهر متحد البؤر في التكبير على حد سواء المنخفضة والعالية. ضبط الفتحة العددية وفقا لذلك للحصول على أفضل النتائج. هنا، الحصول على صور الفلورسنت باستخدام نظام متحد البؤر مع الهدف الفتحة العددية 60X 1.42.
- تبدأ مع الفئران المصابة الملكية الفكرية مع 1.0 × 10 3 CFU من TIGR4 كما هو مبين سابقا في الخطوة 1.
- ابتداء من 30 ساعة بعد العدوى، وإدارة الصف الصيدلانية الأمبيسلين الملكية الفكرية (80 ملغم / كغم من وزن الجسم) في 100 ميكرولتر المالحة كل 12 ساعة لمدة 36 ساعة. جمع القلوب في نقطة الوقت المطلوب والعملية كما هو موضح في الخطوة 1.6 لتضمين البارافين والأنسجة، باجتزاء.
5. الكولاجين كشف ترسب
- باستخدام الزيلين ويغسل الكحول متدرج مع الماء، deparaffinize والأنسجة هيدرات أقسام منزوع الأيونات باستخدام الأساليب القياسية 17. علاج المقاطع مع مائي حمض الفسفومولبديك 0.2٪ لمدة 5 دقائق ويشطف بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
- أقسام صمة عار مع 0.1٪ سيريوس الأحمر في حمض البكريك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل المقاطع في 0.01 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 دقائق ويشطف باستخدام الايثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة.
- Dehydraالشركة المصرية للاتصالات الأقسام باستخدام متطابقة ولكن ترتيب يغسل إلى أن المبينة في 5.1 عكس، يذوى أقسام القلب في زيادة ومتدرج تركيزات الإيثانول ثم زيلين.
- أقسام جبل الأنسجة بمحلول متزايدة لتقييم المجهري.
- لتحديد مناطق ترسب الكولاجين، ودراسة أقسام الأنسجة الملون للمناطق من تلطيخ قراءة عميقة تحت التكبير المنخفضة والعالية باستخدام المجهر الضوئي. أي منطقة داخل البطينات من القلب الذي هو الأحمر هي منطقة حيث أودعت الكولاجين. المناطق دون هذه وصمة عار الحمراء هي مواقع من الأنسجة السليمة التي تفتقر إلى ترسب الكولاجين. هنا، واكتساب Picro سيريوس الأحمر صور الملون باستخدام المجهر مجهزة الهدف الفتحة العددية 20X 0.5.
ملاحظة: البقع الحمراء في الأذين الأنسجة السليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصور Microlesions التي كتبها H & E
وقد لوحظت microlesions القلب في البطينين من H & E الملون أقسام القلب من الفئران مع IPD التالية التحدي الملكية الفكرية مع TIGR4 الشكل 1 يوضح الزيادة في حجم هذه الآفات ما بين 24 و 30 ساعة بعد العدوى (HPI)، مع عدد أكبر من الهيماتوكسيلين -stained (أي، الأرجواني والأزرق) المكورات الرئوية مرئية داخل الآفة. واتسمت Microlesions من قبل التشكل مثل فجوة، أكثر كثافة يوزين (الحمراء) تلطيخ الخلايا العضلية في الخلايا المجاورة على الفور إلى موقع الآفة، مكورات مزدوجة داخل الآفات، والغياب العام للخلايا المناعية. وكانت حوالي نصف الآفات المتاخمة للالأوعية الدموية مرئية. أصبحت بين 24 و 30 HPI microlesions أكثر عددا وأكبر بكثير. في 30 HPI يمكن في كثير من الأحيان أن ينظر البكتيريا خارج الخلية يتدفقون من الآفة بين الخلايا.
Visualizatiعلى من S. الرئوية عن طريق الميكروسكوب مناعي
لتصور وتأكيد أن S. كانت الرئوية الواقع داخل الآفات، تم استخدام تلطيخ مناعي للالمصلي 4 المحفظة السكاريد الذي يتم انتاجه من قبل TIGR4 (الشكل 2). وأظهرت الصور الملتقطة وجود معبأة بإحكام وكثيفة مجاميع من S. الرئوية ضمن مواقع آفة دقيقة.
أدلة على تندب القلب
تم إجراء Picro سيريوس الأحمر تلطيخ على أقسام القلب من الفئران التي تم انقاذهم مع الأمبيسلين والضوابط غير المصابة. في المضادات الحيوية انقاذ الفئران النقاهة، كانت هناك زيادة كبيرة في وجود وشدة وصمة عار Picro سيريوس الأحمر مع العصابات يتدفقون من ما يبدو أن مواقع الآفة السابقة في البطينين (الشكل 3). في المقابل، كانت غير ملوثين البطينين في أقسام التحكم مشيرا إلى أن ترسب الكولاجين كان غائبا (لا يظهر).
معا هذه النتائج تثبت القدرة على تصور microlesions القلب في الفئران مع IPD الشديد وللوصول إلى تشكيل ندبة ناتجة في البطينين باستخدام إجراءات النسيجية القياسية. الأهم من ذلك، ترتبط microlesions القلب دائما إلى التتر عالية من S. الرئوية والوقت اللازم للتوسط تشكيلها.
الشكل 1: الكشف عن microlesions في أقسام القلب H & E الملون صور الممثل (1،000X) من microlesions القلب لوحظ في 24 هور و 30 إصابة آخر ساعة. القضبان السوداء على نطاق وتتوافق مع 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملفات / ftp_upload / 52590 / 52590fig2.jpg "/>
الشكل 2: كشف مناعي من S. المجهري مناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد النمط المصلي 4 المحفظة السكاريد (الأخضر) أكد الرئوية ضمن microlesions القلب. وجود S. الرئوية ضمن microlesions القلب. كانت ملطخة نوى الأزرق مع دابي. شريط النطاق الأبيض تتوافق مع 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ترسب الكولاجين في السابق الموقع آفة دقيقة القلب في الماوس النقاهة صورة الممثل (200X) تظهر الملون وPicro سيريوس الأحمر آفة دقيقة القلب في البطين على فأرة الحاسوب بعد 5 أيام تدخل المضادات الحيوية لفي.داء المكورات الرئوية vasive. الأحمر يشير إلى ترسب الكولاجين. شريط أسود على نطاق وتتوافق مع 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، وهي طريقة تكرار للغاية للحث S. بوساطة الرئوية microlesions القلب في الفئران خلال IPD وأظهرت تقنيات التصور بهم. مصابون الفئران بجرعة من البكتيريا التي تفوق عتبة الجهاز المناعي للتخليص، مما أدى إلى تجرثم الدم عالية الجودة، مماثلة لتلك التي تحدث أثناء الإنتان البشري، ويؤدي إلى النبات البكتيرية في نهاية المطاف إلى عضلة القلب. لأسباب غير معروفة بعد، S. الرئوية في قلب قادر على تكرار يعوقها عن الاستجابة المناعية المضيف. هذا هو موضوع التحقيق الجاري وهذا المنشور قد يسهل محققين آخرين في جهودها الرامية إلى المشاركة.
H & E تلطيخ يسمح لتصور آفة دقيقة باستخدام المجهر الضوئي العادي منذ العضلية وصمة عار الوردي إلى الأحمر، في حين microlesions القلب والبكتيريا داخل وصمة عار الأزرق إلى الأرجواني العميق. هذا تناقض حاد تمكن من السهل detectiعلى من microlesions في مراحل لاحقة من العدوى عندما تكون الآفات الكبيرة. من أجل التحقق من وجود S. ضمن microlesions القلب، تم إجراء الفحص المجهري مناعي باستخدام مصل ضد النمط المصلي 4 المحفظة السكاريد أن يتم عن طريق TIGR4 الرئوية. الأهم من ذلك أن الأجسام المضادة لمكافحة المحفظة الخاصة التي ينبغي استخدامها يعتمد على المصلي من سلالة المكورات الرئوية الذي يستخدم لتحدي التجريبية. بدلا من ذلك، يمكن للمحققين أيضا استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة تجاريا ضد pneumolysin، السم تشكيل المسام من S. الرئوية، أو التي تكشف عن مكونات جدار الخلية المكورات الرئوية (أي TEPC 15). في حين أن هذه الأجسام المضادة كشف المكورات الرئوية داخل القلب، وتشير التجارب السابقة أن الأجسام المضادة ضد المحفظة السكاريد توفر الصور الأكثر إلحاحا 7.
S. الرئوية بوساطة تشكيل آفة دقيقة في القلب يتطلب تفاعلوadhesin المكورات الرئوية الكولين البروتين وملزم مع البروتين المضيف Laminin مستقبلات للالتصاق البكتيريا إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية والتفاعل من جدار الخلية البكتيريا فسفوريل كولين مع مضيفه صفائح الدم، تنشيط مستقبلات عامل للهجرة البكتيرية من خلال الخلية 7،8. ولذلك فمن المهم أن نلاحظ أن تشكيل آفة دقيقة يرتبط ارتباطا وثيقا عبء المعدية والوقت، مما يزيد من وتيرة ومدة هذه التفاعلات ويتيح وقتا للبكتيريا لتكرار والآفات واضحة لتطوير. لقد سبق تحديدها أن جرعة المعدية الملكية الفكرية أكبر من 1.0 × 10 3 CFU من S. ينتج سلالة الرئوية TIGR4 في الموت السريع جدا من الفأرة ونتيجة سوء تشكيل الآفة. تحت هذا المعدية جرعة التخليص العفوي يحدث في بعض الفئران وغيرها لوحظ تأخر من مرض شديد. حتى الآن طريقة لالفئران تحدى مع 1.0 × 10 3 CFU من TIGR4 بين 24 و 36 ساعة،الآفات تتراكم بسرعة في عدد وتنمو في الحجم باستمرار حتى يصبح الماوس المحتضر. وهكذا، فإن الجرعة المعدية من سلالة تصيب تحتاج إلى معاير لتكرار حالة مشابهة للمرض مع دولة المحتضرة النامية في ما لا يقل عن 30 HPI. الأهم من ذلك، لاحظنا مرارا وتكرارا تشكيل الآفة القلب في الفئران التي كانت مصابة داخل الأنف مع 1.0 × 10 7 CFU وintratracheally مع 1.0 × 10 5 CFU من TIGR4. وبعد هذه التحديات طرق تطوير المرض الشديد وقعت في نقطة زمنية لاحقة. نحن أيضا لاحظ تشكيل آفة دقيقة مع سلالات خبيثة أخرى من S. الرئوية، مثل النمط المصلي 2 عزل D39، وإن كان ذلك على ترددات مختلفة. وهكذا، والآفات ليست نتيجة للمسار العدوى الملكية الفكرية أو محددة لTIGR4، ولكن بدلا من ذلك مرتبطة مدة وشدة الحلقة المرض. وهنا فإننا ننصح أن تصيب الفئران الملكية الفكرية منذ هذا الطريق التحدي يوفر أعلى درجة من التكاثر. إذا كان فرقسلالة erent من S. يستخدم الرئوية أو هو المطلوب طريقا المعدية المختلفة، وينبغي أن تهدف المحققين لتجرثم الدم في مستويات> 10 5 CFU مل من الدم لمدة 24 ساعة على الأقل.
يسمح تدخل مضادات الميكروبات دراسة الأحداث التي تحدث أثناء فترة النقاهة، والنمذجة الإنسان في الإعداد وحدة العناية المركزة. ومن الجدير بالذكر أن ليس كل الفئران البقاء على قيد الحياة على الرغم من العلاج المضادة للميكروبات وأكدت إزالة البكتيريا. يجب أن المحققين يتوقعون معدلات البقاء على قيد الحياة بين 50-60٪ وعلى هذا النحو يجب ضبط حجم فوج وفقا لذلك للتعامل مع فقدان الحيوانات. ينصح بشدة الرصد المنتظم للحيوانات بعد 24 ساعة لضمان الامتثال وافقت المؤسسي بروتوكولات الحيوان. Picro سيريوس الأحمر تلطيخ هي تقنية بسيطة والقياسية المستخدمة لتصور ترسب الكولاجين. هنا، ويتجلى ذلك كيف يمكن استخدام هذه وصمة عار لدراسة إعادة القلب في البطينين في القلب بعد الصدمة infectiouالصورة حلقة. وقد تم اختيار Picro سيريوس الأحمر على تقنيات أخرى تستخدم عادة لتصور ترسب الكولاجين، مثل "ثلاثي الألوان وصمة عار ماسون"، بسبب تناقض حاد أنها تقدم بين الكولاجين المودعة والأنسجة المحيطة بها. وقد أثبت هذا أن تكون مفيدة بشكل كبير عند تقييم مدى ترسب الكولاجين عضلة القلب التالية المضادات الحيوية بطريقة الكمي باستخدام برنامج مثل يماغيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
