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Bioengineering

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

doi: 10.3791/52602 Published: March 11, 2015

Abstract

I biofilm sono comunità microbiche-superficie collegata che hanno strutture complesse e producono significativi eterogeneità spaziali. Sviluppo di biofilm è fortemente regolata dal flusso circostante e l'ambiente nutrizionale. Crescita biofilm aumenta anche l'eterogeneità del microambiente locale generando campi di flusso complessi e modelli di trasporto dei soluti. Per studiare lo sviluppo di eterogeneità in biofilm e le interazioni tra biofilm e il loro locale micro-habitat, siamo cresciuti biofilm mono-specie di Pseudomonas aeruginosa e biofilm dual-specie di P. aeruginosa e Escherichia coli sotto gradienti nutrizionali in una cella di flusso microfluidica. Forniamo protocolli dettagliati per creare gradienti nutrienti all'interno della cella di flusso e per la crescita e la visualizzazione sviluppo biofilm in queste condizioni. Abbiamo anche protocolli presenti per una serie di metodi ottici di quantificare modelli spaziali nella struttura biofilm, flusso Distributi su biofilm, e trasporto di massa intorno e all'interno di colonie biofilm. Questi metodi supportano le indagini a tutto campo del co-sviluppo di biofilm e di habitat eterogeneità.

Introduction

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Microrganismi attribuiscono alle superfici e formare biofilm - aggregati di cellule racchiuse in una matrice extracellulare-polimero 1. I biofilm si comportano in modo molto diverso dalle cellule microbiche individuali, perché biofilm hanno drammatico eterogeneità spaziale risultante da una combinazione di limitazioni del trasporto dei soluti interni e variazioni spaziali nel metabolismo cellulare 2,3. Le concentrazioni di ossigeno e nutrienti drasticamente diminuire all'interfaccia tra biofilm e dintorni fluido e ottenere ulteriori impoverito all'interno del biofilm 2. Variazioni spaziali in biofilm la respirazione e la sintesi proteica può verificarsi anche come una risposta all'ossigeno localizzato e la disponibilità di nutrienti 2.

In ambienti acquatici e del terreno, la maggior parte dei batteri abitano in biofilm. Biofilm naturali svolgono importanti processi biogeochimici compresa ciclo del carbonio e azoto e ridurre i metalli 4,5. Clinicamente, la formazione di biofilm è responsbile per polmonare prolungato e infezioni urinarie 6. Infezioni biofilm associate sono molto problematico perché le cellule in biofilm sono estremamente elevata resistenza agli antimicrobici rispetto ai loro omologhi planctonici 6. Perché biofilm sono importanti in contesti diversi, una notevole quantità di ricerca si è focalizzata sulla comprensione dei fattori ambientali che controllano le attività biofilm e l'eterogeneità spaziale biofilm e microambiente circostante.

Studi precedenti hanno dimostrato che lo sviluppo del biofilm è fortemente regolato da una serie di fattori ambientali: biofilm sviluppano differenti morfologie sotto varie condizioni di flusso; ossigeno e nutrienti disponibilità influenza biofilm morfologia; e sforzo di taglio idrodinamico colpisce l'attaccamento di cellule planctoniche alle superfici e il distacco delle cellule dal biofilm 7-9. Inoltre, condizione di flusso esterno influenza la consegna dei substrati into ed entro 10 biofilm. La crescita di biofilm altera anche circostante condizioni fisiche e chimiche. Ad esempio, la crescita di biofilm porta alla deplezione locale di ossigeno e nutrienti 2; biofilm accumulano composti inorganici e organici dall'ambiente circostante 11; e cluster biofilm deviano il flusso e l'aumento della superficie di attrito 12,13. Perché biofilm interagiscono con il loro ambiente circostante in modi molto complessi, è fondamentale per ottenere contemporaneamente informazioni sulle proprietà biofilm e delle condizioni ambientali, e gli approcci multi-disciplinari devono essere utilizzati per caratterizzare completo interazioni biofilm-ambiente.

Qui vi presentiamo una serie di metodologie integrate per caratterizzare i modelli spaziali in crescita microbica all'interno mono-specie e biofilm dual-specie sotto una pendenza nutrizionale imposto, e di osservare la modifica conseguente della sostanza chimica locale e microambiente fluido. Noi FIRv descrivono l'uso di una cella di flusso microfluidica doppia aspirazione recentemente sviluppato per osservare la crescita di biofilm sotto gradienti chimici ben definiti. Abbiamo poi dimostrare l'uso di questa cella di flusso microfluidica per osservare la crescita di due specie di batteri, Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli, in biofilm sotto una varietà di condizioni nutrizionali. Mostriamo come in visualizzazione situ fluorescente di propagazione tracciante in colonie biofilm può essere utilizzato per valutare quantitativamente i modelli di trasporto dei soluti in biofilm. Infine, si mostra come microscala velocimetria tracciamento di particelle, eseguita al microscopio confocale, può essere utilizzato per ottenere campo di moto locale intorno alle biofilm crescita.

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Protocol

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Setup Cella 1. Flusso e inoculazione

NOTA:. Utilizzare una cella di flusso microfluidica doppio ingresso descritto nel Canto et al, 2014 14 a crescere biofilm. Questa cella di flusso è in grado di creare gradienti chimici lisce ben definiti. Il disegno cella di flusso è mostrata in Figura 1 e flusso fabbricazione cella precedentemente descritto canzone et al. 2014 14. Qui dettaglio i nostri metodi utilizzando P. aeruginosa e E. coli per formare biofilm, ma altre specie può essere adatto anche. Abbiamo usato P. aeruginosa PAO1- GFP, che esprime costitutivamente una proteina verde fluorescente (GFP), come organismo modello per lo sviluppo di biofilm. Inoltre, abbiamo utilizzato E. coli DH5α per formare biofilm mixed-specie con P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. ceppi coli sono state coltivate su piastre di agar LB.

  1. Preparare la cella di flusso utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) legato ad unacoprioggetto di vetro con trattamento al plasma di ossigeno, come descritto in 14. Le dimensioni della camera di cella di flusso sono di 23 mm x 13 millimetri × 0,24 millimetri (lunghezza x larghezza × profondità).
  2. Preparare modificato FAB mezzo di crescita 15. Per osservare la crescita di biofilm sotto un gradiente nutrizionale all'interno della cella di flusso, introducono modifiche FAB media 15 con 0,6 micron di glucosio in un ingresso e di introdurre FAB media senza alcuna fonte di carbonio attraverso l'altro ingresso. Filtro-sterilizzare (dimensione dei pori = 0,2 micron) la soluzione di glucosio magazzino (60 mm) prima di aggiungerlo al mezzo FAB. Autoclave Anche il mezzo FAB con ciclo 1 (liquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) prima dell'uso.
  3. Sterilizzare il sistema di flusso. Prima dell'inoculo, autoclave l'intero percorso di flusso (bottiglie medie, tubi, trappole bolla, celle di flusso) utilizzando ciclo 1, eccetto per le valvole a tre vie (plastica monouso e pre-sterilizzati) a monte della cella di flusso. (Valvole a tre vie sono utilizzati per l'iniezione delle cellule culture, tracciante fluorescente e microsfere.) Per evitare la contaminazione in fase di montaggio, coprire tutte le aperture e tubi di collegamento con un foglio di alluminio o sacchetti di autoclave prima autoclave.
  4. Collegare il sistema di flusso. Assemblare i componenti del sistema di cella di flusso accuratamente (vedi video per il montaggio del sistema di flusso) e fornire terreno di coltura alla cella di flusso tramite una pompa peristaltica che controlla con precisione la portata.
  5. Preparare coltura cellulare per l'inoculazione trasferendo una colonia di P. aeruginosa o E. coli dalle piastre LB a 3 ml di brodo LB e scuotere la cultura O / N a 225 giri al minuto e 37 ° C. Diluire gli O / colture cellulari N in 1 ml di acqua sterile ad una OD finale 600 = 0,01 come inoculo. (Cultura e diluire i batteri in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione.)
  6. Per gli esperimenti con biofilm mista specie, diluire le due colture batteriche ad un rapporto di 1: 1 in 1 ml con un equivalente OD 600 = 0,01 per ogni batterio.
  7. Seminare la cella di flusso. Iniettare 1 ml di inoculo all'ingresso cella di flusso dalla valvola a tre vie. Dopo l'iniezione, mettere in pausa il flusso per 1 ora per consentire cellule batteriche di allegare al vetro di copertura. (Assicurarsi che la cella di flusso è posizionato con il lato coprioggetto basso per consentire alle cellule in sospensione di depositarsi sul vetrino.)
  8. Dopo 1 ora, riprendere il flusso e pompare il mezzo di crescita alla cella di flusso ad una velocità costante di 0,03 ml / min per ciascun ingresso per 3 giorni.

2. Characterizing biofilm sviluppo in risposta a nutrienti sfumature Utilizzo Microscopia confocale

NOTA: P. aeruginosa può essere ripreso con costitutivamente-espressa GFP, ma E. coli in biofilm misti specie deve essere ripreso dalla controcolorazione.

  1. Osservare le biofilm 3 giorni usando la microscopia confocale. Per i risultati rappresentativi, osservare biofilm utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 63X. Prima di imaging, markla cella doppio ingresso a flusso con una griglia sul lato vetro di copertura. (Lo scopo di questa griglia è di consentire lo sperimentatore per individuare le regioni di imaging nella camera cella di flusso.)
  2. Per colorazione di contrasto, diluire 10 ml di rosso fluorescente macchia cellule permeante acidi nucleici, come l'acido macchia verde fluorescente nucleico come STYO 62, soluzione madre (1 mm) in 990 ml di acqua sterilizzata e poi lentamente iniettare la macchia diluito con una siringa in la camera di cella di flusso dalla valvola a tre vie monte. Mantenere la cella di flusso stagnante e al buio per 30 minuti, quindi riprendere il flusso di lavare la macchia non legato per 15 min.
  3. Eseguire confocale. Attivare la 488 nm Argon laser per l'eccitazione e l'emissione di raccolta canali per GFP (500-535 nm) e macchia acidi nucleici (per lampade fluorescenti colorazione verde acido nucleico, 650-750 nm). Regolare guadagni e offset per entrambi i canali per avere immagini brillanti e pulite. Selezionare xyz e modalità di imaging simultaneo. Utilizzare la manopola di z-controllo per idenduare parte inferiore e superiore del biofilm nel campo. Impostare la z-passo a 0,5 micron per l'acquisizione di una serie di immagini 3-D. (Per garantire immagini di alta qualità, utilizzare una media linea di quattro per l'acquisizione di immagini.)
  4. Per mappare i modelli spaziali di sviluppo biofilm all'interno della cella di flusso, biofilm immagine a tre o più longitudinale (x) distanze lungo l'ingresso della cella di flusso, e alle tre trasversale (y) posizioni relative al gradiente nutrizionale imposto, come mostrato in Figura 1 .

3. Characterizing Soluto interno Trasporto Iniezioni di conservatore fluorescente Tracer

NOTA: Un tracciante fluorescente conservatore, come Cy5, può essere utilizzato per caratterizzare modelli di trasporto dei soluti all'interno del biofilm.

  1. Sciogliere Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in acqua ad una concentrazione finale di 10 mg / ml come soluzione madre. Conservare la soluzione di riserva Cy5 in un -20 ° C freezer.
    NOTA: Come Cy5 è chiaro Sensitive, magazzini, diluite e iniettare soluzioni Cy5 nel buio.
  2. Prima delle iniezioni del tracciante fluorescente, prendere una serie di immagini 3-D del biofilm di 3 giorni con la microscopia confocale (con un obiettivo 63X). (Regioni larghe delle colonie biofilm sono ideali per serie temporali osservazioni di trasporto colorante.) Anche scegliere un piano z con colonie ben separati per l'imaging (come mostrato in Figura 5A).
  3. Per ogni esperimento iniezione Cy5, diluire 2 ml di soluzione madre Cy5 in 998 microlitri di acqua sterilizzata per fornire una soluzione di iniezione avente una concentrazione Cy5 di 20 ug / ml.
  4. Arrestare la pompa per interrompere il flusso e iniettare la soluzione Cy5 nel monte della cella di flusso utilizzando una siringa attraverso la valvola a 3 vie. (E 'importante per evitare bolle d'aria di entrare nel percorso di flusso durante l'iniezione. Bubble trappole devono essere tenuti aperti durante l'iniezione posteriore.)
  5. Dopo aver iniettato il soluzione Cy5, chiudere le trappole bolla, regolare la valvola a 3 vie, e riavviare ilpompa per fornire la soluzione Cy5 iniettato nella cella di flusso.
  6. Passa alla modalità di imaging confocale a XYT. Attivare Cy5 e GFP canali sotto la modalità di imaging simultaneo. Regolare le impostazioni confocale su intensità Cy5 (intensità del laser, di guadagno e offset) per evitare segnali, che è fondamentale per la quantificazione saturazione. (Alta risoluzione temporale è preferito per la visualizzazione penetrazione del colorante. Tuttavia, la scansione veloce diminuisce la qualità dell'immagine.) Scegliere la corretta velocità di scansione e media linea per bilanciare la risoluzione temporale dell'imaging e la qualità dell'immagine. Per questo protocollo utilizzare una media linea di quattro e un frame rate di 0,15 Hz.
  7. Riprendere il flusso di consegnare Cy5 nella cella di flusso (ancora ad una portata di 0,03 ml / min). Contemporaneamente avviare serie temporali confocale.
  8. Quantificare penetrazione Cy5 da radialmente media intensità Cy5 all'interno di un 2-D biofilm colonia circolare. Per media, prima identificare il bordo di un cluster biofilm, quindi generare una mappa di distanza per una sezione 2-D del cluster, E infine modelli medi radiali di intensità Cy5 per generare una curva di penetrazione (vedere Figura 6).
    1. Per computazionalmente realizzare passo 3.8, utilizzare BioSPA (biofilm Spatial Pattern Analysis) pacchetto software (inedito, software e manuale disponibile su richiesta) o di altri programmi di analisi delle immagini.
    2. Per utilizzare BioSPA, prima importare un'immagine impostata in BioSPA. Quindi selezionare soglia adeguata per i canali GFP e Cy5 per rendere le immagini binarie. Nel menu di analisi / calcolo, selezionare Advanced Analysis e quindi Analysis diffusione. Utilizzare il canale GFP per definire il bordo di un cluster e utilizzare lo strumento poligono per selezionare un cluster come la regione di interesse (ROI).
    3. Fare doppio clic sul gruppo biofilm selezionato per eseguire l'analisi di diffusione. Salvare i risultati delle analisi di diffusione e calibrare l'intensità Cy5 alla concentrazione Cy5 utilizzando una curva di calibrazione.
      1. Per generare Cy5 curva di calibrazione concentrazione, misurare intensità Cy5 su una conce Cy5gradiente ntration al microscopio confocale. (Intensità Cy5 e concentrazione hanno una relazione lineare.)

4. Caratterizzare il campo di moto circostante tracciando particelle fluorescenti

NOTA: particelle fluorescenti, quali microsfere fluorescenti, può essere usato per caratterizzare il campo di flusso intorno biofilm. Campo di moto intorno biofilm può essere calcolata dalle osservazioni di serie temporali di posizioni delle particelle che utilizzano software di monitoraggio di particelle velocimetria. I risultati qui riportati sono stati ottenuti con il software Streams 2.02 pacchetto 16 (download del software e la guida a disposizione dell'utente in http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

  1. Diluire le microsfere fluorescenti (diametro ~ 1 micron) in acqua sterile ad una concentrazione solida finale di 0,2% e un volume finale di 0,5 ml. Vortex per assicurarsi che le microsferesono ben dispersi.
  2. Iniettare e fornire i microsfere fluorescenti diluito nella cella di flusso in base a procedure da passaggi 3,3-3,5. Per consentire un monitoraggio accurato del percorso particella, utilizzare un tasso relativamente basso flusso (0,01 ml / h per i risultati di monitoraggio di particelle in questo documento).
  3. Passare impostazioni confocale modalità di XYT per tracciare il movimento delle particelle in un z-slice e prendere le immagini serie temporali. (Una frequenza di 1 Hz è stato utilizzato per i risultati rappresentativi riportati in questo articolo.) Iniezione di ripetizione di particelle e di immagini in diverse posizioni z di generare flusso di campo 3-D.
  4. Pre-processo time-series immagini confocale sottraendo il segnale di fluorescenza di fondo (il segnale nella prima immagine acquisita del set di immagini) utilizzando ImageJ (download del software e manuale disponibile su http://imagej.nih.gov/ij/ ) o altri programmi.
  5. In ImageJ, aprire la prima immagine di un set di immagini e quindi importare il set di immagini. Sotto processo / Immagine Calculator, sottrarre la prima immagine dal set di immagini. Salvare il set di immagini pre-trattati.
  6. Per calcolare i vettori di flusso, import time-series immagini confocale in Streams 2.02. In "vista del processo Apri", selezionare ed eseguire "Identificare le particelle". Utilizzare soglia adeguata di identificare particelle. Utilizzare 0,5 e 5 micron come soglie di diametro minimo e massimo per 1 micron particelle.
  7. Poi sotto "view processo Open", selezionare ed eseguire "PTV analisi condotta" per generare percorsi di particelle. Controllare i percorsi di particelle per vedere se essi rappresentano il movimento delle particelle. Infine, selezionare ed eseguire "Crea campo di velocità" per generare una mappa di flusso vettoriale.

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Representative Results

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La cella doppia presa flusso microfluidica consente l'osservazione della crescita biofilm sotto un gradiente chimica ben definita formata miscelando due soluzioni all'interno della camera di flusso. Il gradiente chimica risultante è stato precedentemente osservato per iniezione colorante e caratterizzato in dettaglio da Song et al. 14. Gradienti di concentrazione lisce sono formate in direzione trasversale, come illustrato in Figura 1. Il profilo di concentrazione era ripida vicino all'ingresso e preso rilassato valle a causa della diffusione (Figura 1). Per osservare sviluppo biofilm sotto un gradiente nutrizionale, abbiamo usato un mezzo definito minima crescita (FAB medium) con glucosio aggiunto solo un ingresso come unica fonte di carbonio. Questo ha prodotto un gradiente di glucosio nella camera di cella di flusso, mentre tutti gli altri nutrienti sono stati omogeneamente distribuiti. La crescita di P. biofilm aeruginosa PAO1 era fortemente correlata alla consegna locale di glucosio (Figura 2).Come trasversale gradiente di concentrazione di glucosio era ripida, vicino all'ingresso, la biomassa biofilm mostrato una drammatica diminuzione da regione high-glucosio per la regione a basso glucosio. Poiché il gradiente di glucosio trasversale rilassato valle, la biomassa biofilm divenne più omogenea. Abbiamo dimostrato ulteriormente l'uso di questa cella di flusso per studiare le interazioni di P. aeruginosa e E. coli in biofilm sotto un gradiente di glucosio (Figura 3). I risultati hanno mostrato che queste due specie mostravano schemi spaziali distinti in crescita relativa al gradiente nutrizionale, e quindi occupato nicchie ecologiche distinte: P. aeruginosa dominato biofilm biomassa in zone con alte concentrazioni di glucosio e E. coli dominato in regioni con basse concentrazioni di glucosio (Figura 3).

Per capire il feedback tra crescita biofilm e l'ambiente circostante flusso, abbiamo caratterizzato il campo di moto bio intorno crescentefilm di fluorescente velocimetria tracciamento di particelle al microscopio confocale. Il movimento osservato delle microsfere fluorescenti iniettati è mostrato in Movie 1. Local informazioni flusso vettoriale è stato estratto da una media di almeno 4.200 misurazioni discrete di velocità delle particelle utilizzando il pacchetto software Streams. Mappatura tridimensionale del campo di moto è ottenuta tracciando particelle in posizioni verticali multipli (Figura 4). Crescita biofilm significativo aumento del flusso di eterogeneità (Figura 4). Flusso vicino alla base di biofilm deviata intorno cluster biofilm, con conseguente aumento della eterogeneità e diminuzione della velocità (Figura 4). Flusso in alto biofilm ha velocità maggiore ed è più omogenea (Figura 4).

Per comprendere l'eterogeneità interna causata dal trasporto dei soluti limitata nel biofilm, abbiamo osservato il trasporto di Cy5 all'interno biofilm mediante microscopia confocale. Penetrazione Time-seriesdi Cy5 in un cluster biofilm è mostrato in Movie 2. Le serie temporali Cy5 curve di penetrazione è mostrato in Movie 3. Il coefficiente di diffusione effettiva delle Cy5 in biofilm è stato calcolato adattando un modello di diffusione 1-D per i profili di concentrazione Cy5:

Equazione 1

dove C è la concentrazione Cy5 radialmente media calcolata l'intensità di fluorescenza, ed è la distanza nel biofilm 17. Cy5 ha mostrato la più alta concentrazione nel flusso di massa e diminuita ripidamente entrando biofilm (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. cella di flusso microfluidica doppio ingresso. Gradienti glucosio lisce sono state create all'interno della camera di flusso introducendo medio FAB ai due ingressi con una fonte di carbonio (gluco se) disponibile in una sola aspirazione. risultante pattern di glucosio all'interno della cella di flusso sono indicate con ombreggiatura. Ombreggiatura scura rappresenta la concentrazione di glucosio superiori. Confocale è stato effettuato a nove punti della cella di flusso. I risultati presentati nelle figure 2 e 3 si riferiscono alle posizioni numerate 1-9 in figura. Questa cifra è modificato dopo canzone et al. (2014), Fig. 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. PAO1 crescita biofilm sotto gradienti glucosio. 3 giorni biofilm PAO1 stati ripreso a 9 posizioni indicate in figura 1. Spaziatura griglia = 18 micron per un'immagine 1-8 e 24 micron per un'immagine 9.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Lo sviluppo di P. aeruginosa e E. coli biofilm dual-specie sotto gradienti di glucosio. P. aeruginosa esprime costitutivamente GFP, e biofilm sono stati anche contrastate da SYTO 62, che è una macchia generale di acido nucleico. Le immagini qui sono sovrapposizioni di GFP (green) e SYTO 62 (rosso) canali. P. aeruginosa appare dunque verde o giallo (verde + rosso), e E. coli appare rossa. Bar scale = 47 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Campi Figura 4. Flusso vettore velocità a z = 4, 10 e 16 micron circa un cluster biofilm. La lunghezza della freccia rappresenta la grandezza della velocità. Bassa velocità di flusso mostra alla base biofilm (z = 4, frecce blu). Flow è più omogenea nei pressi top biofilm (z = 16, frecce rosse). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Cy5 penetrazione nel biofilm. (A) confocale microscopio a z = 18 micron che mostra la penetrazione parziale Cy5 in cluster biofilm a t = 190 sec. Bar scale = 10 micron. (B) risultante pattern di Cy5 concentrazione mappa. (C) Cy5 profilo di concentrazione in un cluster biofilm. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Procedure per generare un profilo di penetrazione Cy5 sinistra:. ROI Selezionato contenente un biofilm cluster di 2-D. Middle: Distanza Mappa del cluster biofilm. A destra: radiale-media profilo di intensità Cy5. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Movie 1 : movimento di particelle fluorescenti iniettate intorno cluster biofilm (video confocale).

Movie 2 : Propagazione della Cy5 in cluster biofilm (video confocale).

_content "> Movie 3 : Propaganda Cy5 in cluster biofilm (concentrazione profili video).

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Discussion

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Abbiamo dimostrato una serie di metodi per la caratterizzazione di tre importanti interazioni biofilm-ambiente: risposta biofilm a gradienti chimici, gli effetti della crescita biofilm sul flusso microambiente circostante, e eterogeneità biofilm derivanti da limitazioni di trasporto interno.

Per prima mostrato l'uso di una cella di flusso microfluidica romanzo imporre un gradiente chimica ben definita per lo sviluppo biofilm. Per generare un gradiente chimica ben definita all'interno della cella di flusso, è importante mantenere la stessa velocità di flusso per entrambi gli ingressi. Assicurarsi che la pompa peristaltica è ben regolata per entrambi i canali di flusso per fornire il supporto crescere alla stessa velocità. Assicurarsi inoltre che non sono presenti ostruzioni nel percorso del flusso durante la crescita di biofilm. Osservazioni della crescita di biofilm dual-specie in questo spettacolo cella di flusso che gradienti chimici fortemente influenzata crescita biofilm e le interazioni tra le specie all'interno di biofilm. Gradienti chimici sono comuni inambienti in cui crescono biofilm, a causa di una combinazione di limitazioni di trasporto, legami chimici e reazioni, e l'assorbimento e il metabolismo microbico 18-20. Questa cella di flusso microfluidica consente ricerche di attività biofilm diverse sotto un intervallo definito di condizioni chimiche all'interno di un unico dispositivo. Ad esempio, questa cella di flusso è stato dimostrato per essere utile per lo studio di biofilm uccisione sotto un gradiente di 14 antimicrobica.

Abbiamo poi dimostrato l'uso di tracciamento di particelle velocimetry per osservare il campo di moto intorno cluster biofilm. Per assicurare un monitoraggio accurato delle particelle fluorescenti iniettate, la portata deve essere ottimizzato. Di solito, bassa portata permette il movimento delle particelle da catturare in campo confocale di vista. Anche il frame rate di scansione deve essere ottimizzato per bilanciare qualità dell'immagine e la risoluzione temporale. Se le particelle si muovono troppo velocemente per catturare il movimento, usare la linea di basso o medio frame o increvelocità di scansione ase. Abbiamo mappato il campo di flusso a tre posizioni verticali su un cluster biofilm, e abbiamo scoperto che la crescita biofilm aumentato il flusso di eterogeneità. Caratterizzare il campo di moto intorno biofilm permette interazioni flow-biofilm chiave da esplorare. Ad esempio, questo può essere usato per valutare i meccanismi che regolano smorzamento fluido e taglio sul biofilm, e la conseguente mancata biofilm e distacco di cellule dalla superficie 1,21. Questi processi sono importanti per comprendere sia gli effetti dei biofilm sui sistemi di flusso (ad esempio, biofouling) e regolazione del biofilm morfologia 8. Condizioni di flusso intorno biofilm controllano anche il trasporto di massa, che è importante per una vasta gamma di processi biofilm. Ad esempio, la velocità del fluido locale superficie biofilm influenza la consegna dei nutrienti e substrati per biofilm attraverso advezione 22.

Infine, abbiamo mostrato l'uso di iniettare traccianti fluorescenti analizzaremodelli di trasporto dei soluti all'interno del biofilm. Abbiamo usato Cy5 qui come tracciante conservativo, e questo Fluor sembra comportarsi spesso conservativo in biofilm 23. Pertanto, i risultati dovrebbero essere rappresentativi dei modelli di trasporto di inerti, soluti neutrali in biofilm. I risultati hanno mostrato una ripida diminuzione della concentrazione Cy5 vicino alla superficie biofilm, ottenendo una concentrazione Cy5 all'interno del biofilm solo ~ 50% della concentrazione nel flusso di massa. Tali profili di concentrazione ripidi sono coerenti con le misure precedentemente segnalati di ossigeno, nutrienti e antimicrobici all'interno biofilm 2,24. Curve di penetrazione Cy5 forniscono informazioni sulla diffusione di soluto in cluster biofilm. Tuttavia, il metodo presentiamo qui si limita analizzare trasporto dei soluti 2-D in (xy) piani orizzontali in biofilm. Con nuova capacità di rapido di imaging, ad esempio spinning disk microscopia confocale, penetrazione del colorante può essere visualizzato in 3-D nel biofilm, WHIch permetterà un'indagine sui processi di trasporto verticale. Inoltre, tracciante e particelle fluorescenti possono essere iniettati insieme per ottenere informazioni di condizioni di flusso esterni e trasporto dei soluti interna allo stesso tempo. Tali informazioni sono utili per differenziare trasporto dei soluti advective e diffusivo tra il flusso di massa e biofilm e di valutare l'effetto del flusso esterno sul trasporto dei soluti interno biofilm.

Nel complesso, presentiamo protocolli dettagliati di utilizzare una cella a flusso microfluidica romanzo che fornisce ben definiti gradienti chimici per lo studio delle risposte biofilm a segnali chimici nell'ambiente. Per meglio caratterizzare l'eterogeneità in biofilm e loro microhabitat circostante, vi presentiamo qui i metodi per caratterizzare i modelli sia nel campo di flusso biofilm e trasporto dei soluti interna biofilm circostante. Ogni metodo fornisce informazioni sulle proprietà distintivo biofilm e / o condizioni ambientali. Poiché questi metodisono integrati, molteplici aspetti di informazioni possono essere ottenute simultaneamente. Informazioni combinato consente ai ricercatori di affrontare i problemi più complessi. Ad esempio, utilizzando questi metodi, abbiamo analizzato con successo lo sviluppo di biofilm e interspecie interazioni in biofilm sotto un gradiente di nutrienti. Questi metodi forniscono anche la capacità sperimentale per aumentare la complessità nella comunità microbica e l'ambiente chimico, che consente indagini sui processi biofilm in un contesto più realistico. Le potenziali applicazioni di questi metodi coprono diversi aspetti della ricerca biofilm, tra cui biofilm ciclo di vita, biofilm multispecie, biofilm eterogeneità, processi di trasporto in biofilm, e biofilm flusso interazione.

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Acknowledgments

Ringraziamo Matt Parsek presso l'Università di Washington (Seattle, WA) per la fornitura di P. aeruginosa e E. ceppi coli e Roger Nokes presso l'Università di Canterbury (Nuova Zelanda) per fornire l'accesso a software Streams. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01AI081983 dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive. Confocale è stata eseguita presso l'impianto di Northwestern Imaging biologica (BIF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic Pump Gilson Miniplus 3 Flow cell setup and inoculation
Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow Gilson F117934 Flow cell setup and inoculation
Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock Smiths Medical  MX9311L Flow cell setup and inoculation
Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels ML Solar LLC Flow cell setup and inoculation
Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 VWR 16157-191 Flow cell setup and inoculation
C-FLEX Tubing Cole-Parmer 06422-02 Flow cell setup and inoculation
1 ml TB Syringe BD 309659 Flow cell setup and inoculation
Polymer Tubing IDEX 1520G Flow cell setup and inoculation
Sterile Intramedic Luer Stub Adapter Clay Adams 427564 Flow cell setup and inoculation
PrecisionGlide Needle BD 305195 Flow cell setup and inoculation
Spectrophotometer HACH Flow cell setup and inoculation
Syringe filters - sterile (0.2 μm) Fisherbrand 09-719A Flow cell setup and inoculation
MAXQ Shaker Thermo Scientific Flow cell setup and inoculation
Ammonium sulfate Sigma Aldrich A4418 Growth media
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma Aldrich RES20908-A7 Growth media
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P5655 Growth media
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 Growth media
Magnisium chloride Sigma Aldrich M8266 Growth media
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 Growth media
Calcium sulfate dihydrate Sigma Aldrich C3771 Growth media
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 215422 Growth media
Manganese(II) sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634 Growth media
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich 451657 Growth media
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251 Growth media
Cobalt(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich C6768 Growth media
Sodium molybdate Sigma Aldrich 243655 Growth media
Boric acid Sigma Aldrich B6768 Growth media
Dextrose Sigma Aldrich D9434 Growth media
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Growth media
TCS SP2 Confocal Microscopy Leica Fluorescent imaging
SYTO 62 Life Technology S11344 Fluorescent imaging
Cy5 GE Healthcare Life Sciences PA15100 Fluorescent imaging
Red Fluorescent (580/605) FluoSphere Life Technology F-8801 Fluorescent imaging
BioSPA Packman Lab Image Processing
ImageJ NIH Image Processing
Volocity PerkinElmer Image Processing
Streams 2.02 University of Cantebury Image Processing

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References

  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, (2), 95-108 (2004).
  2. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, (3), 199-210 (2008).
  3. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64, (10), 4035-4039 (1998).
  4. Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  5. Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426, (6965), 439-442 (2003).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284, (5418), 1318-1322 (1999).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65, (1), 83-92 (1999).
  9. Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36, (19), 4775-4784 (2002).
  10. Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28, (2), 187-198 (2012).
  11. Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32, (8), 27-33 (1995).
  12. Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44, (5), 636-641 (1994).
  13. Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121, (1), 44-51 (1999).
  14. Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111, (3), 597-607 (2014).
  15. Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62, (5), 1264-1277 (2006).
  16. Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
  17. Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59, (3), 261-272 (1998).
  18. Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2, (6), 680-686 (2000).
  19. Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9, (3-4), 159-168 (1998).
  20. Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43, (11), 1131-1138 (1994).
  21. Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36, (7), 1653-1665 (2002).
  22. Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108, (11), 2571-2582 (2011).
  23. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, (10), 2865-2878 (2013).
  24. Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60, (12), 4339-4344 (1994).
Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità
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Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).More

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).

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