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Bioengineering

Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

doi: 10.3791/52602 Published: March 11, 2015

Abstract

Os biofilmes são comunidades microbianas em anexo de superfície que têm estruturas complexas e produzem heterogeneidades espaciais significativos. O desenvolvimento do biofilme é fortemente regulada pelo fluxo envolvente e ambiente nutricional. O crescimento do biofilme também aumenta a heterogeneidade do microambiente local, gerando campos de fluxo e os padrões complexos de transporte de solutos. Para investigar o desenvolvimento da heterogeneidade em biofilmes e interações entre biofilmes e sua micro-habitat local, nós crescemos biofilmes mono-espécies de Pseudomonas aeruginosa e biofilmes dual-espécies de P. aeruginosa e Escherichia Coli sob gradientes nutricionais em uma célula de fluxo de microfluidos. Nós proporcionam protocolos detalhados para a criação de gradientes de nutrientes dentro da célula de fluxo e para o crescimento e desenvolvimento de biofilme visualização sob estas condições. Nós também protocolos atuais para uma série de métodos ópticos para quantificar padrões espaciais na estrutura do biofilme, o fluxo distribuições sobre biofilmes, e transporte de massa ao redor e dentro de colônias de biofilme. Estes métodos apoiar investigações abrangentes do co-desenvolvimento de biofilme e habitat heterogeneidade.

Introduction

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Microorganismos se prendem às superfícies e biofilmes de formulário - agregados de células fechadas em uma matriz extracelular-polímero 1. Os biofilmes se comportam de forma muito diferente a partir de células microbianas individuais, pois biofilmes tem heterogeneidade espacial dramática resultante de uma combinação de limitações de transporte de soluto internos e variações espaciais no metabolismo celular 2,3. As concentrações de oxigênio e de nutrientes diminuem drasticamente na interface entre biofilme e em torno de fluido e se ainda mais empobrecido dentro no biofilme 2. As variações espaciais na respiração do biofilme e a síntese de proteínas também podem ocorrer como uma resposta ao oxigénio localizada a disponibilidade de nutrientes e 2.

Em ambientes aquáticos e do solo, a maioria das bactérias habitam em biofilmes. Biofilmes naturais realizar processos biogeoquímicos importantes, incluindo o ciclo do carbono e nitrogênio e reduzindo metais 4,5. Clinicamente, a formação de biofilme é responsvel para pulmonar prolongada e infecções urinárias 6. Infecções associadas ao biofilme são altamente problemático porque as células em biofilmes tem altíssima resistência aos antimicrobianos em comparação com os seus homólogos planctônicas 6. Porque biofilmes são importantes em diversos contextos, uma quantidade substancial de investigação tem-se centrado na compreensão dos fatores ambientais que controlam as atividades de biofilme e da heterogeneidade espacial em biofilmes e do microambiente circundante.

Estudos anteriores mostraram que o desenvolvimento do biofilme é fortemente regulado por uma série de factores ambientais: biofilmes desenvolver diferentes morfologias sob várias condições de fluxo; oxigênio e nutrientes disponibilidade influência morfologia biofilme; e tensões hidrodinâmicas afeta a fixação de células planctônicas a superfícies e o desprendimento de células de biofilmes 7-9. Além disso, a condição de escoamento externo influencia a entrega de substratos into e dentro de biofilmes 10. O crescimento de biofilmes também altera circundante condições físicas e químicas. Por exemplo, o crescimento de biofilme conduz à depleção local do oxigénio e nutrientes 2; biofilmes acumular compostos inorgânicos e orgânicos provenientes do ambiente circundante 11; e agrupamentos de biofilme desviar incremento da superfície de fricção do fluxo e 12,13. Porque biofilmes interagir com o seu ambiente circundante em formas muito complexas, é crítico para a obtenção simultânea das informações sobre as propriedades de biofilme e condições ambientais, e multidisciplinares precisam de ser usados ​​para caracterizar exaustivamente interacções-biofilme ambiente.

Aqui apresentamos uma série de métodos integrados para caracterizar padrões espaciais em crescimento microbiano dentro mono-espécies e biofilmes dual-espécies sob um gradiente nutricional imposta, bem como observar a modificação resultante do produto químico local e microambiente fluido. Nós firr descrevem a utilização de uma célula de dupla via de entrada de fluxo de microfluidos recentemente desenvolvido para observar o crescimento do biofilme sob gradientes químicos bem definidos. Em seguida, demonstrar a utilização dessa célula de fluxo de microfluidos para observar o crescimento de duas espécies de bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e, em biofilmes sob uma gama de condições nutricionais. Mostramos como na visualização situ de propagação marcador fluorescente em colônias biofilme pode ser usado para avaliar quantitativamente os padrões de transporte de soluto em biofilmes. Finalmente, mostra-se como microescala velocimetria de rastreamento de partículas, realizada sob microscopia confocal, pode ser usado para obter o fluxo de campo local em torno dos biofilmes em crescimento.

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Protocol

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1. Fluxo Setup celular e Inoculação

NOTA:. Use uma célula de fluxo microfluídicos dupla via de entrada descrito no Song et al, 2014 14 para crescer biofilmes. Esta célula de fluxo é capaz de criar gradientes químicos suaves bem definidos. O desenho da célula de fluxo é mostrado na Figura 1 e o fluxo de fabricação de células foi previamente descrito em Song et al., 2014 14. Aqui detalhes nossos métodos usando P. aeruginosa e E. coli para formar biofilmes, mas outras espécies podem também ser adequados. Usamos P. aeruginosa PAO1- GFP, que constitutivamente expressa uma proteína fluorescente verde (GFP), como um organismo modelo para o desenvolvimento do biofilme. Além disso, foi utilizado E. coli DH5ct de formar biofilmes mistos de espécies com P. aeruginosa. P. aeruginosa e E. estirpes de E. coli foram cultivadas em placas de LB-agar.

  1. Prepare a célula de fluxo usando polidimetilsiloxano (PDMS) vinculado a umlamela de vidro via tratamento de plasma de oxigênio, conforme descrito no 14. As dimensões da câmara de célula de fluxo são de 23 mm x 13 milímetros x 0,24 milímetros (comprimento x largura x profundidade).
  2. Prepare modificado FAB meio de crescimento 15. Para observar o crescimento do biofilme sob um gradiente nutricional dentro da célula de fluxo, introduzem modificado FAB média 15 com glicose 0,6 M em uma entrada e introduzir médio FAB sem qualquer fonte de carbono através da outra entrada. Filtrar a esterilizar (tamanho dos poros = 0,2 m) da solução de estoque de glucose (60 mM) antes de ser adicionada ao meio de FAB. Também autoclave o meio FAB com ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes do uso.
  3. Esterilizar o sistema de fluxo. Antes da inoculação, autoclave o caminho inteiro fluxo (médias garrafas, tubos, retentores de bolhas, as células de fluxo), utilizando o ciclo 1, excepto para as válvulas de três vias de plástico descartáveis ​​(e pré-esterilizado) situados a montante da célula de fluxo. (Válvulas de três maneiras são usadas para injetar células cultura, marcador fluorescente e micropérolas.) Para evitar a contaminação durante a montagem, cubra todos os tubos e conectores aberturas com folha de alumínio ou sacos de autoclave antes da autoclavagem.
  4. Ligue o sistema de fluxo. Montar os componentes do sistema de células de fluxo com cuidado (veja o vídeo para a montagem do sistema de fluxo) e entregar meio de crescimento para a célula de fluxo por meio de uma bomba peristáltica que controla com precisão a taxa de fluxo.
  5. Prepare cultura de células para inoculação através da transferência de uma colônia de P. aeruginosa ou E. coli a partir de placas LB a 3 ml de caldo LB e agitar a cultura O / N a 225 rpm e 37 ° C. Diluir o / n de culturas de células em 1 ml de água estéril para uma DO final 600 = 0,01 como o inoculo. (Cultura e diluir as bactérias numa câmara de fluxo laminar para evitar contaminação).
  6. Para as experiências com biofilmes de espécies mistas, diluir as duas culturas bacterianas a uma proporção de 1: 1 em 1 ml com uma DO 600 = 0,01 equivalente para cada bactéria.
  7. Inocular a célula de fluxo. Injectar 1 mL de inoculo para a entrada da célula de fluxo da válvula de três vias. Após a injeção, pausar o fluxo de 1 hora para permitir que as células bacterianas para anexar a tampa de vidro. (Certifique-se de que a célula de fluxo é colocado com o lado da lamela para baixo para permitir que as células suspensas para resolver sobre a lamela.)
  8. Após 1 h, retomar o fluxo e bombear o meio de crescimento para a célula de fluxo a uma taxa constante de 0,03 ml / min para cada entrada, durante 3 dias.

2. Caracterizar biofilme Desenvolvimento para a resposta aos nutrientes gradientes usando microscopia confocal

NOTA: P. aeruginosa pode ser trabalhada com GFP-constitutivamente expresso, mas E. coli em biofilmes mistos de espécies deve ser trabalhada por contracoloração.

  1. Observe os biofilmes de 3 dias usando microscopia confocal. Para os resultados representativos, observar biofilmes utilizando um microscópio confocal com um objetivo 63X. Antes de imagem, marcaa célula de fluxo dupla via de entrada com uma grade do lado da tampa de vidro. (A finalidade desta grelha é para permitir que o experimentador para localizar as regiões de imagem no interior da câmara de célula de fluxo.)
  2. Para contracoloração, dilui-se 10 ul de ácido nucleico mancha fluorescente vermelho célula-permeante, tal como mancha fluorescente verde ácido nucleico tal como STYO 62, solução-mãe (1 mM) em 990 ul de água esterilizada e depois injectar lentamente a mancha diluída utilizando uma seringa a câmara de célula de fluxo da válvula de três vias a montante. Manter a célula de fluxo estagnado e no escuro durante 30 min, em seguida, retomar o fluxo para lavar o corante libertado durante 15 min.
  3. Realizar imagem confocal. Ative a 488 nm laser de argônio para a excitação ea emissão coleta canais para GFP (500-535 nm) e mancha de ácido nucleico (por fluorescente mancha verde ácido nucleico, 650-750 nm). Ajuste ganhos e compensações para ambos os canais para ter imagens mais brilhantes e limpas. Select xyz e modo de gravação simultânea. Use o botão de controle z para identificar a parte inferior e superior do biofilme no campo. Definir o z-passo a 0,5 mm para aquisição de uma imagem da pilha de 3-D. (Para garantir a alta qualidade de imagem, use uma linha média de quatro para aquisição de imagem.)
  4. Para mapear os padrões espaciais de desenvolvimento de biofilme dentro da célula de fluxo, biofilmes imagem em três ou mais longitudinal (x) as distâncias ao longo da entrada da célula de fluxo, e em três transversal (y) posiciona em relação ao gradiente nutricional aplicada, como mostrado na Figura 1 .

3. Caracterizar Soluto Interno Transportes por injeções de Conservador Fluorescent Tracer

NOTA: Um marcador fluorescente conservadora, tais como Cy5, pode ser utilizado para caracterizar o padrão de transporte de solutos dentro do biofilme.

  1. Dissolve-Cy5 (mono-reactiva NHS Éster) em água a uma concentração final de 10 mg / ml como uma solução estoque. Guardar a solução estoque Cy5 em um congelador a -20 ° C.
    Nota: Como Cy5 é light-SensITive, loja, diluir e injetar soluções Cy5 no escuro.
  2. Antes das injecções do marcador fluorescente, tomar uma imagem da pilha de 3-D do biofilme de 3 dias com microscopia confocal (com uma objectiva 63X). (Regiões largas de colônias biofilme são ideais para observações de séries temporais de transporte corante.) Também escolher um z-plane com colônias bem separados para imagens (como mostrado na Figura 5A).
  3. Para cada experiência injecção Cy5, diluir 2 uL da solução de stock de Cy5 em 998 ul de água estéril para se obter uma solução para injecção com uma concentração de Cy5 20 ug / ml.
  4. Parar a bomba para interromper o fluxo e injectar a solução para o Cy5 a montante da célula de fluxo, utilizando uma seringa, através da válvula de 3 vias. (É importante evitar que as bolhas de ar que entra no percurso de escoamento durante a injecção. Retentores de bolhas deve ser mantida aberta durante a injecção de volta).
  5. Depois de injetar a solução Cy5, feche as armadilhas bolha, ajustar a válvula de 3 vias, e reiniciar obomba para fornecer a solução de Cy5 injectado para dentro da célula de fluxo.
  6. Mudar o modo de imagem confocal para XYT. Ative Cy5 e GFP canais sob o modo de gravação simultânea. Ajustar as definições confocal sobre Cy5 intensidade (intensidade do laser, ganhar e offset) para evitar a saturação sinais, o que é crítico para a quantificação. (Alta resolução temporal é o preferido para a visualização de penetração do corante. No entanto, digitalização rápida diminui a qualidade da imagem.) Escolha a velocidade de verificação adequada e média linha para equilibrar o tempo de resolução de imagem e qualidade de imagem. Para este protocolo usar uma média de linha de quatro e uma taxa de quadros de 0,15 Hz.
  7. Retomar o fluxo para entregar Cy5 para dentro da célula de fluxo (ainda a um caudal de 0,03 ml / min). Simultaneamente a hora de início da série confocal de imagem.
  8. Quantificar Cy5 penetração por radialmente média intensidade Cy5 dentro de uma colônia de biofilme circular 2-D. Para fazer a média, primeiro identificar a aresta de um cluster de biofilme, em seguida, gerar um mapa de distância para uma secção de 2-D do aglomeradoE, finalmente, os padrões de intensidade média radiais Cy5 para gerar uma curva de penetração (ver Figura 6).
    1. Para computacionalmente perceber o passo 3.8, utilize BioSPA (Análise de Padrões de biofilme Spatial) pacote de software (inédito pacote, software e manual disponível mediante pedido) ou outros programas de análise de imagem.
    2. Para usar BioSPA, primeiro importar uma imagem colocada em BioSPA. Em seguida, selecione limite adequado para os canais de GFP e Cy5 para fazer imagens binárias. No menu de análise / cálculo, selecione Análise Avançada e, em seguida, Análise de Difusão. Usar o canal GFP para definir a aresta de um cluster e utilizar a ferramenta polígono para seleccionar um cluster como a região de interesse (ROI).
    3. Clique duas vezes o cluster biofilme selecionado para realizar a análise de difusão. Salve os resultados da análise de difusão e calibrar a intensidade Cy5 a concentração Cy5 utilizando uma curva de calibração.
      1. Para gerar Cy5 curva de calibração de concentração, medir intensidades Cy5 durante um conce Cy5gradiente ntration sob microscopia confocal. (Intensidade e concentração Cy5 têm uma relação linear).

4. Caracterização torno campo do fluxo através do rastreamento Fluorescent Particles

NOTA: partículas fluorescentes, tais como micro-esferas fluorescentes, podem ser utilizados para caracterizar o campo de fluxo de cerca de biofilmes. Campo de fluxo em torno de biofilmes pode ser calculado a partir das observações de séries temporais de posições partículas usando software de monitoramento de partículas velocimetria. Os resultados aqui apresentados foram obtidos com o Streams 2,02 software pacote de 16 (download de software e manual do utilizador disponível em http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

  1. Dilui-se as microesferas fluorescentes (diâmetro de ~ 1 um) em água esterilizada a uma concentração de sólidos final de 0,2% e um volume final de 0,5 ml. Vortex para se certificar de que as microesferassão bem dispersa.
  2. Injectar e entregar as microesferas fluorescentes diluídas na célula de fluxo de acordo com procedimentos de passos 3.3 a 3.5. Para permitir um acompanhamento preciso do caminho partícula, use uma taxa relativamente baixa de fluxo (0,01 ml / h para os resultados de rastreamento de partículas neste artigo).
  3. Mudar configurações confocal modo para XYT para acompanhar o movimento de partículas em um z-slice e tomar imagens de séries temporais. (A taxa de quadros de 1 Hz foi utilizado para os resultados representativos apresentados no presente relatório.) Repita a injeção de partículas e imagem em diferentes locais z para gerar fluxo de campo 3-D.
  4. Pré-processo o tempo-series imagens confocal subtraindo-se o sinal de fluorescência de fundo (o sinal na primeira imagem obtida do conjunto imagem) usando ImageJ (download de software e manual disponível em http://imagej.nih.gov/ij/ ) ou outros programas.
  5. Em ImageJ, abra a primeira imagem de um conjunto de imagens e depois importar o conjunto de imagens. Em Processo de Imagem / Calculator, subtrair a primeira imagem do conjunto imagem. Salve o pré-processado conjunto imagem.
  6. Para calcular vetores de fluxo, de importação de séries temporais de imagens confocal em Streams 2,02. No âmbito da "visão de processo Open", selecionar e executar "Identificar partículas". Use limiar adequado para identificar partículas. Use 0,5 e 5 m como limites mínimos e diâmetro máximo de 1 mm partículas.
  7. Em seguida, em "view processo Open", selecionar e executar "PTV análise pipeline" para gerar caminhos de partículas. Confira os caminhos de partículas para ver se eles representam o movimento de partículas. Finalmente, selecionar e executar "Criar campo de velocidade" para gerar um mapa do vetor fluxo.

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Representative Results

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A célula de fluxo microfluidico dupla via de entrada permite a observação do crescimento do biofilme sob um gradiente de química bem definida formada pela mistura de duas soluções no interior da câmara de fluxo. O gradiente químico resultante foi anteriormente observado por injeção de corante e caracterizados em detalhe por Song et al. 14. Gradientes de concentração lisas foram formados na direcção transversal, tal como mostrado na Figura 1. O perfil de concentração foi íngreme perto da entrada e foi relaxada a jusante devido à difusão (Figura 1). Para observar o desenvolvimento de biofilme sob um gradiente nutricional, foi utilizado um meio definido mínima de crescimento (meio FAB) com glicose adicionado apenas para uma entrada como a única fonte de carbono. Isto originou um gradiente de glucose na câmara de célula de fluxo, enquanto todos os outros nutrientes, distribuídos de forma homogénea. O crescimento de P. biofilmes aeruginosa PAO1 foi fortemente correlacionado com a entrega local de glucose (Figura 2).À medida que o gradiente de concentração de glucose foi íngreme transversal próximo da entrada, a biomassa biofilme mostrou uma diminuição dramática da região alta concentração de glicose para a região de baixa glicose. À medida que o gradiente de glucose relaxado transversal a jusante, a biomassa do biofilme se tornou mais homogénea. Demonstramos ainda a utilização dessa célula de fluxo para estudar as interacções de P. aeruginosa e E. coli em biofilmes sob um gradiente de glucose (Figura 3). Os resultados mostraram que estas duas espécies apresentaram padrões espaciais distintas em crescimento em relação ao gradiente nutricional e, portanto, ocupado nichos ecológicos distintos: P. aeruginosa dominado biomassa biofilme em regiões com altas concentrações de glicose e E. coli dominados em zonas com concentrações baixas de glucose (Figura 3).

Para entender o feedback entre o crescimento do biofilme e do ambiente circundante fluxo, caracterizamos o campo de fluxo em torno crescente biofilmes de fluorescente velocimetria de trajetórias de partículas em microscopia confocal. O movimento observado das microesferas fluorescentes injectados é mostrada em 1. Filme local informação vectorial de fluxo foi extraído a partir de uma média de pelo menos 4200 medições discretas de velocidades das partículas utilizando o pacote de software Streams. Mapeamento tridimensional do campo de fluxo foi obtido seguindo partículas em várias posições verticais (Figura 4). Aumentou significativamente o crescimento do biofilme heterogeneidade de fluxo (Figura 4). Fluxo perto da base biofilme desviado em torno de clusters de biofilme, levando ao aumento da heterogeneidade e diminuição da velocidade (Figura 4). Fluxo de topo biofilme tem uma velocidade mais elevada e é mais homogénea (Figura 4).

Para compreender a heterogeneidade interna causada pelo transporte de solutos limitada dentro de biofilmes, observou-se o transporte de Cy5 dentro de biofilmes por microscopia confocal. Penetração Time-seriesde Cy5 em um cluster de biofilme é mostrado no filme 2. As séries de tempo Cy5 curvas de penetração é mostrado no filme 3. O coeficiente de difusão efetivo de Cy5 em biofilmes foi calculada pela montagem de um modelo de difusão 1-D para os perfis de concentração Cy5:

Equação 1

em que C é a concentração média de Cy5 radialmente calculada a partir da intensidade de fluorescência, e é a distância no biofilme 17. Cy5 mostraram a mais alta concentração no fluxo de massa e diminuição acentuada ao entrar no biofilme (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. célula de fluxo microfluídicos dupla via de entrada. Gradientes de glicose lisos foram criados dentro da câmara de fluxo através da introdução de médio FAB para as duas entradas com uma fonte de carbono (gluco SE) fornecida em apenas uma entrada. resultando em padrões de glicose dentro da célula de fluxo são indicados pelo sombreado. Sombreado escuro representa as concentrações de glucose mais elevadas. Imagiologia confocal foi realizada em nove locais na célula de fluxo. Os resultados apresentados nas Figuras 2 e 3 referem-se às posições numeradas 1-9 na figura. Este valor é modificado após Song et al. (2014), Fig. 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. PAO1 crescimento do biofilme sob gradientes de glicose. Biofilmes PAO1 3 dias foram fotografadas nos nove locais mostrados na Figura 1. Grade espaçamento = 18 mm para imagem 1-8 e 24 mm para 9 imagem.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. O desenvolvimento de P. aeruginosa e E. coli biofilmes dual-espécie sob gradientes de glicose. P. aeruginosa constitutivamente expressa GFP, e os biofilmes também foram contrastadas por SYTO 62, que é uma mancha de ácido nucleico geral. As imagens mostradas aqui são sobreposições de GFP (verde) e SYTO 62 (vermelho) canais. P. portanto aeruginosa parece verde ou amarela (verde + vermelho), e E. coli aparece em vermelho. Barras de escala = 47 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Campos Figura 4. Fluxo de velocidade vectores pelo z = 4, 10 e 16 mm em torno de um conjunto de biofilme. O comprimento da seta representa a magnitude da velocidade. Velocidade de fluxo baixo mostra a base de biofilme (z = 4, setas azuis). O fluxo é mais homogênea perto top biofilme (z = 16, setas vermelhas). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Cy5 penetração em biofilmes. (A) confocal micrografia em z = 18 mm que mostra a penetração parcial de Cy5 em clusters de biofilme em t = 190 seg. Barras de escala = 10 um. (B) resultante com padrões de concentração Cy5 mapa. (C) o perfil de concentração de Cy5 em um agrupamento de biofilme. "Target =" _ 602fig5large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Procedimentos para gerar um perfil de penetração Cy5 Esquerda:. ROI seleccionado contendo um aglomerado de biofilme 2-D. Médio: Distância mapa do cluster biofilme. Direita: radialmente média perfil Cy5 intensidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Filme 1 : Movimento de partículas fluorescentes injetados cerca de clusters de biofilme (vídeo confocal).

Filme 2 : Propagação de Cy5 em clusters de biofilme (vídeo confocal).

_content "> Filme 3 : Propagação de Cy5 em clusters de biofilme (concentração perfis de vídeo).

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Discussion

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Nós demonstramos um conjunto de métodos para caracterizar três importantes interações biofilme-ambientais: resposta biofilme para gradientes químicos, efeitos do crescimento do biofilme sobre o microambiente fluxo envolvente, e heterogeneidade biofilme resultante de limitações de transporte interno.

Nós mostramos pela primeira vez o uso de uma nova célula de fluxo de microfluidos para impor um gradiente de química bem definida para o desenvolvimento do biofilme. Para criar um gradiente de química bem definida dentro da célula de fluxo, é importante para manter a mesma taxa de fluxo para ambas as entradas. Certifique-se de que a bomba peristáltica está bem ajustada para ambos os canais de fluxo para fornecer o meio de cultivo com a mesma velocidade. Também certifique-se que não há obstrução no caminho do fluxo durante o crescimento do biofilme. Observações do crescimento de biofilmes dual-espécies neste show célula de fluxo que gradientes químicos afetou muito o crescimento do biofilme e interações inter-espécies dentro de biofilmes. Gradientes químicos são comuns emambientes onde biofilmes crescer, devido a uma combinação de limitações de transporte, ligação química e reações, e captação e metabolismo microbiano 18-20. Esta célula de fluxo microfluidico permite investigações de diversas actividades biofilme sob um intervalo definido de condições químicas dentro de um único dispositivo. Por exemplo, esta célula de fluxo foi demonstrado ser útil para o estudo da morte biofilme sob um gradiente de 14 antimicrobiano.

Nós, então, demonstrou o uso de rastreamento de partículas velocimetria de observar o campo de fluxo em torno de clusters de biofilme. Para garantir um controle mais preciso das partículas fluorescentes injectados, o caudal tem de ser optimizado. Normalmente, a baixa taxa de fluxo permite o movimento das partículas a serem capturados no campo de vista confocal. Também a taxa de quadros de varredura precisa ser otimizado para equilibrar qualidade de imagem e resolução de tempo. Se as partículas se movem muito rápido para capturar o movimento, use linha inferior ou quadro médio ou increvelocidade de digitalização ase. Foram mapeados o campo de fluxo em três posições verticais ao longo de um cluster de biofilme, e descobriram que o crescimento do biofilme aumentou o fluxo de heterogeneidade. A caracterização do campo de fluxo em torno de biofilmes permite interações fundamentais fluxo-biofilme a ser explorado. Por exemplo, este pode ser usado para avaliar os mecanismos que regulam o arrasto de fluido e de cisalhamento sobre o biofilme, e a falha de biofilme resultante e descolamento das células a partir da superfície de 1,21. Estes processos são importantes para o entendimento tanto os efeitos de biofilmes em sistemas de fluxo (por exemplo, a incrustação biológica) e regulamentação do biofilme morfologia 8. Condições de escoamento ao redor de biofilmes também controlam o transporte de massa, o que é importante para uma ampla gama de processos de biofilme. Por exemplo, a velocidade do fluido no local de superfície do biofilme influencia a entrega de nutrientes e substratos para biofilmes através advection 22.

Finalmente, mostrou que a utilização de injecção de marcadores fluorescentes para analisarpadrões de transporte de soluto dentro do biofilme. Usamos Cy5 aqui como traçador conservador, e este fluor parece muitas vezes se comportam de forma conservadora em biofilmes 23. Portanto, os resultados devem ser representativos dos padrões de transporte de solutos neutros, não reactivos em biofilmes. Os resultados mostraram uma diminuição acentuada da concentração Cy5 perto da superfície do biofilme, obtendo-se uma concentração de Cy5 no interior do biofilme apenas ~ 50% da concentração no fluxo de massa. Tais perfis de concentração íngremes são consistentes com as medidas anteriormente relatados de oxigênio, nutrientes e agentes antimicrobianos dentro de biofilmes 2,24. Curvas de penetração Cy5 fornecer informações sobre a difusão de soluto em aglomerados de biofilme. No entanto, o método que apresentamos aqui é limitado a analisar 2-D transporte de solutos em (XY) planos horizontais em biofilmes. Com capacidade mais recente fast-imagem, por exemplo girando microscopia confocal disco, penetração do corante também pode ser visualizado em 3-D dentro de biofilmes, which permitirá uma investigação sobre os processos de transporte vertical. Além disso, marcador fluorescente e as partículas podem ser injectados em conjunto para obter informação de condições de escoamento externos e transporte de soluto interno, ao mesmo tempo. Essa informação é útil para diferenciar transporte de solutos advective e difusora entre fluxo em massa e biofilmes e para avaliar o efeito do fluxo externo no transporte de solutos interno em biofilmes.

No geral, nós apresentamos os protocolos detalhados de célula utilizando um novo fluxo de microfluidos que fornece bem definida gradientes químicos para o estudo das respostas de biofilme para estímulos químicos no ambiente. Para melhor caracterizar a heterogeneidade em biofilmes e seu microhabitat circundante, que aqui apresentamos métodos para caracterizar os padrões, tanto no campo de fluxo em torno de biofilmes e transporte de solutos interna dentro biofilmes. Cada método fornece informações distintivo em propriedades de biofilme e / ou condições ambientais. Uma vez que estes métodossão integrados, vários aspectos da informação podem ser obtidos simultaneamente. Informações combinadas permite aos pesquisadores para abordar problemas mais complexos. Por exemplo, usando estes métodos, analisados ​​com sucesso o desenvolvimento do biofilme e inter-espécies em biofilmes interacções sob um gradiente de nutrientes. Estes métodos também proporcionam capacidade experimental para aumentar a complexidade na comunidade microbiana e química no ambiente, o que permite investigações sobre os processos de biofilme em um contexto mais realista. As aplicações potenciais destes métodos abrangem diversos aspectos da pesquisa biofilme, incluindo ciclo de vida de biofilme, biofilmes multiespe, a heterogeneidade de biofilme, processos de transporte em biofilmes, e interação biofilme-flow.

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Acknowledgments

Agradecemos Matt Parsek na Universidade de Washington (Seattle, WA) para a prestação de P. aeruginosa e E. coli e Roger Nokes da Universidade de Canterbury (Nova Zelândia) para fornecimento de acesso a software córregos. Este trabalho foi financiado pela concessão R01AI081983 dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. Imagem confocal foi realizada no Facility Northwestern Imagem Biológica (BIF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic Pump Gilson Miniplus 3 Flow cell setup and inoculation
Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow Gilson F117934 Flow cell setup and inoculation
Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock Smiths Medical  MX9311L Flow cell setup and inoculation
Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels ML Solar LLC Flow cell setup and inoculation
Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 VWR 16157-191 Flow cell setup and inoculation
C-FLEX Tubing Cole-Parmer 06422-02 Flow cell setup and inoculation
1 ml TB Syringe BD 309659 Flow cell setup and inoculation
Polymer Tubing IDEX 1520G Flow cell setup and inoculation
Sterile Intramedic Luer Stub Adapter Clay Adams 427564 Flow cell setup and inoculation
PrecisionGlide Needle BD 305195 Flow cell setup and inoculation
Spectrophotometer HACH Flow cell setup and inoculation
Syringe filters - sterile (0.2 μm) Fisherbrand 09-719A Flow cell setup and inoculation
MAXQ Shaker Thermo Scientific Flow cell setup and inoculation
Ammonium sulfate Sigma Aldrich A4418 Growth media
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma Aldrich RES20908-A7 Growth media
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P5655 Growth media
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 Growth media
Magnisium chloride Sigma Aldrich M8266 Growth media
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 Growth media
Calcium sulfate dihydrate Sigma Aldrich C3771 Growth media
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 215422 Growth media
Manganese(II) sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634 Growth media
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich 451657 Growth media
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z0251 Growth media
Cobalt(II) sulfate heptahydrate Sigma Aldrich C6768 Growth media
Sodium molybdate Sigma Aldrich 243655 Growth media
Boric acid Sigma Aldrich B6768 Growth media
Dextrose Sigma Aldrich D9434 Growth media
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Growth media
TCS SP2 Confocal Microscopy Leica Fluorescent imaging
SYTO 62 Life Technology S11344 Fluorescent imaging
Cy5 GE Healthcare Life Sciences PA15100 Fluorescent imaging
Red Fluorescent (580/605) FluoSphere Life Technology F-8801 Fluorescent imaging
BioSPA Packman Lab Image Processing
ImageJ NIH Image Processing
Volocity PerkinElmer Image Processing
Streams 2.02 University of Cantebury Image Processing

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References

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Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade
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Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).More

Li, X., Song, J. L., Culotti, A., Zhang, W., Chopp, D. L., Lu, N., Packman, A. I. Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity. J. Vis. Exp. (97), e52602, doi:10.3791/52602 (2015).

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