Abstract
Typ 2-diabetes är en kronisk sjukdom som drabbar 382 miljoner människor under 2013, och förväntas stiga till 592 MSEK år 2035 1. Under de senaste två decennierna, roll betacellfunktion vid typ 2-diabetes har tydligt etablerat 2. Forskning framsteg har krävs metoder för isolering av pankreatiska cellöar. Protokollet av holmen isolering presenteras här delar många gemensamma steg med protokoll från andra grupper, med vissa ändringar för att förbättra avkastningen och kvaliteten på isolerade öar från både vildtypen och diabetes Lepr db (db / db) möss. En live-cell 2-fotonen avbildningsmetod presenteras sedan som kan användas för att undersöka kontrollen av insulinutsöndring inom holmar.
Introduction
Rollen av betacellfunktion i sjukdom har allmänt erkänd 3,4. Cellinjer som MIN6 och INS-1 är användbara verktyg för att förstå biologi betacellbeteende. Men den fysiologiska kontrollen av insulinutsöndring sker inom Langerhanska öarna. Dessa öar innehåller tusentals tätt packade betaceller, såväl som blodkärlen och andra endokrina celltyper. Denna miljö inom holmen påverkar insulinutsöndring och kommer sannolikt att vara viktig vid diabetes. Därför att förstå den fysiologiska kontrollen av insulinutsöndring, och patofysiologi sjukdom är det viktigt att studera intakta öar.
Islet isolering
Live humana öar och, i synnerhet, humana öar från typ 2-diabetespatienter är svåra att få tag på. Dessutom, mänskliga holmar har begränsade möjligheter till experimentell molekyl manipulation. Forskare har därför används ärlåter från djur och djurmodeller för typ 2-diabetes. En sådan modell sjukdom är db / db-mus. Detta är en spontan mutation som modeller typ 2-diabetes med en fenotyp progression som nära paralleller mänskliga sjukdomar 5,6. Protokollet presenteras här för holme isolering från diabetiska db / db möss har många steg i likhet med andra grupper med vissa förbättringar för bättre avkastning, rening och ökad holme överlevnad.
2 fotonavbildning
Den levande cell 2-fotonen analysen beskrivs här gör det möjligt för forskare att kvantifiera antalet och utvärdera egenskaperna hos enskilda insulininnehållande granulat från många celler av diabetiker 7 och vildtyp cellöar 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla nuvarande försök utfördes enligt lokala djuretiska förfaranden vid University of Queensland (godkända av University of Queensland, Anatomiska Biosciences etikkommitté).
1. Islet Isolering
- Reagensberedning
- Blandning av enzymer
- För bukspottkörtel matsmältning, använder en blandning av Liberase och kollagenas typ IV. Späd Liberase TL (termolysin lågt) 1 injektionsflaska med 5 mg med 26 ml DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle-medium).
- Förbered kollagenas typ IV i Hanks buffert vid en koncentration av 0,5 mg / ml, kompletterat med 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNas och 1 mg / ml bovint serumalbumin.
- Blanda Liberase TL och kollagenas lösningar i ett förhållande av 4: 1 (räknat på volymen), det vill säga, 4 ml Liberase TL + 1 ml kollagenas. Alikvotera blandning av enzymer för att 2,5 ml vardera och förvara vid -20 ° C.
OBS! Vävnads inkubationstider vari lite mellan satser av enzym (30 sek till 1 min skillnad). Därför kan en satstest krävas.
- RPMI-isoleringsmedia
- Lös upp en flaska med RPMI 1640 pulver i 1 liter vatten vid RT och komplettera med 2 g NaHCOs 3, 4,02 g HEPES.
- Kombinera RPMI isoleringsmedia i en stor konisk kolv, blanda med magnetomrörare, justera till pH 7,4 med NaOH, filtersterilisera och lagra vid 4 ° C.
- RPMI Kultur Media
- Använd RPMI odlingsmedium, med 10% fetalt bovint serum och 1% antibiotika (dvs., penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 ^ g / ml).
- Blandning av enzymer
- Islet Isolering och odling
- Djuroffer
- Offra möss genom cervikal dislokation eller CO 2 kvävning enligt den lokala institutionens etikförfaranden. Spraya mus kroppen noggrant med 70% etanol.
- Pankreatiskt Perfusion
- USE två långa snitt i sidled genom bukhuden och bukhinnan för att göra en V-formad flik. Dra fliken på huden upp för att avslöja hela bukhålan, lägga undan tarmen och hålla levern på plats av ett vikt mjukpapper för att avslöja den gemensamma gallgången (figurerna 1 och 2). Avliva djuret så att huvudet mot kirurgen och svansen bort från kirurgen.
- Applicera en vaskulär klämma vid ampulla på tolvfingertarmen väggen för att blockera de injicerade enzymerna kommer in i tolvfingertarmen (fig 1).
OBS: Detta är ett viktigt steg eftersom det avgör om de injicerade enzymerna kommer att gå in i bukspottskörteln kanalen och BEGJUTA bukspottkörteln eller reflux till injektionsstället (över klämma) eller gå in i tolvfingertarmen (under klämma). - Kanylera gemensamma gallgången med en 31 G nål nära korsningen av den gemensamma leverkanalen och cystisk kanal (figur 1) och lämna utrymme för en andra injektion om the bukspottkörteln inte BEGJUTA första gången. Långsamt (över ~ 10 sek) injicera ca 2 ml kall enzymblandning i musen gemensamma gallgången.
OBS: bukspottkörtel skall perfunderas snabbt om klämman är i rätt position. - Justera klämman position om nålen är inne i gallgången, men kan inte BEGJUTA bukspottkörteln (dvs., Flytta upp klämman en bit bort från levern om över fastklämd eller flytta det ner en bit till levern om det enligt fastklämd).
OBS: Nålen går ibland in i den omgivande kapseln snarare än lumen i kanalen. En användbar tecken för att kontrollera om nålen är inne i gallgången är utvidgning av kanalen när du injicerar. Om bukspottkörteln inte BEGJUTA, är ett alternativ enzymblandningen kan injiceras till flera platser i bukspottkörteln med lägre avkastning förväntas. Den perfusion av den vänstra platsen i bukspottkörteln (mjälten lob) är viktigt för maximering av holmen avkastning. - Efter bukspottkörteln är perfused, snabbt ta bort bukspottkörteln, lägg den i en injektionsflaska (~ 20 ml, glas) och inkubera i ~ 19 minuter i ett 37 ° C vattenbad.
OBS: Inkubationstiden kan variera lite beroende på musstammen och ålder. - Efter inkubationstiden, stoppa rötningsprocessen genom att lägga ~ 20 ml kall isoleringsmedia. Skaka flaskan försiktigt för att störa bukspottkörteln och häll det genom en normal te sil (pordiameter av 1 mm) i ett sterilt 50 ml rör. Fyll röret med isoleringsmedia och centrifugera vid 400 xg under 1 min vid 4 ° C med broms av.
- Lös upp pelletten i isoleringsmedia igen och överföra till två 15 ml rör och centrifugera sedan vid 400 xg under 1 min vid 4 ° C med broms av. Efter aspiration av supernatanten, blanda de två pelletarna väl med 6 ml densitetsgradient cellseparationsmedia (Histopaque 1077 lösning) per rör genom virvling eller pipettering upp och ned. Sedan försiktigt lägga ~ 6 ml av isoleringsmedia till sidan av röret ovanpåDensitetsgradienten separationsmedia och centrifugera vid 100 xg under 15 min vid 4 ° C med broms av.
- Samla supernatanten i den övre (isoleringsmedia), mellersta och nedre (densitetsgradient cellseparationsmedier) skikt 3 separata rätter. Handpick öarna i dessa tre rätter, genom att använda en pipett under ett dissektionsmikroskop.
OBS: Det mellersta skiktet innehåller de flesta av cellöarna. Cellöar redovisas som kompakta strukturer av ~ 50 till 500 | im i storlek (Figur 3). Vi får ~ 200 öar i WT möss och 300- <100 öar i db / db-möss.
- Islet Odling
- För att hjälpa cellöarna återhämta från enzymdigerering, odlings grupper om 40 cellöar i en 25 cm petriskål med 6 ml RPMI-odlingsmedier (10 mM glukos) vid 37 ° C, 5% / 95% CO2 / O 2 för två dagar före levande -cell två-foton-avbildning. Ändra odlingsmediet dagligen.
- Djuroffer
2. Levande cell 2-Photon Imaging
- Reagensberedning
- Extracellulär Buffert
- Förbered natrium rik extracellulär buffert för två-foton-analys med 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCOs 3 och 10 mM HEPES.
- Extracellulär Färgämne
- För två-foton-analysen, förbereda lager SRB 8 mM i extracellulär buffert, alikvot i små rör och förvaras vid -20 ° C. Späd aktie SRB 1:10 i färskt extracellulära buffert för att få en arbetskoncentration av 0,8 mM.
- Extracellulär Buffert
- foton Imaging
- Först, för-inkubera 2 dagar odlade cellöar i 3 mM glukos extracellulär buffert under 30 minuter.
OBS: Vi använder holmar mellan 2 och 5 dagar i odling. - Sedan placera en glasskiva på termokontrollkammaren monterad på mikroskop scenen. Använd fett för att förhindra läckage av lösningen.
- Täck kammaren med 500 | il av extracellular buffert innehållande 0,8 mM SRB med olika glukoskoncentrationer (3 mm, 6 mm, 15 mm och 20 mM glukos).
- Därefter placerar förinkuberades ö i mitten av kammaren och fokusera på 3-4 cellager i holmen där, i gnagare holmar, immunfärgning för insulin visar att de flesta celler är betacellerna.
OBS: SRB kommer att beskriva alla cellmembran holmen snabbt och den lilla ön är redo att bilden. - Använd en 2-photon mikroskop med en 60X oljeimmersion mål (NA 1,42) och bildprogram (t.ex.., Scanimage 11). Figur 4 illustrerar ett typiskt mikroskopi arrangemang. Bild exocytiska händelser med SRB som ett membran ogenomtränglig fluorescerande extracellulärt markör exciteras av femtosecond laserpulser på 880 nm, med fluorescens detekteras vid 550-650 nm. Spela ö-svar på stimulering.
- Identifiera enskilda exocytiska händelser av det plötsliga uppdykandet av en liten fluorescerande fläck (upplösning 10 pixlar /1, m) och bekräfta med den snabba stigande fasen av fluorescerande signal över ett område av intresse (~ 0,78 um 2).
- Först, för-inkubera 2 dagar odlade cellöar i 3 mM glukos extracellulär buffert under 30 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Islet utbyte och rening
För en normal vildtyp mus, är cirka 200 holmar väntat. Friska holmar ser ljust, rund och ha en jämn kant. En över omsatta isolering parti har oftast små och luddiga holmar medan en underdiger parti har färre holmar och acinära cell bifogade holmar (Figur 3). För diabetiker db / db-möss, holmen avkastning och utseende beror på sjukdomsförloppet med bättre glycemic möss har större, ljusare och mer holmar (upp till 300 öar) jämfört med värre glycemic möss som har mindre öar med ett genomskinligt utseende (under 100 cellöar)
2-foton-analysen
2-foton-avbildning är en indirekt analys för att mäta insulinutsöndring vid nivån av enda insulin granul fusion. Som svar på stimuli, såsom glukos eller hög kalium, insulin granuler smälta samman med plasmamembranet och den extracellulära färgämnet SRB inträder the granulat vilket resulterar i uppkomsten av en plötslig fluorescerande fläck ~ 400 nm i diameter (Figur 5). Olika experiment har utförts för att validera denna analys som ett mått på fusion av insulininnehållande granuler såsom glukos dosberoende av ökande antal granul fusionshändelser med den förväntade mängden av insulinsekretion, den konsekventa storleken på de svarade cellerna i 2 fotonen med den för en beta cell, liknande granul diameter mätt med två foton- och elektronmikroskop, den colocalization av färgämnesupptag och insulin färgning 8.
Inom tiden för inspelningen, är alla exocytiska händelser som reaktion på stimulus identifieras och platsen för händelserna, tidpunkten för utseendet, varaktighet och typ av fusions händelser som kiss-and-run eller full fusion karakteriseras ( Figur 5, 6). Dessa egenskaper hos svetsprocessen är värdefulla för att bedöma eventuella brister i granulat fusion i modeller för typ 2-diabetes. Vår tidigare rapport med den här metoden visar att felet i diabetiska db / db holmar är förlusten av hela korn fusion och inte en förändring i egenskaperna hos kinetiken enskilda granulat fusion 7. Dessutom visar vi att den största faktorn i den minskade i insulinutsöndring i sjukdom är en minskning i antalet svarande celler 7.
Figur 1:. Ett diagram av platserna för kläm- och injektion Injicera enzymerna till den gemensamma gallgången nära korsningen av den gemensamma leverkanalen och cystisk kanal. Kläm fast ampulla av Valter av en kärlklämma för att underlätta den injicerade enzymet till bukspottkörtelgången.
2632fig2.jpg "/>
Figur 2: Injektionsprocessen i mössen. Top siffra visar nålen inuti den gemensamma gallgången med en kärlklämma appliceras på ampulla av Valter. Botten siffra visar Liberase-perfusion bukspottkörteln efter injektion.
Figur 3: Typiska bilder av vild typ och db / db isolerade öar (A) vildtyp isolerade öar.. (B) db / db-isolerade cellöarna. (C) Under omsatta holmar med bifogade acinarceller (pilar). (D) Över omsatta holmar med små och luddiga holmar (pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. De viktigaste komponenterna i skräddarsydda 2 fotonen mikroskop Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på en enda insulin granulat fusions händelsen som spelats in med 2 foton mikroskopi Vänster siffra representerar cellen före (A) och efter (B) utseendet på en exocytisk händelse (pilen) som svar på 15 mM glukosstimulering.. (C) illustrerar SRB märkning med inmatning av den extracellulära färgämnet SRB i granulen när den smälter med plasmamembranet. (D) visar fluorescensintensiteten över en region av intresse av ett exocytiska händelsen liksom Sequential bilder av denna exocytisk händelse (skala bar 1 pm). Bild modifierad från Do et al 2014 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Svaren av vildtypen och diabetiska db / db öar under 2-fotonen mikroskop med SRB som den extracellulära färgämnet I dessa experiment insulin granulat fusionshändelser som svar på 15 mM glukosstimulering registreras. Gula cirklar är platser i de exocytiska händelser under 20 min inspelning. Bild modifierad från Do et al 2014 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiska faktorn i holmen isolering är den initiala perfusion av bukspottkörteln; en under perfusion pankreasresulterar i en betydligt lägre holme avkastning. Andra faktorer påverkar också isolerings beskaffade uppslutningstiden och nivån av skakning vilket delvis kan kompensera för den nivå av perfusionen. Till exempel kommer ett fullt perfusion bukspottkörtel måste inkuberas vid 37 ° C under ~ 18 min 30 sek under omskakning försiktigt, i motsats en under digere bukspottkörteln kan kräva ~ 20 min spjälkning med hårdare skakning. Blandningen av två rötnings enzymer i våra händer ger bättre holme isolering än endera ensam. För kollagenas enda metoden, uppslutningstiden påverkar kritiskt holmen avkastning och tidsskillnader på endast 30 sekunder kan dramatiskt påverka kvaliteten. För Liberase bara är utbytet godtagbara men under matsmältning händer ibland, vi tror att tillsättningen av kollagenas hjälper till att smälta bindväv bättre.
Det finns ett antal möjliga experiment som kan utföras efter det att cellöarna har isolerats. Isolerade cellöar kan fixeras i paraformaldehyd eller metanol omedelbart efter isolering och används i immunofluorescens-färgning för att bestämma läget för proteiner av intresse 10. Isolerade cellöar kan dispergeras i till enstaka celler. Detta kan göras på samma dag av holme isolering eller efter några dagar av holme kultur. De enskilda celler stryks sedan ut och det är denna beredning som har varit stöttepelaren för tekniker såsom patch clamp och total inre reflektion mikroskopi. I experiment som mäterinsulinsekretion, liksom för live-cell 2-fotonen avbildning, har vi funnit att holmar kräver 2 dagar i odling för att ge reproducerbara data. Vad händer i kultur är inte väl förstått, men tros vara en period av återhämtning från isoleringen och rötningsprocessen.
Tekniken 2-fotonen presenteras här ger forskarna möjlighet att bilden insulinutsöndringsprocessen i nivå med enskilda granulat fusion från många celler i intakta cellöar. Vi har funnit att antalet granulat fusions händelser och deras timing är förenligt med de belopp och tidsmässiga profil insulinutsöndring 8. Detta tyder på att metoden att upptäcka de flesta av insulin granulatfusionshändelser. Med tanke på att färgämne inträde i de smält granulerna är inte en specifik metod för att detektera insulin granulat fusion händelser som vi har gått till stora ansträngningar för att genomföra kontrollexperiment för att visa att insulingranulat fusion i betaceller studeras 7,8
Det finns ett antal tekniska problem med 2-fotonen mikroskop som är generiskt för alla avbildning. Till exempel, vi noggrant balansera motstridiga faktorer för att försöka få tillräckligt med ljus för att öarna, så att vi kan minska förstärkningen av detektorerna, och därmed minska buller, med att sätta så mycket ljus i de holmar som vi orsakar cellskador. I vårt system, är en Pockels cell som används för att dämpa den pulsade lasern (fig 3); alla kommersiella system har mekanismer för att ändra intensiteten hos ljus som faller in på provet.
Sammanfattningsvis, en kombination av noggrann isolering av db / db holmar och hela-ö 2 fotonen mikroskopi närvarande nya möjligheter att studera processerna för insulinutsöndring och bestämma de viktigaste defekta delarna i typ 2-diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
