Abstract
Type 2-diabetes er en kronisk sygdom, der påvirker 382 mio mennesker i 2013, og forventes at stige til 592 millioner i 2035 1. I løbet af de sidste 2 årtier, rolle beta-celle dysfunktion hos type 2-diabetes har klart fastslået 2. Forskning fremskridt har krævet metoder til isolering af Langerhanske øer. Protokollen af holmen isolation præsenteres her deler mange fælles skridt med protokoller fra andre grupper, med nogle ændringer for at forbedre udbyttet og kvaliteten af isolerede øer fra både vildtype og diabetisk Lepr db (db / db) mus. En live-cell 2-foton imaging metode er da præsenteret som kan anvendes til at undersøge kontrollen med insulinsekretion inden øer.
Introduction
Den rolle, som beta-celle dysfunktion i sygdom er blevet bredt anerkendt 3,4. Cellelinjer såsom MIN6 og INS-1 er nyttige værktøjer til at forstå biologi beta celle adfærd. Men den fysiologiske kontrol af insulinsekretion finder sted inden for de Langerhanske øer. Disse øer indeholder tusinder af tætpakket betaceller, samt blodkar og andre endokrine celletyper. Dette miljø inden holmen påvirker insulinsekretion og vil sandsynligvis være vigtigt i diabetes. Derfor, for at forstå den fysiologiske kontrol af insulinsekretion, og patofysiologien af sygdom, er det vigtigt at studere intakte øer.
Islet isolation
Levende menneskelige holme og især humane øer fra type 2-diabetikere er vanskelige at opnå. Desuden humane øer har begrænsede muligheder for eksperimentel molekylær manipulation. Forskere har derfor anvendes, erlader fra dyr og dyremodeller af type 2-diabetes. En sådan sygdomsmodel er db / db mus. Dette er en spontan mutation, modeller type 2-diabetes med en fænotype progression, der nøje paralleller human sygdom 5,6. Protokollen præsenteres her for holm isolation fra diabetiske db / db-mus har mange trin til fælles med andre grupper med nogle justeringer for bedre udbytte, rensning og forbedret ø overlevelse.
2 foton billedbehandling
Den levende celle 2-foton-assayet beskrevet her giver forskere at kvantificere antallet og evaluere egenskaberne af enkelt insulin-holdige granuler fra mange celler af diabetisk 7 og vildtype holme 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle nuværende eksperimenter blev udført i henhold til lokale dyr etik procedurer University of Queensland (godkendt af University of Queensland, Anatomisk Biosciences etiske komité).
1. Islet Isolation
- Reagens forberedelse
- Blanding af enzymer
- For bugspytkirtlen fordøjelse, skal du bruge en blanding af Liberase og collagenase type IV. Fortynd Liberase TL (thermolysin lav) 1 hætteglas med 5 mg med 26 ml DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium).
- Forberede collagenase type IV i Hanks puffer ved en koncentration på 0,5 mg / ml, suppleret med 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNAse og 1 mg / ml bovint serumalbumin.
- Bland Liberase TL og collagenase løsninger i et forhold på 4: 1 (efter volumen), dvs., 4 ml Liberase TL + 1 ml collagenase. Alikvot blandingen af enzymer til 2.5ml hver og opbevares ved -20 ° C.
BEMÆRK: De væv inkubationstider vAry en smule mellem batches af enzym (30 sek til 1 min forskel). Derfor kan det være nødvendigt en batch test.
- RPMI Isolation Media
- Opløs et hætteglas af RPMI 1640 pulver i 1 liter vand ved stuetemperatur, og supplere med 2 g NaHCO3, 4,02 g HEPES.
- Kombiner RPMI isoleringsmedier i en stor konisk kolbe, blandes med magnetomrører, justeres til pH 7,4 med NaOH, filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
- RPMI Kultur Medier
- Brug RPMI dyrkningsmedier, med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika (dvs., penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 ug / ml).
- Blanding af enzymer
- Islet Isolation og dyrkning
- Animal Sacrifice
- Sacrifice mus ved cervical dislokation eller CO 2 kvælning i henhold til den lokale institutionens etik procedurer. Spray musen kroppen grundigt med 70% ethanol.
- Pancreas Perfusion
- USE 2 lange snit sideværts gennem den abdominale hud og bughinden at lave en V-formet klap. Træk flappen af huden op for at afdække hele bughulen, lægge tarmen og holde leveren på plads af en foldet tissuepapir at afsløre den fælles galdegang (figur 1 og 2). Aflive dyret så hovedet mod kirurgen og halen væk fra kirurgen.
- Anvende en vaskulær klemme på ampulla på tolvfingertarmen væg for at blokere de injicerede enzymer komme ind i duodenum (figur 1).
BEMÆRK: Dette er et vigtigt skridt, da det bestemmer, om de injicerede enzymer vil gå ind pankreasgangen og perfundere bugspytkirtel eller tilbagesvaling til injektionsstedet (over klemme) eller gå ind i duodenum (under klemme). - Kanyle den fælles galdegang med en 31 G nål nær krydset af den fælles hepatisk kanalen og cystisk kanalen (figur 1), og give plads til en anden injektion, hvis the bugspytkirtlen ikke perfundere første gang. Langsomt (over ~ 10 sek) injiceres ca. 2 ml kold enzymblanding i musen fælles galdegang.
BEMÆRK: bugspytkirtlen bliver perfunderet hurtigt, hvis klemmen er i den rigtige position. - Juster klemme position, hvis nålen er inde den fælles galdegang, men kan ikke perfundere bugspytkirtlen (dvs.., Bevæge sig op klemmen lidt væk fra leveren hvis over fastspændt eller flytte det ned lidt til leveren, hvis under fastspændt).
BEMÆRK: Nålen undertiden går ind i det omgivende kapsel snarere end lumen af kanalen. En nyttig tegn til at kontrollere, om nålen er inde i fælles galdegang er dilatation af kanalen under injektionen. Hvis bugspytkirtlen ikke perfundere, et alternativ er den enzymblanding kunne injiceres til flere steder i bugspytkirtlen med lavere udbytte forventet. Perfusionen af venstre side i bugspytkirtlen (milt lap) er vigtig for maksimering af ø-udbytte. - Efter bugspytkirtlen er perfused, hurtigt fjerne bugspytkirtlen, sætte det ind i et hætteglas (~ 20 ml, glas) og inkuberes i ~ 19 min i et 37 ° C vandbad.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere en smule afhængigt af muse-stamme og alder. - Efter inkubationstiden, stoppe fordøjelsesprocessen ved tilsætning ~ 20 ml koldt isoleringsmedier. Ryst hætteglasset forsigtigt for at forstyrre bugspytkirtlen og hæld den gennem en normal te si (porediameter på 1 mm) i en steril 50 ml rør. Fyld røret med isolation medier og centrifugeres ved 400 xg i 1 min ved 4 ° C med bremse fra.
- Igen pellet opløses i isoleringsmedier og overførsel til to 15 ml rør, centrifugeres ved 400 x g i 1 min ved 4 ° C med bremse fra. Efter aspiration af supernatanten, blande de to pellets godt med 6 ml densitetsgradient celleseparation medier (Histopaque 1077 opløsning) pr rør ved hvirvelblanding eller pipettering op og ned. Derefter forsigtigt tilsættes ~ 6 ml af isoleringsmedier til siden af røret på toppen afdensitetsgradienten adskillelse medier og centrifugeres ved 100 xg i 15 minutter ved 4 ° C med bremsen.
- Opsaml supernatanten i den øverste (isoleringsmedier), midterste og nedre (densitetsgradient celleseparation medier) lag i 3 separate skåle. Håndplukke øerne i disse 3 retter, med en pipette under et dissektionsmikroskop.
BEMÆRK: Det midterste lag indeholder de fleste af øerne. Øer anerkendes som kompakte strukturer af ~ 50 til 500 um i størrelse (figur 3). Vi får ~ 200 holme i WT mus og 300- <100 holme i db / db-mus.
- Holm Dyrkning
- At hjælpe øerne inddrive fra enzymet fordøjelse, kulturgrupper på 40 øer i en 25 cm petriskål med 6 ml RPMI dyrkningsmedier (10 mM glucose) ved 37 ° C, 5% / 95% CO2 / O 2 i 2 dage før den direkte -celle 2-foton-billeddannelse. Ændre dyrkningsmedierne dagligt.
- Animal Sacrifice
2. Levende Cell 2-Photon Imaging
- Reagensforberedelse
- Ekstracellulær Buffer
- Forbered natrium rige ekstracellulære buffer for 2-foton assay med 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3 og 10 mM HEPES.
- Ekstracellulær Dye
- For 2-foton assay forberede stock SRB 8 mM i ekstracellulær puffer, alikvot i små rør og opbevares ved -20 ° C. Fortynd bestanden SRB 1:10 i frisk ekstracellulære buffer til at få en arbejdsgruppe koncentration på 0,8 mM.
- Ekstracellulær Buffer
- foton Imaging
- Første, præ-inkuber 2 dages dyrkede øer i 3 mM glucose ekstracellulære buffer i 30 min.
BEMÆRK: Vi bruger holme mellem 2 og 5 dage i kultur. - Derefter placere et objektglas på termo-styrekammeret monteret på objektbordet. Bruge fedt for at forhindre lækage af opløsningen.
- Dæk kammeret med 500 pi extracellular buffer indeholdende 0,8 mM SRB med forskellige glukosekoncentrationer (3 mM, 6 mm, 15 mm og 20 mM glucose).
- Herefter sættes præinkuberet holm ind i midten af kammeret og fokus på 3-4 cellelag ind i holm, hvor der i gnavere øer, immunfarvning for insulin viser, at de fleste celler er beta-celler.
BEMÆRK: SRB vil skitsere alle cellemembranen af ø-celle hurtigt og holmen er klar til billede. - Brug en 2-foton mikroskop med en 60X olie nedsænkning mål (NA 1,42) og billedbehandlingssoftware (f.eks., ScanImage 11). Figur 4 viser et typisk mikroskopi arrangement. Billede exocytiske begivenheder ved hjælp SRB som en membran impermeabel fluorescerende ekstracellulære markør ophidset af femtosekund laser pulser på 880 nm, med fluorescens detekteret ved 550-650 nm. Optage ø-reaktioner på stimulering.
- Identificer enkelt exocytiske begivenheder ved den pludselige tilsynekomst af en lille fluorescerende plet (opløsning 10 pixels /1 m) og bekræft med den hurtige stigende fase af det fluorescerende signal over et område af interesse (~ 0,78 um 2).
- Første, præ-inkuber 2 dages dyrkede øer i 3 mM glucose ekstracellulære buffer i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ø-udbytte og oprensning
For en normal vildtype mus, er omkring 200 øer forventet. Sunde holme ser lyse, rund og har en glat kant. En over-fordøjet isolation batch sædvanligvis har små og fuzzy øer, mens en under-spaltet parti har færre øer og acinære celler knyttet øer (figur 3). For diabetiske db / db-mus, ø-udbytte og udseende afhænger af sygdomsprogression med bedre glykæmisk mus har større, lysere og mere øer (op til 300 øer) sammenlignet med dårligere glykæmisk mus, som har mindre øer med et gennemskinneligt udseende (under 100 holme)
2-foton-assay
2-foton-billeddannelse er en indirekte assay at måle insulinsekretion på niveauet for enkelt insulin granula fusion. Som svar på stimuli, såsom glucose eller høj kalium, insulin granulat fusionerer med plasmamembranen og den ekstracellulære farvestof SRB træder the granuler, hvilket resulterer i fremkomsten af en pludselig fluorescerende plet ~ 400 nm i diameter (figur 5). Forskellige forsøg er blevet udført for at validere dette assay som en måling af fusion af insulin-holdige granuler ligesom glukose dosisafhængig af stigende antal granulat fusionsbegivenheder med den forventede mængde af insulinsekretion, konsekvent størrelse svarede celler i 2 foton med den for en beta-celle, den tilsvarende granulat diameter målt ved 2 foton og elektronmikroskop, at co-lokalisering af farvestoffet optagelse og insulin farvning 8.
Inden for den tid for optagelsen, er alle exocytiske begivenheder i reaktion på stimulus identificeres og placeringen af de begivenheder, tidspunktet for udseende, varigheden og typen af de fusion begivenheder som kiss-and-run eller fuld fusion karakteriseret ( Figur 5, 6). Er værdifulde for vurderingen af disse karakteristika fusionsprocessen enhver defekt i granulatet fusion i modeller for type 2-diabetes. Vores tidligere rapport ved hjælp af denne metode viser, at defekten i diabetiske db / db-øer er tabet af fuld granulat fusion og ikke en ændring i egenskaberne af kinetikken af individuelle granula fusion 7. Endvidere viser vi, at den største faktor i faldet i insulinsekretion i sygdom er en reduktion i antallet af reagerende celler 7.
Figur 1:. Et diagram over de steder, hvor fastspænding og injektion Injicer enzymerne til den fælles galdegang nær krydset af den fælles hepatisk kanalen og cystisk kanalen. Klemme ampulla Valter af en vaskulær klemme for at lette den injicerede enzym til pancreas-kanalen.
2632fig2.jpg "/>
Figur 2: injektionsprocessen i musene. Top figur viser nålen inde i fælles galdegang med en vaskulær klemme påført ved ampulla Valter. Nederste figur viser Liberase-perfunderede pancreas efter injektion.
Figur 3: Typiske billeder af vildtype og db / db isolerede øer (A) Vildtype isolerede øer.. (B) db / db isoleret øer. (C) Under-fordøjet holme med vedhæftede acinære celler (pile). (D) Over-fordøjet øer med små og fuzzy småøer (pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. De vigtigste komponenter i skræddersyet 2 foton mikroskop Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempel på en enkelt insulin granulat fusion begivenhed som er optaget med 2 foton mikroskopi Venstre tal repræsenterer cellen før (A) og efter (B) fremkomsten af en exocytisk begivenhed (pil) som svar på 15 mM glucose stimulation.. (C) illustrerer SRB mærkning med indtastning af det ekstracellulære farvestof SRB i granulatet, når den smelter sammen med plasmamembranen. (D) viser fluorescensintensiteten over et område af interesse af en eksocytisk begivenhed samt Sequential billeder af denne exocytisk begivenhed (skala bar 1 um). Billede modificeret fra Do m.fl. 2014 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Responser af vildtype og diabetiske db / db-øer under 2-foton mikroskop med SRB det ekstracellulære farvestof I disse forsøg insulin granula fusionsbegivenheder som respons på 15 mM glucose stimulation registreres. Gule cirkler er steder i exocytiske begivenheder i 20 minutter af optagelsen. Billede modificeret fra Do m.fl. 2014 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske faktor i islet isolation er den oprindelige perfusion af pancreas; en under perfunderet bugspytkirtel resulterer i et betydeligt lavere ø-udbytte. Andre faktorer påvirker også isolation kvalitet, såsom fordøjelse tid og niveauet for omrystning som dels kunne kompensere for niveauet af perfusion. For eksempel vil en fuldt perfunderet pancreas skal inkuberes ved 37 ° C i ~ 18 min 30 sek mens forsigtig omrystning i modsætning en under fordøjet bugspytkirtlen kan kræve ~ 20 min fordøjelse med hårdere omrystning. Blandingen af to fordøjelsesenzymer i vores hænder giver bedre islet isolation end ene alene. For collagenase eneste metode, fordøjelsen tid kritisk påvirker holmen udbytte og tidsforskelle på kun 30 sek kan dramatisk påvirke kvaliteten. For Liberase kun er udbyttet acceptabelt, men under-fordøjelse sker sommetider, mener vi, at tilsætningen af collagenase hjælper med at fordøje bindevævet bedre.
Der er en række mulige eksperimenter, der kan udføres, efter at øerne er blevet isoleret. Isolerede øer kan fastgøres i paraformaldehyd eller methanol straks efter isolering og anvendes i immunfluorescensfarvning at bestemme placeringen af proteiner af interesse 10. Isolerede øer kan dispergeres i til enkeltceller. Dette kan gøres på samme dag af ø-isolation eller efter et par dage af ø-kultur. De enkelte celler udplades derefter ud, og det er dette præparat, der har været grundpillen for teknikker såsom patch clamp og total indre refleksion mikroskopi. I eksperimenter, der målerinsulinsekretion, samt for live-cell 2-foton-billeddannelse, har vi fundet, at øer kræver 2 dage i kultur for at give reproducerbare data. Hvad sker der i kulturen er ikke godt forstået, men menes at være en periode med opsving fra isolation og fordøjelsesprocessen.
Det 2-foton teknik præsenteres her giver forskerne at billedet insulin sekretoriske processen på niveau med enkelte granulat fusion fra mange celler inden intakte holme. Vi har fundet, at antallet af granulat fusion begivenheder og deres timing er i overensstemmelse med de beløb og tidsmæssig profil insulinsekretion 8. Dette tyder fremgangsmåden registrerer størstedelen af insulin granula-fusionsbegivenheder. Da farvestof indrejse i fikseringsenheden granulat er ikke en specifik metode til påvisning af insulin granula fusion begivenheder, vi er gået meget langt for at gennemføre kontrol eksperimenter for at demonstrere, at insulin granula fusion i betaceller bliver undersøgt 7,8
Der er en række tekniske problemer med 2-foton mikroskop, der indgår i alle billeddiagnostiske metoder. For eksempel, vi nøje afveje de modsatrettede faktorer for at forsøge at få nok lys ind til øerne, så vi kan reducere gevinsten af detektorerne, og derfor reducere støj, med at sætte så meget lys ind på øerne, som vi forårsager celleskader. I vores system er en Pockets celle, der anvendes til at dæmpe den pulserede laser (figur 3); alle kommercielle systemer har mekanismer til at ændre intensiteten af lys, der falder på til modellen.
Sammenfattende kombinationen af omhyggelig isolering af db / db holme og hel-ø 2 foton mikroskopi nuværende nye muligheder for at studere de processer af insulinsekretion og bestemme de centrale defekte elementer i type 2-diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
