Abstract
Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 1 steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt 2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.
Introduction
Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, 3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren.
Inselisolierung
Live menschlichen Inselchen und insbesondere menschlichen Inselzellen vom Typ 2-Diabetes-Patienten sind schwer zu bekommen. Darüber hinaus haben die menschliche Inselzellen begrenzte Möglichkeiten für experimentelle molekulare Manipulation. Forscher haben daher eingesetztekönnen aus Tieren und Tiermodellen des Typ 2 Diabetes. Ein solcher Krankheitsmodell ist der db / db-Maus. Dies ist eine spontane Mutation, die Models Typ-2-Diabetes mit einem Phänotyp Progression, die menschliche Krankheit 5,6 eng Parallelen. Die für die Inselisolierung aus diabetischen db / db Mäusen hier vorgestellten Protokoll hat viele Schritte gemeinsam mit anderen Gruppen mit einigen Verfeinerungen für bessere Ausbeute, Reinigung und verbesserte Insellebens.
2 Photonen-Imaging
Die Live-cell 2-Photonen-Assay hier beschriebenen ermöglicht es Forschern, um die Anzahl zu quantifizieren und zu bewerten die Merkmale der einzelnen insulinhaltigen Granulat aus vielen Zellen der diabetischen 7 und Wildtyp-Inselchen 8,9.
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Protocol
HINWEIS: Alle vorliegenden Experimenten wurden nach den örtlichen Tierethik Verfahren der University of Queensland (von der University of Queensland, Anatomisches Biosciences Ethikkommission genehmigt) durchgeführt.
1. Islet Isolation
- Vorbereitung der Reagenzien
- Enzymgemisch,
- Für die Pankreasverdauung, eine Mischung aus Liberase und Collagenase Typ IV. Verdünnen Liberase TL (Thermo niedrig) 1 Fläschchen 5 mg mit 26 ml DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium).
- Vorbereitung Collagenase Typ IV in Hanks-Puffer bei einer Konzentration von 0,5 mg / ml, mit 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml DNAse und 1 mg / ml Rinderserumalbumin.
- Mischen den Liberase TL und Collagenase-Lösungen in einem Verhältnis von 4: 1 (nach Volumen), das heißt, 4 ml Liberase TL + 1 ml Kollagenase. Aliquot der Mischung von Enzymen zu jedem und bei -20 ° C 2,5 ml.
HINWEIS: Die Gewebe Inkubationszeiten vary ein wenig zwischen den Chargen des Enzyms (30 sec bis 1 min-Differenz). Daher kann ein Batch-Test erforderlich.
- RPMI Isolation Medien
- Lösen Sie eine Phiole mit RPMI 1640-Pulver in 1 l Wasser bei Raumtemperatur und zu ergänzen, mit 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES.
- Kombinieren Sie die RPMI Isolationsmedien in einer großen Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührer mischen, auf pH 7,4 mit NaOH, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
- RPMI Kulturmedien
- Verwenden RPMI Kulturmedium, mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika (dh, Penicillin 100 U / ml, Streptomycin 100 ug / ml).
- Enzymgemisch,
- Islet Isolation und Kultivierung
- Tieropfer
- Opfern Mäuse durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken nach Ethik Verfahren der lokalen Institution. Sprühen Sie die Maus Körper gründlich mit 70% Ethanol.
- Pancreatic Perfusion
- Use 2 lange Schnitte seitlich durch die Bauchhaut und Bauchfell, um eine V-förmige Klappe zu machen. Ziehen Sie die Klappe der Haut bis zu den gesamten Bauchraum aufzudecken, beiseite den Darm und die Leber zu halten anstelle von einem gefalteten Seidenpapier, um den Gallengang zu offenbaren (Abbildungen 1 und 2). Setzen Sie das Tier, so dass der Kopf in Richtung der Chirurg und der Schwanz vom Chirurgen.
- Anwenden einer Gefäßklemme an der Ampulle an der Wand, um den Zwölffingerdarm injiziert, Enzyme aus der Eingabe in das Duodenum (Figur 1) zu blockieren.
Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, da sie bestimmt, ob die injizierten Enzyme werden in den Pankreasgang gehen und durchströmen die Bauchspeicheldrüse oder Rücklauf auf die Injektionsstelle (über Klemme) oder gehen Sie in den Zwölffingerdarm (unter Klemme). - Kanülieren den Gallengang mit einer 31 G-Nadel in der Nähe der Kreuzung der Ductus hepaticus und cysticus (Abbildung 1) und lassen Raum für eine zweite Injektion, wenn the Pankreas versagt, das erste Mal durchströmen. Langsam (~ 10 sec) zu injizieren etwa 2 ml kaltem Enzymgemisch in die Maus Gallengang.
ANMERKUNG: Das Pankreas wird schnell perfundiert, wenn sich die Klammer in der richtigen Position ist. - Stellen Sie die Klemmposition, wenn die Nadel in den Gallengang, sondern kann die Bauchspeicheldrüse nicht Perfusion (dh., Nach oben die Klammer ein wenig weg von der Leber, wenn überspannt oder verschieben Sie sie ein wenig nach unten in die Leber, wenn im Rahmen eingespannt).
HINWEIS: Die Nadel geht manchmal in die umgebende Kapsel eher als das Lumen der Leitung. Eine sinnvolle Zeichen zu überprüfen, ob die Nadel innerhalb der Gallengang ist die Erweiterung des Kanals bei der Injektion. Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht zu durchströmen, ist eine Alternative die Enzymmischung konnte auf mehrere Standorte der Bauchspeicheldrüse mit geringeren Ausbeute erwartet injiziert werden. Die Perfusion der linken Seite der Bauchspeicheldrüse (Lobus Splenicus) ist wichtig für die Maximierung der Inselausbeute. - Nachdem der Bauchspeicheldrüse ist perfused, schnell die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, legen Sie sie in einem Fläschchen (~ 20 ml Glas) und Inkubation für ~ 19 min in einem 37 ° C Wasserbad.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann ein wenig abhängig von der Mausstamm und Alter variieren. - Nach der Inkubationszeit, stoppen die Verdauung durch Zugabe von ~ 20 ml kaltem Isolationsmedien. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu stören und gießen Sie sie durch eine normale Teesieb (Porendurchmesser von 1 mm) in ein steriles 50 ml Tube. Füllen Sie das Rohr mit Isolierung Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab.
- Lösen Sie das Pellet in der Isolierung Medium erneut und übertragen, um zwei 15-ml-Röhrchen, dann bei 400 xg zentrifugieren für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. Nach dem Absaugen der Überstand, mischen Sie die beiden Pellets auch mit 6 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium (Histopaque 1077 Lösung) pro Röhrchen durch Vortexen oder Auf-und Abpipettieren. Dann vorsichtig hinzu ~ 6 ml der Isolierungsmedien zur Seite des Rohres überDer Dichtegradient Trennmedien und zentrifugiert bei 100 g für 15 min bei 4 ° C mit Bremse ausgeschaltet.
- Sammeln Sie den Überstand in der oberen (Isolationsmedien), mittleren und unteren (Dichtegradienten Zelltrennmedien) Schicht in 3 separate Küche. Interpreten Sie die Inseln in diesen 3 Gerichte, mit einer Pipette unter einem Binokular.
HINWEIS: Die mittlere Schicht die meisten der Inseln enthält. Inseln werden als kompakte Strukturen von ~ 50 bis 500 um in der Größe (Figur 3) erkannt wird. Wir erhalten ~ 200 Inseln in WT-Mäusen und 300- <100 Inseln in db / db-Mäusen.
- Islet Kultivierung
- Um die Inseln zu gewinnen aus dem Enzymverdau Kulturgruppen von 40 Inseln in einer 25 cm Petrischale mit 6 ml RPMI-Kulturmedium (10 mM Glukose) bei 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 für 2 Tage vor der Live -Zelle 2-Photonen-Bildgebung. Ändern Sie den Kulturmedien täglich.
- Tieropfer
2. Live Cell 2-Photonen-Imaging
- Vorbereitung der Reagenzien
- Extrazelluläre Puffer
- Vorbereitung der extrazellulären Natriumpuffer für die 2-Photonen-Assay mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 und 10 mM HEPES.
- Extrazelluläre Dye
- Für die 2-Photonen-Test vorbereiten stock SRB 8 mM in extrazellulären Puffer, aliquoten in kleine Rohre und bei -20 ° C. Von der Stamm SRB 1:10 in frischem extrazellulären Puffer auf eine Arbeitskonzentration von 0,8 mm zu erhalten.
- Extrazelluläre Puffer
- Photonen-Imaging
- Erste, vorge inkubieren 2 Tage kultivierte Inseln in 3 mM Glucose extrazelluläre Puffer für 30 min.
HINWEIS: Wir verwenden Inselchen zwischen 2 und 5 Tagen in Kultur. - Dann legen Sie eine Objektträger auf die auf dem Mikroskoptisch montiert thermo-Steuerkammer. Verwenden Sie Fett auf das Austreten von Lösung zu verhindern.
- Decken Sie die Kammer mit 500 ul extradere Puffer, enthaltend 0,8 mM SRB mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (3 mm, 6 mm, 15 mm und 20 mM Glucose).
- Als nächstes legen Sie die vorinkubierten kleine Insel in der Mitte der Kammer und konzentrieren sich auf 3-4 Zellschichten in der kleinen Insel, wo, in Nagetier Inselchen, Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen sind beta-Zellen.
HINWEIS: Die SRB alle die Zellmembran der Insel schnell zu skizzieren und die kleine Insel ist bereit, image. - Verwenden Sie eine 2-Photonen-Mikroskop mit einem 60x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,42) und Imaging-Software (z. B. scanimage 11). Abbildung 4 zeigt eine typische Anordnung Mikroskopie. Bild Exozytose-Ereignisse mit SRB als Membran impermeante Fluoreszenzextrazellulären Marker durch Femtosekundenlaserpulsen bei 880 nm angeregt, mit Fluoreszenz bei 550-650 nm detektiert. Notieren Sie die Antworten auf die Insel Stimulation.
- Identifizieren Sie einzelne Exozytose-Ereignisse durch das plötzliche Erscheinen eines kleinen fluoreszierenden Flecks (Auflösung 10 Pixel /1, m) und bestätigen Sie mit der schnell ansteigenden Phase des Fluoreszenzsignals über einen Bereich von Interesse (~ 0,78 um 2).
- Erste, vorge inkubieren 2 Tage kultivierte Inseln in 3 mM Glucose extrazelluläre Puffer für 30 min.
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Representative Results
Islet Ausbeute und Reinigung
Für eine normale Wildtyp-Maus, werden etwa 200 kleine Inseln erwartet. Gesunde Inseln aussehen hell, rund geformt und haben einen glatten Rand. Eine Über verdaut Isolierung Charge hat in der Regel klein und Fuzzy-Inseln, während ein Unter verdaut Charge hat weniger kleine Inseln und Inselchen Azinuszelltumoren angebracht (Abbildung 3). Für diabetischen db / db-Mäuse, die kleine Insel Ausbeute und Aussehen abhängig von der Krankheitsprogression mit besseren glykämischen Mäuse größer, heller und Inselchen (bis zu 300 kleinen Inseln) im Vergleich zu Mäusen, die schlechter glykämischer kleineren Inselchen mit einem durchscheinendes Aussehen haben (unter 100 Inseln)
2-Photonen-Assay
2-Photonen-Bildgebung ist ein indirekter Assay auf Insulinsekretion auf der Ebene der einzelnen Insulingranulatschmelz messen. Als Reaktion auf Reize wie Glucose oder hohe Kalium verschmelzen Insulingranula mit der Plasmamembran und die extrazelluläre Farbstoff SRB eintritt the Granulate, die in dem Auftreten eines plötzlichen fluoreszierenden Flecks ~ 400 nm im Durchmesser ergibt (Figur 5). Verschiedene Experimente wurden durchgeführt, um dieses Assay als Messung der Fusion von insulinhaltigen Granulaten wie Glucose dosisabhängige Erhöhung der Anzahl der Körnerfusionsereignisse mit der erwarteten Menge an Insulin-Sekretion, die einheitliche Größe der reagierten Zellen in der 2 validieren Photonen mit der eines beta Zelle die ähnliche Korndurchmesser vom 2 Photon und des Elektronenmikroskops gemessen, wobei die Co-Lokalisation der Farbstoffaufnahme und Insulin Anfärben 8.
Im Zeitpunkt der Aufzeichnung alle Exozytose-Ereignisse in Reaktion auf den Stimulus identifiziert und der Stelle der Ereignisse, die Zeit des Auftretens, der Dauer und Art der Fusionsereignisse wie kiss-and-run oder vollständige Fusion charakterisiert ( Figur 5, 6). Diese Eigenschaften des Schmelzprozesses sind wertvoll für die Beurteilung jeder Defekt im Granulat Fusion in Modellen von Typ 2 Diabetes. Unserem letzten Bericht mit dieser Methode zeigt, dass der Mangel bei diabetischen db / db-Inseln ist der Verlust der Voll Granulat Fusion und keine Änderung der Eigenschaften der Kinetik der einzelnen Granulat Fusion 7. Darüber hinaus zeigen wir, dass der größte Faktor für die Insulinsekretion verkleinert Krankheit ist eine Verringerung der Anzahl der ansprechenden Zellen 7.
Abb. 1: Ein Diagramm der Sites von Schließ- und Spritz Injizieren Sie den Enzymen, die dem gemeinsamen Gallengang in der Nähe der Kreuzung der Ductus hepaticus und cysticus. Klemmen Sie die Ampulle von Valter durch eine Gefäßklemme, um die injizierten Enzyms zu dem Pankreasgang zu erleichtern.
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Figur 2: Der Einspritzvorgang in den Mäusen. Top Abbildung zeigt die Nadel in den Hauptgallengang mit einer Gefäßklemme an der Ampulle von Valter angewendet. Bottom Abbildung zeigt die Liberase durchbluteten Bauchspeicheldrüse nach der Injektion.
Abbildung 3: Typische Bilder von Wildtyp und db / db isolierten Inseln (A) Wildtyp-isolierten Inseln.. (B) db / db isoliert Inselchen. (C) Unter-verdaute Inselchen mit angeschlossenem Azinuszellen (Pfeile). (D) Über verdaut Inseln mit kleinen und Fuzzy-Inseln (Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 4: Die Hauptkomponenten des maßgeschneiderten 2 Photonen-Mikroskop Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Beispiel eines einzelnen Insulin Granulat Fusion Veranstaltung mit 2 Photonen-Mikroskopie aufgenommen linke Abbildung stellt die Zelle vor (A) und nach (B) das Aussehen einer Exozytose-Ereignis (Pfeil) in Reaktion auf 15 mM Glucose-Stimulation.. (C) zeigt den SRB-Markierung mit der Eingabe der extrazellulären Farbstoff SRB in das Granulat, wenn es mit der Plasmamembran verschmilzt. (D) zeigt die Fluoreszenzintensität über einen interessierenden Bereich eines Exozytose-Veranstaltung sowie die sequential Bild für diese Veranstaltung Exozytose (Maßstab 1 & mgr; m). Bild von Do et al 2014 7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig. 6: Antworten des Wildtyps und der diabetischen db / db-Inseln unter der 2-Photonen-Mikroskop mit SRB als extrazellulärem Farbstoff in diesen Experimenten Insulin Granulatfusionsereignisse als Antwort auf 15 mM Glukosestimulation aufgezeichnet. Gelbe Kreise sind Stätten der Exozytose-Veranstaltungen während 20 Minuten der Aufzeichnung. Bild von Do et al 2014 7 modifiziert.
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Discussion
Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im Gegensatz eine Unter verdaut Bauchspeicheldrüse kann mit härteren Schütteln erfordern ~ 20 min Verdauung. Die Mischung aus zwei Verdauungsenzyme in unseren Händen eine bessere Inselisolierung als entweder eine allein. Für die Kollagenase einzige Methode, die Verdauungszeit kritisch wirkt sich auf die kleine Insel Ausbeute und Zeitunterschiede von nur 30 Sekunden kann einen dramatischen Einfluss auf die Qualität. Für Liberase nur ist die Ausbeute akzeptabel, aber unter Verdauung passiert manchmal, glauben wir, dass die Zugabe von Kollagenase hilft, das Bindegewebe besser verdauen.
Es gibt eine Reihe von möglichen Versuche, die ausgeführt werden können, nachdem die Inseln wurden isoliert werden. Isolierten Inseln können Paraformaldehyd oder Methanol unmittelbar nach der Isolierung befestigt ist und in der Immunfluoreszenz-Färbung verwendet werden, um die Position der Proteine von Interesse 10 zu bestimmen. Isolierten Inseln können in einzelne Zellen dispergiert werden. Dies kann am gleichen Tag der Inselisolierung oder nach einigen Tagen von Inselkultur erfolgen. Die einzelnen Zellen werden dann ausplattiert und es ist diese Vorbereitung, die die Hauptstütze für Techniken wie Patch-Clamp und Totalreflexion Mikroskopie. In Experimenten, die zu messenInsulinsekretion sowie lebender Zellen 2-Photonen-Bildgebung, wurde gefunden, daß Inseln erforderlich 2 Tage in Kultur, um reproduzierbare Daten erhalten wurde. Was ist in der Kultur geschieht, ist nicht gut verstanden, aber wird gedacht, um eine Zeit der Erholung von der Isolierung und Verdauung sein.
Die 2-Photonen-Technik hier vorgestellten ermöglicht es Forschern, die Bild insulinsekretorischen Prozess auf der Ebene der einzelnen Granulat Fusion aus vielen Zellen im intakten Inseln. Wir haben festgestellt, dass die Anzahl der Körnerfusionsereignisse und ihre Zeitsteuerung in Übereinstimmung mit den Beträgen und zeitlicher Verlauf der Insulinsekretion 8. Dies legt nahe, das Verfahren Detektieren der Mehrzahl von Insulin Granulatfusionsereignisse. Da die Farbstoff Eintrag in den Schmelzgranulat ist kein spezifisches Verfahren zum Nachweis von Insulin Granulat Fusionsereignisse haben wir große Anstrengungen unternommen, um Kontrollversuche durchzuführen, um, dass Insulin Granulat Fusion in Beta-Zellen zeigen, werden untersucht 7,8
Es gibt eine Reihe von technischen Problemen bei der 2-Photonen-Mikroskop, das generisch auf alle bildgebe Ansätze sind. Zum Beispiel haben wir sorgfältig das Gleichgewicht der entgegengesetzten Faktoren zu versuchen, genug Licht, um die Inseln zu bekommen, so dass wir die Verstärkung der Detektoren zu verringern, und somit Rauschen zu reduzieren, mit Putting so viel Licht in den kleinen Inseln, die wir verursachen Zellschäden. In unserem System ist eine Pockels-Zelle verwendet, um den gepulsten Laser (3) zu dämpfen; alle kommerziellen Systeme haben Mechanismen, um die Intensität des Lichts, das auf die Probe fällt zu verändern.
Zusammenfassend ist die Kombination von sorgfältigen Isolierung von db / db Inseln und ganze Insel 2-Photonen-Mikroskopie neue Chancen, um die Prozesse der Insulinsekretion zu untersuchen und festzustellen, die wichtigsten defekten Elemente in Typ 2 Diabetes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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