Abstract
टाइप 2 मधुमेह 2013 में 382 मिलियन लोगों को प्रभावित करने के लिए एक भयंकर रोग है, और पिछले 2 दशकों के दौरान। 2035 द्वारा 1 592,000,000 करने के लिए स्पष्ट रूप से 2 स्थापित किया गया है टाइप 2 मधुमेह में बीटा सेल में शिथिलता की भूमिका बढ़ने की उम्मीद है। अनुसंधान प्रगति अग्नाशय islets के अलगाव के लिए तरीकों की आवश्यकता है। आइलेट अलगाव के प्रोटोकॉल जंगली प्रकार और मधुमेह Lepr डीबी (डीबी / DB) चूहों दोनों से अलग islets की उपज और गुणवत्ता में सुधार करने के लिए कुछ संशोधनों के साथ, शेयरों यहां अन्य समूहों से प्रोटोकॉल के साथ कई आम चरणों प्रस्तुत किया। एक जीवित कोशिका 2 फोटॉन इमेजिंग विधि तो टापू भीतर इंसुलिन के स्राव का नियंत्रण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्तुत किया है।
Introduction
रोग में बीटा सेल में शिथिलता की भूमिका को व्यापक रूप से 3,4 में पहचाना गया है। ऐसे MIN6 और आईएनएस-1 के रूप में सेल लाइनों बीटा सेल व्यवहार के जीव विज्ञान को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, इंसुलिन का स्राव के शारीरिक नियंत्रण Langerhans के टापू के भीतर जगह लेता है। ये टापू कसकर बांध बीटा कोशिकाओं के हजारों है, साथ ही रक्त वाहिकाओं और अन्य अंत: स्रावी सेल प्रकार के होते हैं। आइलेट के भीतर इस माहौल इंसुलिन के स्राव को प्रभावित करती है और मधुमेह में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। इसलिए, इंसुलिन का स्राव के शारीरिक नियंत्रण, और रोग के pathophysiology को समझने के लिए, इसे बरकरार टापू अध्ययन करने के लिए आवश्यक है।
आइलेट अलगाव
टाइप 2 मधुमेह के रोगियों से विशेष रूप से, मानव टापू में लाइव मानव islets और प्राप्त करने के लिए कठिन हैं। इसके अलावा, मानव टापू प्रयोगात्मक आणविक हेरफेर के लिए सीमित संभावनाएं हैं। शोधकर्ताओं इसलिए है कार्यरत हैजानवरों और टाइप 2 मधुमेह के पशु मॉडल से की सुविधा देता है। ऐसा ही एक रोग मॉडल DB / DB चूहा है। इस मॉडल को बारीकी से मानव रोग 5,6 समानताएं कि एक phenotype प्रगति के साथ टाइप 2 मधुमेह है कि एक सहज उत्परिवर्तन है। मधुमेह DB / DB चूहों से आइलेट अलगाव के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बेहतर उपज, शुद्धि और बढ़ाया आइलेट अस्तित्व के लिए कुछ शोधन के साथ अन्य समूहों के साथ आम में कई कदम है।
2 फोटॉन इमेजिंग
यहाँ वर्णित रहते सेल 2 फोटॉन परख संख्या यों और 7 और जंगली प्रकार मधुमेह 8,9 islets के कई कोशिकाओं से ही इंसुलिन युक्त कणिकाओं की विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है।
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Protocol
नोट: सभी उपस्थित प्रयोगों (क्वींसलैंड विश्वविद्यालय, शारीरिक बायोसाइंसेज आचार समिति द्वारा अनुमोदित) क्वींसलैंड विश्वविद्यालय के स्थानीय पशु आचार प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदर्शन किया गया।
1. आइलेट अलगाव
- अभिकर्मक तैयारी
- एंजाइमों का मिश्रण
- अग्नाशय के पाचन के लिए, liberase और collagenase प्रकार चतुर्थ का एक मिश्रण का उपयोग करें। (Thermolysin कम) liberase टीएल DMEM के 26 मिलीलीटर (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) के साथ 5 मिलीग्राम की 1 शीशी पतला।
- , 5 मिमी HEPES के साथ पूरक 0.5mg / एमएल की एकाग्रता, पर हांक बफर में collagenase प्रकार चतुर्थ तैयार करें 0.5mm 2 CaCl, 0.1mg / एमएल DNase और 1mg / एमएल गोजातीय सीरम albumin।
- , यानी, (मात्रा) के द्वारा 1 टीएल + 1 मिलीलीटर collagenase liberase 4 मिलीलीटर: 4 के अनुपात में liberase टीएल और collagenase समाधान मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक और दुकान 2.5ml एंजाइमों का मिश्रण विभाज्य।
नोट: ऊतक ऊष्मायन Times vएंजाइम के बैचों के बीच एक सा (30 सेकंड के लिए 1 मिनट के अंतर) एआरवाई। इसलिए, एक बैच परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है।
- RPMI अलगाव मीडिया
- आरटी पर पानी का 1 एल में 1640 RPMI पाउडर की एक शीशी भंग और 2 जी 3 NaHCO, 4.02 छ HEPES के साथ पूरक।
- , चुंबकीय दोषी के साथ मिश्रण, एक बड़े शंक्वाकार फ्लास्क में RPMI अलगाव मीडिया गठबंधन NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित, फिल्टर बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- RPMI संस्कृति मीडिया
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक दवाओं (यानी, पेनिसिलिन 100 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ, RPMI संस्कृति मीडिया का प्रयोग करें।
- एंजाइमों का मिश्रण
- आइलेट अलगाव और संवर्धन
- पशु बलि
- स्थानीय संस्था की नैतिकता प्रक्रियाओं के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 asphyxiation द्वारा चूहों बलिदान। 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से माउस शरीर स्प्रे।
- अग्नाशय के छिड़काव
- यूपार्श्विक पेट की त्वचा और पेरिटोनियम के माध्यम से एसई 2 लंबी कटौती एक वी के आकार फ्लैप बनाने के लिए। पूरे उदर गुहा को उजागर करने के लिए त्वचा की फ्लैप खींचो, आंत्र एक तरफ रख दिया और आम पित्त नली प्रकट करने के लिए एक जोड़ टिशू पेपर द्वारा जगह में जिगर रखने (आंकड़े 1 और 2)। पशु रखो सर्जन और दूर सर्जन से पूंछ की ओर सिर सकें।
- ग्रहणी (चित्रा 1) में प्रवेश करने से इंजेक्ट एंजाइमों को ब्लॉक करने के ग्रहणी दीवार पर कलसा में एक नाड़ी दबाना लागू करें।
नोट: इंजेक्ट एंजाइमों अग्नाशय वाहिनी में जाने के लिए और (दबाना से अधिक) इंजेक्शन साइट के लिए अग्न्याशय या भाटा छिड़कना या (दबाना) के तहत ग्रहणी में जाना होगा कि क्या यह निर्धारित करता है के रूप में यह एक महत्वपूर्ण कदम है। - आम यकृत वाहिनी और सिस्टिक वाहिनी (चित्रा 1) के जंक्शन के पास एक 31 जी सुई के साथ आम पित्त नली cannulate और एक दूसरे इंजेक्शन के लिए कमरे में छोड़ वें अगरई अग्न्याशय पहली बार छिड़कना विफल रहता है। धीरे धीरे (अधिक ~ 10 सेकंड) माउस आम पित्त नली में लगभग 2 एमएल ठंड एंजाइम मिश्रण के इंजेक्षन।
नोट: दबाना सही स्थिति में है अगर अग्न्याशय जल्दी perfused किया जाएगा। - सुई आम पित्त नली के अंदर है लेकिन अग्न्याशय छिड़कना नहीं कर सकते हैं (यदि अर्थात। Clamped पर अगर जिगर से थोड़ा दूर दबाना ऊपर ले जाएँ या clamped के तहत अगर जिगर को थोड़ा नीचे ले जाने के) दबाना स्थिति को समायोजित करें।
नोट: सुई कभी कभी आसपास के कैप्सूल के बजाय वाहिनी के लुमेन में चला जाता है। एक उपयोगी साइन आम पित्त नली इंजेक्शन लगाने जब वाहिनी के फैलाव है अंदर सुई है कि क्या जांच करने के लिए। अग्न्याशय छिड़कना करने में विफल रहता है, तो एक विकल्प के एंजाइम मिश्रण होने की उम्मीद कम उपज के साथ अग्न्याशय की कई साइटों को इंजेक्ट किया जा सकता है। अग्न्याशय (प्लीहा पालि) के बाईं साइट का छिड़काव आइलेट उपज के अधिकतमकरण के लिए महत्वपूर्ण है। - अग्न्याशय पी है के बादerfused, जल्दी से, अग्न्याशय को दूर एक शीशी (~ 20 मिलीलीटर, ग्लास) में डाल दिया और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ~ के लिए 19 मिनट सेते हैं।
नोट: ऊष्मायन समय माउस तनाव और उम्र के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। - ऊष्मायन समय के बाद, ~ ठंड अलगाव मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़कर पाचन प्रक्रिया को रोकने के। अग्न्याशय को बाधित और एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक सामान्य चाय चलनी (1 मिमी के ध्यान में लीन होना व्यास) के माध्यम से यह डाल करने के लिए धीरे शीशी हिलाएँ। ब्रेक के साथ बंद 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 XG पर अलगाव मीडिया और अपकेंद्रित्र के साथ ट्यूब ऊपर।
- फिर अलगाव मीडिया में गोली भंग और फिर ब्रेक के साथ बंद 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, दो 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण। आकांक्षा सतह पर तैरनेवाला के बाद, vortexing या ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ट्यूब प्रति घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया के 6 मिलीलीटर (Histopaque 1077 समाधान) के साथ अच्छी तरह से दो छर्रों मिश्रण। फिर धीरे से शीर्ष पर ट्यूब के पक्ष में अलगाव मीडिया की ~ 6 मिलीलीटर जोड़नेब्रेक के साथ बंद 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 100 XG पर घनत्व ढाल जुदाई मीडिया और अपकेंद्रित्र।
- ऊपरी (अलगाव मीडिया) में सतह पर तैरनेवाला 3 अलग बर्तन में, मध्य और निचले (घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया) परत लीजिए। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक विंदुक का उपयोग, इन 3 बर्तन में टापू चुनने।
नोट: मध्यम परत टापू का सबसे शामिल हैं। आइलेट्स आकार में ~ 50 माइक्रोन से 500 की कॉम्पैक्ट संरचनाओं (चित्रा 3) के रूप में पहचाने जाते हैं। हम WT चूहों में ~ 200 टापू और डीबी / DB चूहों में 300 <100 टापू प्राप्त करते हैं।
- आइलेट संवर्धन
- टापू 37 डिग्री सेल्सियस, 5% पर, एंजाइम पाचन से 6ml RPMI संस्कृति मीडिया (10mM ग्लूकोज) के साथ एक 25 सेमी पेट्री डिश में 40 टापू की संस्कृति समूहों उबरने में मदद करने के लिए / 95% लाइव से पहले 2 दिनों के लिए सीओ 2 / ओ 2 सेल 2 फोटॉन इमेजिंग। दैनिक संस्कृति मीडिया बदलें।
- पशु बलि
2। लाइव सेल 2 फोटॉन इमेजिंग
- अभिकर्मक तैयारी
- कोशिकी बफर
- 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी 3 NaHCO और 10 मिमी HEPES के साथ 2 फोटॉन परख के लिए सोडियम अमीर कोशिकी बफर तैयार करें।
- कोशिकी डाई
- 2 फोटॉन परख के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकी बफर, विभाज्य छोटे ट्यूबों में और दुकान में स्टॉक SRB 8 मिमी तैयार करते हैं। 0.8 मिमी की एक काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नए सिरे से कोशिकी बफर में शेयर SRB 01:10 पतला।
- कोशिकी बफर
- फोटॉन इमेजिंग
- सबसे पहले, 30 मिनट के लिए 3 मिमी ग्लूकोज कोशिकी बफर में 2 दिन सुसंस्कृत टापू पूर्व सेते हैं।
नोट: हम संस्कृति में 2 और 5 दिनों के बीच टापू का उपयोग करें। - फिर, खुर्दबीन मंच पर मुहिम शुरू की थर्मो-नियंत्रण कक्ष पर एक गिलास स्लाइड जगह है। समाधान की लीक को रोकने के लिए तेल का प्रयोग करें।
- Extracell के 500 μl के साथ चैम्बर कवरअलग ग्लूकोज सांद्रता (3 मिमी, 6 मिमी, 15 मिमी और 20 मिमी ग्लूकोज) के साथ 0.8 मिमी SRB युक्त ular बफर।
- अगला, चैंबर के मध्य में पूर्व incubated आइलेट जगह है और कृंतक टापू में, इंसुलिन के लिए immunostaining सबसे कोशिकाओं बीटा कोशिकाओं को पता चलता है कि जहां, आइलेट में 3-4 सेल परतों पर ध्यान केंद्रित।
नोट: SRB जल्दी आइलेट के सभी कोशिका झिल्ली की रूपरेखा तैयार करेंगे और आइलेट छवि के लिए तैयार है। - (उदाहरण के लिए।, ScanImage 11)। एक 60x तेल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.42) और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग 4 एक ठेठ माइक्रोस्कोपी व्यवस्था दिखाता है चित्रा। प्रतिदीप्ति के साथ एक झिल्ली 880 एनएम पर femtosecond लेजर दालों से उत्साहित impermeant फ्लोरोसेंट कोशिकी मार्कर के रूप में SRB का उपयोग कर छवि exocytic घटनाओं, 550-650 एनएम का पता चला। उत्तेजना के आइलेट प्रतिक्रियाओं का रिकॉर्ड।
- एक छोटे से फ्लोरोसेंट स्थान के अचानक उपस्थिति द्वारा एकल exocytic घटनाओं की पहचान (संकल्प 10 पिक्सल /1; मी) और ब्याज की एक क्षेत्र (~ 0.78 माइक्रोन 2) के ऊपर फ्लोरोसेंट संकेत के तेजी से विकास चरण द्वारा की पुष्टि करें।
- सबसे पहले, 30 मिनट के लिए 3 मिमी ग्लूकोज कोशिकी बफर में 2 दिन सुसंस्कृत टापू पूर्व सेते हैं।
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Representative Results
आइलेट उपज और शुद्धि
एक सामान्य जंगली प्रकार माउस के लिए, के बारे में 200 टापू उम्मीद कर रहे हैं। स्वस्थ टापू गोल आकार, उज्ज्वल लग रही है और एक चिकनी सीमा है। एक के तहत पच बैच कम टापू और कोष्ठकी सेल संलग्न टापू (चित्रा 3) है, जबकि एक से अधिक पच अलगाव बैच आम तौर पर छोटे और फजी टापू है। बेहतर ग्लाइसेमिक चूहों 100 के तहत (एक पारदर्शी उपस्थिति के साथ छोटे टापू है जो बदतर ग्लाइसेमिक चूहों की तुलना में (300 टापू के लिए) बड़ा, उज्जवल और अधिक टापू है के साथ मधुमेह DB / DB चूहों के लिए, आइलेट उपज और उपस्थिति रोग प्रगति पर निर्भर करता है टापू)
2 फोटॉन परख
2 फोटॉन इमेजिंग एकल इंसुलिन दाना संलयन के स्तर पर इंसुलिन का स्राव को मापने के लिए एक अप्रत्यक्ष परख है। ग्लूकोज या उच्च पोटेशियम जैसे उत्तेजनाओं के जवाब में, इंसुलिन कणिकाओं प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और बाह्य डाई SRB वीं में प्रवेश करती हैव्यास में अचानक फ्लोरोसेंट मौके ~ 400 एनएम की उपस्थिति में जो परिणाम ई कणिकाओं (चित्रा 5)। विभिन्न प्रयोगों इंसुलिन का स्राव की उम्मीद की राशि, 2 में प्रतिक्रिया व्यक्त की कोशिकाओं के अनुरूप आकार के साथ दाना संलयन की घटनाओं की संख्या में वृद्धि के आश्रित ग्लूकोज खुराक की तरह इंसुलिन युक्त कणिकाओं के विलय की एक माप के रूप में इस परख मान्य करने के लिए बाहर किया गया है एक बीटा सेल के साथ कि फोटान, 2 फोटॉन और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के द्वारा मापा इसी तरह दाना व्यास, डाई तेज और इंसुलिन की colocalization 8 धुंधला हो जाना।
रिकॉर्डिंग के समय के भीतर, पहचान कर रहे हैं उत्तेजना और चुंबन एंड रन या पूर्ण फ्यूजन की तरह संलयन घटनाओं की घटनाओं के स्थान, उपस्थिति के समय, अवधि और प्रकार के जवाब में सभी exocytic घटनाओं की विशेषता है ( चित्रा 5, 6)। संलयन की प्रक्रिया की इन विशेषताओं का आकलन करने के लिए मूल्यवान हैं टाइप 2 मधुमेह के मॉडल में दाना संलयन में कोई दोष। इस पद्धति का उपयोग हमारी पिछली रिपोर्ट मधुमेह DB / DB टापू में दोष पूर्ण दाना संलयन के नुकसान और न व्यक्ति छोटा दाना फ्यूजन 7 के कैनेटीक्स की विशेषताओं में एक परिवर्तन है कि पता चलता है। इसके अलावा, हम रोग में इंसुलिन के स्राव में कमी आई में सबसे बड़ा कारक उत्तरदायी कोशिकाओं 7 की संख्या में कमी है कि दिखा।
चित्रा 1:। Clamping और इंजेक्शन की साइटों की एक आरेख आम यकृत वाहिनी और सिस्टिक वाहिनी के जंक्शन के पास आम पित्त नली के लिए एंजाइमों इंजेक्षन। अग्नाशय वाहिनी के लिए इंजेक्शन एंजाइम की सुविधा के लिए एक नाड़ी दबाना द्वारा वाल्टर की कलसा दबाना।
2632fig2.jpg "/>
चित्रा 2: चूहों में इंजेक्शन प्रक्रिया। शीर्ष व्यक्ति वाल्टर की कलसा पर लागू एक संवहनी क्लैंप के साथ आम पित्त नली के अंदर सुई को दिखाता है। निचला आंकड़ा इंजेक्शन के बाद liberase-perfused अग्न्याशय से पता चलता है।
चित्रा 3: जंगली प्रकार और डीबी / DB अलग टापू की विशिष्ट छवियों (ए) जंगली प्रकार पृथक टापू।। (बी) DB / DB पृथक टापू। संलग्न कोष्ठकी कोशिकाओं (तीर) के साथ टापू पच अंडर (सी)। (डी) छोटे और फजी टापू (तीर) के साथ अधिक-पच टापू। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। कस्टम निर्मित 2 फोटॉन खुर्दबीन के मुख्य घटकों में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ दर्ज की गई है के रूप में एक भी इंसुलिन दाना संलयन घटना का उदाहरण वाम आंकड़ा (क) पहले और (बी) 15 मिमी के जवाब में एक exocytic घटना (तीर) की उपस्थिति ग्लूकोज उत्तेजना के बाद सेल का प्रतिनिधित्व करता है।। यह प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ जब (सी) छोटा दाना में कोशिकी डाई SRB के प्रवेश करने के साथ SRB लेबलिंग दिखाता है। (डी) एक exocytic घटना के हित के एक क्षेत्र पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ ही sequentia से पता चलता हैइस exocytic घटना (पैमाने बार 1 माइक्रोन) के एल छवियों। क्या एट अल 2014 7 से संशोधित छवि। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6:। कोशिकी डाई के रूप में SRB साथ 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत जंगली प्रकार और मधुमेह DB / DB टापू की प्रतिक्रियाओं इन प्रयोगों इंसुलिन दाना संलयन की घटनाओं में 15 मिमी ग्लूकोज उत्तेजना के जवाब में दर्ज कर रहे हैं। पीले हलकों रिकॉर्डिंग के 20 मिनट के दौरान exocytic घटनाओं की साइटों रहे हैं। क्या एट अल 2014 7 से संशोधित छवि।
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Discussion
आइलेट अलगाव में सबसे महत्वपूर्ण कारक अग्न्याशय की प्रारंभिक छिड़काव है; एक के तहत एक काफी कम आइलेट उपज में अग्न्याशय परिणामों perfused। अन्य कारकों को भी इस तरह के पाचन के समय और आंशिक रूप से छिड़काव के स्तर के लिए क्षतिपूर्ति कर सकता है जो झटकों के स्तर के रूप में अलगाव की गुणवत्ता प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, एक पूरी तरह से perfused अग्न्याशय धीरे मिलाते हुए, जबकि एक के तहत अग्न्याशय कठिन झटकों के साथ ~ 20 मिनट पाचन की आवश्यकता हो सकती पच इसके विपरीत, 18 मिनट 30 सेकंड के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated करने की आवश्यकता होगी। हमारे हाथ में दो पाचन एंजाइमों का मिश्रण या तो अकेले एक से बेहतर आइलेट अलगाव प्रदान करता है। Collagenase केवल विधि के लिए, पाचन समय गंभीर रूप से आइलेट उपज और केवल 30 सेकंड के समय के अंतर को नाटकीय रूप से गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं प्रभावित करता है। केवल liberase के लिए, उपज स्वीकार्य है लेकिन अंडर पाचन कभी कभी हम collagenase के अलावा बेहतर संयोजी ऊतक को पचाने में मदद करता है कि विश्वास करते हैं, क्या होता है।
टापू पृथक किया गया है के बाद किया जा सकता है कि संभव प्रयोगों की एक नंबर रहे हैं। पृथक टापू तुरंत अलगाव के बाद paraformaldehyde या मेथनॉल में तय की और ब्याज 10 में प्रोटीन का स्थान निर्धारित करने के लिए immunofluorescence धुंधला में इस्तेमाल किया जा सकता है। पृथक टापू एकल कक्षों में फैलाया जा सकता है। इस आइलेट अलगाव के एक ही दिन पर या आइलेट संस्कृति के कुछ ही दिनों के बाद किया जा सकता है। एकल कक्षों तो बाहर चढ़ाया जाता है और यह इस तरह के पैच दबाना और कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी के रूप में तकनीक के लिए मुख्य आधार रहा है कि इस तैयारी है। उपाय है कि प्रयोगों मेंइंसुलिन का स्राव, साथ ही रहते सेल 2 फोटॉन इमेजिंग के लिए, हम टापू प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा देने के लिए संस्कृति में 2 दिनों की आवश्यकता होती है कि मिल गया है। क्या संस्कृति में हो रहा है अच्छी तरह से समझ नहीं है, लेकिन अलगाव और पाचन प्रक्रिया से वसूली की अवधि माना जाता है।
यहाँ प्रस्तुत 2 फोटॉन तकनीक बरकरार टापू के भीतर कई कोशिकाओं से व्यक्ति छोटा दाना संलयन के स्तर पर छवि के लिए इंसुलिन का स्राव प्रक्रिया शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है। हम दाना संलयन घटनाओं और उनके समय की संख्या मात्रा और इंसुलिन का स्राव 8 के अस्थायी प्रोफाइल के साथ संगत है कि मिल गया है। इस विधि इंसुलिन दाना संलयन घटनाओं के बहुमत का पता लगाने का सुझाव है। Fusing के कणिकाओं में डाई प्रविष्टि 7,8 अध्ययन किया जा रहा बीटा कोशिकाओं में है कि इंसुलिन दाना संलयन प्रदर्शित करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों का संचालन करने के लिए हम हद तक चला गया है इंसुलिन दाना संलयन की घटनाओं का पता लगाने के लिए एक विशेष तरीका नहीं है कि यह देखते हुए
सभी इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए सामान्य हैं कि 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ तकनीकी समस्याओं का एक नंबर रहे हैं। उदाहरण के लिए, हम ध्यान से हम डिटेक्टरों के लाभ को कम कर सकते हैं ताकि टापू में पर्याप्त रोशनी प्राप्त करने की कोशिश का विरोध कारकों शेष है, और इसलिए हम कोशिका क्षति का कारण है कि टापू में इतना प्रकाश डालने के साथ, शोर को कम। हमारी प्रणाली में, एक Pockels सेल स्पंदित लेजर (चित्रा 3) attenuate करने के लिए प्रयोग किया जाता है; सभी वाणिज्यिक प्रणालियों नमूना करने पर गिर जाता है कि प्रकाश की तीव्रता को बदलने के लिए तंत्र है।
सारांश में, डीबी सावधान अलगाव के संयोजन / डीबी टापू और पूरे आइलेट 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी उपस्थित नए अवसरों इंसुलिन का स्राव की प्रक्रिया का अध्ययन करने और टाइप 2 मधुमेह में महत्वपूर्ण दोषपूर्ण तत्वों का निर्धारण करने के लिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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