Introduction
A maioria dos tecidos do corpo são materiais viscoelásticos moles com um módulo de Young na gama de 0,1 kPa para o cérebro a 100 kPa durante cartilagem mole, ainda, a maior parte da investigação de células in vitro é realizada em culturas de tecidos de poliestireno (TCP), que tem um módulo de ~ 1 GPa . 1 Esse descompasso rigidez afeta significativamente a forma como as células respondem ao seu meio ambiente. Um crescente corpo de pesquisa é, assim, dedicado a elucidar o efeito de rigidez do substrato sobre o destino de vários tipos de células, incluindo células estaminais 2,3 4 Como resultado., Vários hidrogéis têm sido desenvolvidos para auxiliar no entendimento de células dependente de rigidez biologia incluindo poliacrilamida (PA), 5-7 polietileno glicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 e 11 de alginato. Embora a evidência de que a rigidez substrato tem um impacto substancial sobre o destino celular está crescendo, a maioria dos estudos são realizados em uma pequena escala com um pequeno número de samples. Multidimensionais, estudos sistemáticos sobre o efeito da rigidez substrato para uma variedade de tipos de células ou condições ambientais são raros. 12
Várias tecnologias de hidrogel de alto rendimento promissoras foram desenvolvidas, incluindo microarranjos baseados em PEG, 13 dispositivos microfluídicos para a produção de microesferas de agarose de hidrogel, 14 ou micro e nano-hastes onde rigidez é modulada pelo diâmetro e altura das microrods. 15 No entanto , as tecnologias para preparar tais substratos são sofisticados e disponível para um número limitado de laboratórios. Muita pesquisa envolvendo rigidez modulado respostas das células utiliza poliacrilamida (PA) géis que não só são baratos e simples de implementar, mas também exibem uma gama fisiologicamente relevante de módulo de Young, a saber, 0,3 -. 300 kPa 16-22 No entanto, os métodos existentes para fabricar PA géis para cultura de células são intensivos de trabalho e, consequentemente, prepared em pequenos lotes. Algumas das dificuldades associadas com a preparação de géis PA como substratos de células-tronco a partir da exigência de que os géis tem que estar preparado: 1) na ausência de oxigênio para permitir a polimerização completa, 2) com uma superfície plana e lisa para permitir a célula uniforme ligação e de espalhamento, e 3) fixada permanentemente na parte inferior da placa de cultura de células para prevenir flutuação.
Diversos grupos tentaram produzir géis PA para cultura de células em grandes lotes. Semler et al., Folhas de espessura preparados de géis de PA, que foram depois "cortado" com um furador e colocadas em placas de 96 poços. 23 No entanto, este método está limitado a géis mais duras, ou seja,> 1 kPa no módulo de Young, porque mais suave géis são "pegajoso", difícil de cortar, e facilmente danificada. Mih et ai. Desenvolveram uma técnica mais sofisticado que permite que os géis a ser polimerizado directamente em uma placa com múltiplas cavidades com fundo de vidro.
Este artigo descreve uma maneira simples e barata para montar géis PA em um prato com vários poços que poderiam ser facilmente adotado por qualquer laboratório. Aqui, um suporte de plástico flexível é utilizado, que tem dois lados - um um hidrofóbico, que é repelente para géis de PA, e um uma hidrofílica, que liga covalentemente o gel PA sobre deposição. Uma vez que as folhas de gel de PA são depositados e permanentemente fixo ao suporte de plástico flexível, que permite manipular géis de qualquer espessura ou rigidez e cortando-os em qualquer forma desejada. Este aproxoach não só produz personalizados lamelas '' plásticas em tamanhos não anteriormente disponíveis no mercado, mas também elimina a necessidade de superfícies de vidro-tratamento pré, quer lamelas de vidro ou os poços de placas de múltiplos poços com fundo de vidro caros, com uma solução de ligação PA, que é uma tediosa e um passo consumidor de tempo. Finalmente, as folhas de geles uniformes PA pode ser preparado em grandes lotes e armazenados de-hidratado durante vários meses.
Em resumo, o ensaio aqui apresentado constitui uma melhoria em relação aos métodos existentes em vários aspectos. Em primeiro lugar, o processo de montagem de placa de poços múltiplos é eficaz, e o custo global dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os hidrogéis são produzidas em grandes lotes de um único filme em gel homogénea. Finalmente, apenas os materiais que se encontram comercialmente disponíveis são necessários. A utilidade do ensaio é ilustrada a explorar o efeito da rigidez do substrato na morfologia celular e a área de difusão.
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Protocol
1. Preparação de Soluções de Hidrogel Alíquotas e associadas
- Preparação da solução precursora de gel de poliacrilamida.
- Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1.
NOTA: Estas soluções podem ser preparadas em grandes lotes e guardadas a 4 ° C durante até vários meses.- ATENÇÃO: A acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente, quando em forma de pó: assim, de preferência, utilizar 40% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<23 ° C, área bem ventilada).
- CUIDADO: bis-acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente,quando na forma de pó: assim, utilizar de preferência 2% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<4 ° C, área bem ventilada).
- Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1.
- Preparação e utilização de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alíquotas. CUIDADO: Sulfo- SANPAH causa irritação ocular grave; lidar com luvas e adequada para os olhos ou a protecção face. Armazenar a -20 ° C após o recebimento e antes de alíquotas.
- Para armazenar sulfo-SANPAH: dissolver Sulfo-SANPAH em dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alíquota da solução estoque em tubos de centrífuga de 50 micro de 20 ul por tubo. Congelamento flash em gelo seco ou em azoto líquido (um passo opcional, mas preferido para preservar a máxima eficiência reticulador) e armazenar a -80 ° C.
NOTA: As alíquotas can ser armazenados durante vários meses. - Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar o brevemente aliquota e diluída em 480 ul de água desionizada. Use imediatamente. Sulfo- SANPAH hidrolisa rapidamente em água; por isso tome cuidado para realizar todas as etapas acima rapidamente.
- Para armazenar sulfo-SANPAH: dissolver Sulfo-SANPAH em dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alíquota da solução estoque em tubos de centrífuga de 50 micro de 20 ul por tubo. Congelamento flash em gelo seco ou em azoto líquido (um passo opcional, mas preferido para preservar a máxima eficiência reticulador) e armazenar a -80 ° C.
- Preparação de persulfato de amónio (Mr 228,18 g / mol) alíquotas.
NOTA: persulfato de amónio causa dos olhos, pele e irritação das vias respiratórias. Use equipamento de proteção individual adequados ao manusear. Pega de persulfato de amónio em pó em um exaustor química. Pó Armazenar em local seco, bem ventilado. Uma vez aliquotas, a solução diluída pode ser utilizada na bancada de trabalho.- Dissolve-se o persulfato de amónio em água desionizada para se obter uma concentração final de persulfato de amónio de 10% w / v. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Descongelar imediatamente antes da utilização.
- Preparação de colágeno tipo I solução.
- Preparar solução de colagénio a 0,2 mg / ml por diluição do stock assimlução em 1x tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Guarde em breve gelo ou usar imediatamente após a diluição.
2. Preparação Hidrogel (Veja a Figura 1)
- Preparação das lâminas de vidro hidrofóbicas.
- Coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e usar papel de seda para se espalhar por toda a superfície. Deixe o ar seco e limpe com um lenço de papel novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico.
NOTA: Loja solução hidrofóbica em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Use equipamento de proteção individual ao manusear. Trabalhar em uma área bem ventilada.
- Coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e usar papel de seda para se espalhar por toda a superfície. Deixe o ar seco e limpe com um lenço de papel novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico.
- Preparação do suporte de plástico flexível.
- Cortar o suporte de plástico flexível para corresponder ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico.
- Marcar o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível, arranhando a superfície levemente com uma ferramenta afiada, como um bisturi.
NOTA: Uma vez que o gel - que é totalmente transparente - Seca, As marcas de arranhões vai ajudar a distinguir de que lado o apoio de plástico flexível contém o gel.
NOTA: O suporte de plástico flexível tem um lado hidrofóbico e um hidrofílico. Uma vez depositado, poliacrilamida adere permanentemente ao lado hidrofílica do suporte de plástico que facilita o manuseio fácil hidrogel subseqüente.
- Preparação de Gel (exemplo volumes são dados para 5 ml de soluções precursoras de gel).
NOTA: 5 ml seria suficiente para produzir 40 ~ géis quando a espessura inicial de gel é de 0,5 mm. Mais géis podem ser produzidos, se a espessura do gel é reduzida.- Colocar 4972,5 ul de solução precursora de poliacrilamida de concentração final desejada (Tabela 1) para um tubo de 50 ml. Colocar em uma câmara de desgaseificação durante 30 minutos, com a tampa aberta.
NOTA: O oxigênio age como uma armadilha de radicais livres e, quando presente, ele inibe a polimerização. - Adicionar 25 ul de 10% w / v de persulfato de amónio (ver ponto 1.3) para alcançar a solução definitivapersulfato de amónio concentração de 0,05%.
- Adicionar 2,5 mL de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED, M r 116,24 g / mol) para a solução de gel desgaseificado para obter uma concentração de TEMED final de 0,5%.
NOTA: Loja TEMED em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Manusear de um fume hood química quando vestindo equipamentos de proteção individual adequados. Manter hermeticamente fechada sob um gás inerte, uma vez que é altamente sensível à humidade e ar. - Misture a solução suavemente por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Não vórtice para evitar a difusão do oxigênio na solução precursor gel.
- Pipeta a solução de gel para o lado hidrofílica do suporte de plástico flexível e sanduíche com hidrofóbica revestido lâmina de vidro. Separa-se as duas lâminas com espaçadores de silicone de espessura desejada (por exemplo, 0,5 mm). Deixar um pequena quantidade (~ 100 mL) de solução de precursor de polímero no tubo de 50 ml para usar como um indicador de gelificação.
NOTA:Qualquer espaçador pode ser utilizado. Por exemplo, uma única tira de Parafilm dá uma espessura de gel inchado definitiva entre 100 - 120 um. - Coloque outra placa de vidro em cima do sanduíche apoio / gel de plástico flexível para averiguar uma superfície uniforme hidrogel após polimerização.
- Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos, embora menos tempo pode ser usado para géis de maior% em peso, se desejado. Para verificar se o gel tenha polimerizado, observar a solução restante no tubo de 50 ml; se a solução restante foi gelificada, então é provável que a gelificação na placa de vidro ter sido iniciado assim. No entanto, note que a abertura prematura do molde vai evitar a polimerização completa.
- Uma vez formado o gel, retire o suporte de plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado no topo, e do lado do gel de definir-se secar ao ar.
NOTA: convecção de calor ou de secagem também podem ser utilizados para acelerar este passo. Depois secou-se sobre o suporte de plástico flexível, o gel pode ser lojad indefinidamente.- Marcar algum ponto desencapado do suporte de plástico flexível, onde géis de poliacrilamida não formam devido a bolhas. Mark, enquanto o gel ainda é hidratado, pois isso vai misturar-se com o apoio de plástico flexível, uma vez que o gel é seco.
- Colocar 4972,5 ul de solução precursora de poliacrilamida de concentração final desejada (Tabela 1) para um tubo de 50 ml. Colocar em uma câmara de desgaseificação durante 30 minutos, com a tampa aberta.
3. Assembléia Multiwell Plate, Collagen Coating, e Esterilização
- Conjunto da placa Multiwell.
- Uma vez seca, cortada géis PA nas formas desejadas.
- Para uma placa de 96 poços, usar um furador pesado com um diâmetro de ~ 6 mm. Use um cortador de papel pesados para cortar géis em formas quadradas ou retangulares. Como alternativa, use uma tesoura.
- Prepare a cerca de 500 ul de PDMS por placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Para os geles de cola para a parte inferior de uma placa com múltiplas cavidades, colocar uma pequena gota (~ 5 mL) de polidimetilsiloxano (PDMS) no centro de cada poço a. Utilizando uma pinça, coloque uma poliacrilamidae gel em cada lado de suporte de plástico bem, flexível para baixo. Para permitir que o PDMS para curar, deixar a placa montada a 37 ° C durante um mínimo de 4 h.
- Uma vez seca, cortada géis PA nas formas desejadas.
- Revestimento de colagénio de géis de poliacrilamida.
- Com uma pipeta de transferência, coloque uma pequena quantidade (7-8 ul) de sulfo-SANPAH (vide ponto 1.2.2) em cada poço e redemoinho de lado a lado para revestir a superfície do gel uniformemente. Trabalhe rapidamente desde sulfo-SANPAH não é estável em água.
- Colocar a placa bem sob uma lâmpada de UV de alta intensidade (intensidade = 37 mW, λ = 302-365 nm) durante 5 min. Lavar os géis com PBS para remover o excesso de sulfo-SANPAH.
- Pipetar 50 ul de 0,2 mg / ml de colagénio tipo I solução (ver ponto 1.4) em cada poço. Deixar a placa coberta à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou O / N a 4 ° C.
NOTA: Para acelerar o processo de revestimento de colagénio, uma pipeta de transferência pode ser usado para adicionar a solução de colagénio. Tipicamente, 1-2 gotas da solução deve ser suficiente para completarly cobrir a superfície do gel. - Deixar a placa com cavidades à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h, para permitir a ligação do colagénio.
- Lavar com PBS para remover o excesso de solução de colagénio e esterilizar sob UV (λ = 200 nm) num capuz de cultura de tecido durante 2 horas.
- Mergulhe os géis em meio completo (veja seção 4.1 para médias composição) O / N para hidratar e equilibrar. Use para celular semear imediatamente ou guarde na geladeira por até 2 dias.
4. Sementeira celular no PA Rigidez Assay
NOTA: Embora típico para linhas de células de mamíferos comuns, o protocolo apresentado nesta seção é usado especificamente com o câncer de mama linha de células MDA-MB-231 (ver Figuras 4 e 5).
- Recolher as células a partir de frascos de cultura de tecidos por exposição a 5% de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cada cm 2 de área garrafa de cultura; por exemplo, utilizar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 frasco de cultura de células. Re-suspender as células recolhidas em meio completo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma concentração celular final desejado. Tendo em conta o tempo de duplicação celular, bem como a duração do tempo as células serão semeadas no ensaio, escolher uma concentração de células sub-confluente apropriado. Certifique-se de que o meio adicionado é o suficiente para submergir completamente os hidrogéis.
NOTA: Uma vez que os hidrogéis foram pré-equilibrada em mídia (consulte a etapa 3.2.6) 100 mL de volume deve ser suficiente. Os volumes médios típicos usados para placas com múltiplas cavidades deve ser suficiente uma vez que os geles tenham sido pré-equilibrada em meios na etapa anterior.
NOTA: O ensaio seria adequado para qualquer tipo de célula dependente de fixação.- Contar o número de células em microscópio invertido usando um hemocitômetro. Carga de 10 ul de suspensão de células em cada porta de hemacitómetro e a média da contagem de células a partir de, pelo menos, 8 quadrantes. Para obter oconcentração celular final, multiplicar o número de células por 10 4.
NOTA: Os melhores resultados de contagem de células são obtidos quando o número de células em cada quadrante hemacit�etro é 20-50.
- Contar o número de células em microscópio invertido usando um hemocitômetro. Carga de 10 ul de suspensão de células em cada porta de hemacitómetro e a média da contagem de células a partir de, pelo menos, 8 quadrantes. Para obter oconcentração celular final, multiplicar o número de células por 10 4.
- Cultura das células para o ensaio de rigidez PA em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Recolher as células, quando necessário por exposição a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cm2 de garrafa de cultura de tecidos. Durante todas as etapas de manipulação celular, ter um cuidado especial para não perturbar a superfície do hidrogel: aspirado ou médio pipeta ligeiramente derrubando a placa com vários poços de lado e tocar a ponta da pipeta na parede lateral de cada bem, ao contrário de tocar o hidrogel.
NOTA: Com excepção para tomar especial cuidado para não danificar a superfície do hidrogel durante a manipulação padrão de cultura de tecidos, as células semearam-se sobre o ensaio de rigidez podem ser manipulados da mesma maneira como se eles foram semeadas sobrepara uma placa com múltiplas cavidades regulares.
5. imagens de células semeadas em PA Rigidez Assay
- Células de imagem diretamente sobre o ensaio de rigidez PA.
NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente, ou confocal, pode ser usado para imagens de células.
NOTA: O suporte de plástico flexível utilizado para construir o ensaio de rigidez é totalmente transparente e não autofluoresce ou interferir com imagens de células. No entanto, apesar de o próprio suporte de plástico flexível é transparente, capacidades de imagem será limitada pela distância de trabalho do objectivo. O suporte de plástico flexível tem uma espessura de 0,23 mm e uma distância de trabalho típico de uma objectiva 10X é ~ a 4 mm, para diminuir acentuadamente maiores ampliações.- Para imagens de células vivas, a posição de ensaio de rigidez PA no suporte da placa de microscópio e imagem. Mantenha as sessões de imagem com menos de 2 horas, ou usar um microscópio equipado com uma câmara ambiental para tempos mais longos de imagem.
- Quando estou de células vivasenvelhecimento não é o objetivo, corrigir as células em solução de formaldeído 4% suplementado com 0,1% de detergente. Soak células em fixador à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas. Enxágüe com PBS duas vezes. Descarte de resíduos fixador em um recipiente de resíduos designada.
NOTA: As células podem ser visualizados de imediato ou armazenados submersa em PBS a 4 ° C durante até 2 semanas. CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manusear com luvas em uma coifa química.
NOTA: protocolo de fixação celular tem que ser escolhido com base nos coloração celular e manipulação de protocolos posteriores, porque certos fixadores danificar algumas proteínas celulares. - No caso da imagiologia fluorescente, mancha células com coloração de células desejada directamente na placa com múltiplas cavidades fixo. Imagem imediatamente.
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Representative Results
Poliacrilamida (PA) hidrogéis são amplamente usadas para testar as respostas celulares dependentes de rigidez. 17,24 por mistura de várias concentrações de acrilamida (A) e bis-acrilamida (B) pode-se fazer géis PA que abrangem a gama de rigidez da maioria dos tecidos moles em o corpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa Jovem 1 No entanto, a preparação de géis de poliacrilamida é tedioso e demorado, muitas vezes limitando a sua utilidade em aplicações "high-throughput", como para a seleção exemplo droga 12 Aqui, um método simples e rápido para montagem géis PA em placas multi-poços ou qualquer outro recipiente de cultura de tecido desejável é apresentada (Figura 1). A Figura 2A mostra o módulo de elasticidade em função de várias concentrações de A e B (também resumidos na Tabela 1). Os módulos de A e B combinações adicionais são relatados na literatura 17,25,26 A rigidez de gel totalmente swolle.n géis foi medido por reologia (AR reómetro 2000EX, TA Instruments) com uma geometria paralela 20 milímetros superior, teste de varrimento de frequência de oscilação 1-10 Hz, e 2% de deformação constante. Como esperado, foi demonstrado que tanto o módulo de armazenamento, G 'e módulo de perda, G ", são independentes da frequência (Figura 2B). Foi também confirmado que a secagem e, em seguida, re-hidratar o gel, não afecta o seu módulo de Young (Figura 2C). O módulo de Young foi relacionado com o módulo de armazenamento através da seguinte equação: 
onde E é o módulo de Young e v é o coeficiente de Poisson que foi aproximada de 0,5 para géis PA. 27 Note-se que os valores relatados são para hidrogeles preparados com TEMED. Hidrogéis PA também poderia ser preparado por reticulação UV quando o tempo de exposição e intensidade da radiação UV são optimizados (
Além disso, demonstrou-se que as células semeadas em hidrogéis de stiffne diferentess apresentaram morfologia diferente. Para esta experiência, cancro da mama MDA-MB-231 foram semeadas em cima dos géis PA para 24-72 hr. As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina, numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. As células foram semeadas a 1 x 10 5 células / ml ou 1 x 4 10 células / poço para uma placa de 96 poços. Esta é uma densidade de sementeira de células típico - 4 vezes menor do que a densidade de células de confluência, onde confluência para uma linha celular de mamífero é atingido a 1 x 10 ~ 5 células / cm2. As imagens foram tiradas em microscópio de fluorescência invertido e analisados em ImageJ via o descritor Forma e plug-ins de software Area. Observou-se que quando semeadas em géis de PA durante 24 h, de cancro da mama MDA-MB-231 permaneceram rodada nas moles de 0,5 kPa e 1 geles, mas foram capazes de se espalhar e alongados no gel rígido 100 kPa (Figura 4). A Figura 4 também showcases o facto de hidrogeles feitos na parte superior do suporte de plástico flexível são transparentes e permitir a visualização e microscopia. Além disso, o suporte de plástico flexível não autofluoresce e assim não interferir com a imagiologia de células marcadas por fluorescência. A morfologia celular foi ainda quantificado em termos de área de células total e o factor de forma da célula de espalhamento - circularidade (Figura 5). Área espalhamento celular foi medida através da criação de uma máscara para traçar o perímetro de cada célula. Forma celular (circularidade) foi então calculado a partir da seguinte relação: 
Circularidade é medida numa escala de 0-1, onde 0,6-1 foram levados para designar células arredondadas e 0 - 0,5 foram tomadas para designar células alongadas. Aproximadamente três centenas de células de pelo menos três experiências independentes foram analisadas para cada poin dados t. As diferenças estatísticas foram calculadas com base na análise de fator de variância (ANOVA), onde os conjuntos de dados foram consideradas significativamente diferentes quando p <0,05.
Figura 1. Representação esquemática da preparação do gel de poliacrilamida no suporte de plástico flexível. A figura representa os vários passos envolvidos na preparação de géis de PA no suporte de plástico flexível. Depois o gel seque completamente, ele pode ser cortado ou perfurado em qualquer forma desejável. Um perfurador inteiro (~ 6 mm de diâmetro) é mais conveniente quando se preparam géis para uma placa de 96 poços, enquanto um cortador de papel pesado pode ser utilizada para formas quadradas ou rectangulares. A figura também mostra os bordos das cavidades, com e sem um gel, para demonstrar que a cobertura completa bem inferior pode ser alcançada com este método. oad / 52643 / "target =" _ 52643fig1large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Rigidez de PA hidrogéis como medido por reologia. (A) O módulo de representativas novo por cinco concentrações diferentes de A & B (consultar a Tabela 1 para siglas); (B) de armazenagem e de módulo de perda como uma função da frequência como medido por reologia; (C) géis apresentam o mesmo módulo de Young inicialmente (Inicial) e depois de terem sido secos e re-hidratados (Re-hidratado) independente da concentração de precursor de polímero. Todos os géis para as medições de reologia foram preparados como placas de 20 mm de diâmetro e 1-1,5 mm de altura (em cima do inchaço completa).
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Figura 3. O colagénio revestimento em géis de PA. O revestimento de colagénio (verde) está distribuído de forma eficiente e retida sobre o gel de PA (vermelho) de superfície independente do módulo de rigidez do hidrogel de Young). O colagénio marcado com Cy5 foi usada para estes dados. Grânulos Red-fluorescentes foram embutidas no hidrogel PA para visualização ajuda. Imagens transversais foram tiradas em um microscópio confocal (escala bar = 100 mm). Imagem adaptada de Zustiak et. al. 5 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. contrato Fase (top de linha) e fluorescentes (linha de fundo) imagens de MDA-MB-231 células semeadas em géis de PA, durante 24 horas. MDA-MB-231 permanecem rodada em gel macio (Young 7; s módulo de 0,5 e 1 kPa), mas alongado em géis de PA rígidos (módulo de Young de 100 kPa). As células foram semeadas sobre os géis durante 24 h, fixos em etanol e corados com laranja de acridina (AO - verde) para visualizar o citoplasma celular e DAPI (azul) para visualizar núcleo da célula; escala bar = 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. celular e a área de difusão circularidade são afectados pela rigidez do substrato subjacente. (Uma) célula área espalhando MDA-MB-231 é significativamente aumentada na 100 kPa, em oposição aos 0,5 kPa géis. (B) a circularidade celular diminui com o aumento da rigidez de gel de PA. Os asteriscos designar diferenças significativas; p <0,05.
Figura 6. Representação esquemática de uma preparação alternativa de gel de poliacrilamida em suporte de plástico flexível. A figura representa os vários passos envolvidos na preparação de géis de PA no suporte de plástico flexível. Aqui, o suporte de plástico flexível é inicialmente pré-cortada em lamelas "" de plástico de uma forma e tamanho desejados. Esta técnica funciona melhor para hidrogéis moles. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Acrônimo | A acrilamida% | Bis-acrilamida% | Acrilamida a partir da solução estoque de 40% (ml) | Bis-acrilamida a partir da solução stock 2% (ml) | Água (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4.312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0,1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0,1 | 1.000 | 250 | 3750 | 9,71 ± 0,64 | 29,14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1.000 | 625 | 3375 | 22,00 ± 2,10 | 66,01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37,42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tabela 1. As concentrações de acrilamida (A) e agente reticulante bis-acrilamida (B) e o gel resultante rigidez PA. Rigidez, aqui representados por L 'e E, foi medida por reologia. G 'é o módulo de armazenamento a 1 Hz de frequência. O módulo de Young, E, foi calculada a partir da Eq. 1. O desvio padrão (SD) foi calculado com base em três experimentos independentes com 3-5 amostras medidas por experimento. Os acrónimos na tabela correspondem aos siglas utilizadas na Figura 2A.
| Intensidade de UV = 15 mW / cm 2 | Tempo de exposição = 300 seg | ||
| Tempo (s) | E (kPa) ± SD | Emintensidade (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28,05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21,13 ± 3,01 |
| 125 | 19,11 ± 2,29 | 37 | 20,01 ± 2,38 |
| 300 | 28,05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tabela 2. polimerização UV é uma alternativa e um método mais rápido para a preparação de gel de PA, quando as condições são optimizadas de gelificação; PA3 (consultar a Tabela 1) O gel é descrito. A tabela resume o módulo de Young resultante quando um tempo de exposição (duas colunas à esquerda) ou intensidade da radiação UV (duas colunas à direita) são variados para a mesma solução. Com base nos resultados da tabela, parece que o tempo de exposição de 300 seg e 15mW / cm 2 a intensidade da radiação UV dar maior rigidez gel PA, que é comparável com a rigidez do gel polimerizado, tradicionalmente, como relatado na Tabela 1.
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Discussion
Geles de poliacrilamida, originalmente desenvolvidos para electroforese, 28 são rotineiramente utilizados como substratos de cultura celular para estudar os efeitos de rigidez do substrato sobre a morfologia celular, motilidade, 3,24,29 e comunicação entre outras características celulares. Poliacrilamida permite a manipulação de rigidez do substrato para abranger a rigidez de todos os tecidos moles do corpo (0,3-300 kPa) 1 com uma simples mudança na concentração de precursor de polímero (Figura 2, Tabela 1; ver também as referências 17,25,26). Aliado ao fato de que os géis PA são relativamente barato e simples de preparar, eles se tornaram plataformas indispensáveis no estudo das interações célula-prima dependente da rigidez. No entanto, apesar de simples, a técnica actual para a preparação de géis PA está limitado a pequenos lotes. Este limitações resultam das características de gelificação do hidrogel, o que é uma polimerização por radicais livres catalisada por persulfato de amónioe TEMED. 30 Uma vez que a reacção de polimerização é uma cadeia de radical livre, que pode ser inibida por qualquer elemento que serve como uma armadilha de radicais livres, tal como o oxigénio. Portanto, uma vez que a difusão do oxigênio na solução de polímero tem que ser evitado durante a polimerização - o que poderia levar até 45 minutos para os géis mais suaves - simplesmente pipetagem os géis PA em uma placa de poços múltiplos aberto não é viável. Além disso, para ser utilizado como um substrato celular bidimensional (2D), a superfície do gel de PA deve ser plana. Ambos os requisitos acima ditam que, para produzir géis de PA como substratos celulares 2D, solução gel precursor de PA deve ser ensanduichada entre duas superfícies planas durante a polimerização - para inibir a difusão de oxigénio e nivelar a superfície do gel. Além disso, a superfície superior tem de ser tal que possa descolar-se facilmente a partir do gel expondo a superfície para a fixação das células. Isto é tipicamente conseguido por meio de revestimento hidrofóbico de uma superfície de vidro. Por último, quando posicionado em the os poços de uma placa com múltiplas cavidades, os géis de PA deve cobrir toda a superfície e assim ser impedido de flutuar. Cobertura da superfície completa bem inferior é especialmente importante em aplicações em que os ensaios utilizados para avaliar as células são do tipo que leva em conta toda a população de células no poço (por exemplo, o MTT). Se o gel de PA não cobre adequadamente todo o bem superfície, deve ser tomado cuidado para bloquear a adesão celular à superfície exposta bem como células poderia facilmente rolar para fora do gel para o vidro ou plástico. Se necessário, o bloqueio de BSA seguindo protocolos padrão ou usando-o fora prateleira kits de bloqueio de adesão celular à base de BSA deve ser suficiente para bloquear a ligação de células para a parte inferior do poço de placa. Por exemplo, para preparar uma superfície coberta de BSA, 0,5 mg / ml de solução de BSA em PBS, pH 7,4 deve ser adsorvido sobre o prato de cultura de tecidos durante 20 min à temperatura ambiente, enxaguadas com PBS e utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante até 2 semanas. BSA foi mostrado para bloquear a adesão de células oculturas de células de mamíferos f em ambas as superfícies de poliestireno hidrofílicos e hidrofóbicos, reduzindo grandemente as forças de adesão celular como medido por microscopia de força atómica. 31 de BSA foi usado rotineiramente para bloquear a adesão de células de mamíferos, bem como criar superfícies modeladas celulares. 32,33
A técnica descrita neste artigo, satisfaz todos os requisitos acima, permitindo a produção em massa de géis PA uniformes de tamanho e forma personalizada. A técnica é mais simples e mais eficiente do que o atual padrão de imprensando solução precursora gel PA entre duas lamelas de vidro. Além disso, não requer qualquer equipamento sofisticado e assim é facilmente susceptível de ser adoptada por qualquer laboratório de pesquisa. É também mais rentável, uma vez que não exige a utilização de placas de vidro ou de lamelas de vidro, que não só são dispendiosos, mas também têm tamanhos limitados. A técnica é também mais rápido por várias razões. Em primeiro lugar, que não envolve quaisquer etapas de pré-tratamentotípico para superfícies de vidro, desde o suporte de plástico flexível é concebido com duas superfícies distintas - um lado hidrófilo que se liga permanentemente a poliacrilamida e um lado hidrófobo que pode ser facilmente descascada, após a formação de gel. Em segundo lugar, porque o suporte de plástico é flexível, é mais fácil e mais rápido para descolar o gel formado: quando géis finas são formadas entre duas lâminas de vidro, descascando o cursor superior hidrofóbico é difícil e muitas vezes resulta em ruptura que também compromete o gel. Por último, devido à transparência de suporte de plástico flexível, a polimerização de UV mais rápida pode ser empregue em oposição à polimerização à base de TEMED padrão que pode levar tanto quanto 45 minutos (Tabela 2). Os dados na Tabela 2 demonstra que a rigidez semelhante, quando o tempo de polimerização e intensidade da radiação UV são optimizados pode ser alcançada por ambos os métodos de polimerização de TEMED e UV.
Os hidrogéis são preparados em pl flexívelastic suporte, como representado na Figura 1. É recomendável efectuar a gelificação de uma câmara de desgaseificação para evitar a polimerização incompleta das bordas do gel (isto é, os efeitos de borda) devido a difusão de oxigénio entre as duas superfícies que sanduíche da solução de polímero. O objectivo é criar uma película de hidrogel de grande no topo do suporte de plástico flexível, assim, a placa de vidro de qualquer tamanho seria apropriado, mas que irão ditar o tamanho da película de poliacrilamida que pode ser alcançado. O vidro pode ser revestido com qualquer revestimento hidrófobo, ou alternativamente, a lateral hidrofóbica do suporte de plástico flexível poderá ser utilizado em vez disso. Uma vez que um filme de gel de PA é formada, que é seca, cortada nas formas desejadas, e, em seguida, re-hidratados antes da utilização. Quando secos, os géis podem ser armazenados indefinidamente. Foi confirmado por reologia, que a rigidez de gel de PA é inalterado após re-hidratação, mesmo quando os geles são armazenados em estado seco durante vários meses (Figura 2C). Contudo, por muito sofgéis t (≤ 1 kPa no módulo de Young) secagem e re-hidratação vincadas superfície exacerbar e crack formação. Esse comportamento é comum para cápsulas gelatinosas que sofrem de-hidratação e posterior re-hidratação ao ser geometricamente constrangido. 34,35 Nem todos os géis vinco ou crack, assim, é possível examinar visualmente os hidrogéis antes da utilização e só usar as amostras que exibem uma superfície lisa. Para evitar completamente a formação de fissuras e vinco, um método alternativo para preparar os hidrogéis macios está representado na Figura 6. Aqui, o suporte de plástico flexível é pré-cortada na forma desejada e o gel de PA é formada na parte superior, assim, os géis não fazer precisa ser de-hidratado, mas pode ser utilizado tal como preparado. Um benefício adicional desta estratégia alternativa é que mais ~ 2,5 géis podem ser produzidos a partir do mesmo volume de solução precursora hidrogel (a estimativa baseia-se na preparação de geles para uma placa de 96 poços padrão tal como descrito na secção de protocolo). Um cuidado quandoa preparação de hidrogeles desta maneira é ter o cuidado de evitar a infiltração de oxigénio, especialmente para os géis de tamanho menor (por exemplo, geles para ser utilizado em uma placa de 96 poços). Mesmo quando a solução precursora de gel é completamente desgaseificada, ou seja, livre de oxigénio, o oxigénio será de difusão entre as duas superfícies que a solução de PA sanduíche. Assim, a fim de evitar os efeitos de borda ou incompleta formação de gel ao longo dos bordos, é melhor para permitir que a polimerização se ocorrer na ausência de oxigénio. Na nossa experiência, uma câmara de vácuo funciona bem, apesar de um ambiente de gás inerte pode ser utilizado com igual sucesso.
Um cuidado final na preparação de PA hidrogéis como substratos celulares para testar as respostas celulares dependentes de rigidez, é que a espessura do hidrogel resultante é importante: para geles muito finos, as células são capazes de detectar o substrato subjacente 36 Utilizando a teoria e experimento. Lin et al., demonstraram que a profundidade à qual as células podem feel do substrato subjacente é dependente da dimensão lateral da célula. 29 Uma vez que a investigação actual é contraditória, identificando a espessura mínima necessária para impedir que as células de detecção do substrato "oculto" para ser de vários micra de 36 até 60 micra, 37 uma espessura mínima de 100 mm gel deve ser orientado para.
Ao montar os géis PA em uma placa com múltiplas cavidades, uma pequena gota de PDMS é utilizado para fixar o gel para o fundo do poço. PDMS foi escolhido porque actua como cola permanente após endurecimento, que é completamente transparente e não interfere com experimentos de microscopia subsequentes, é completamente não-citotóxica, e que cura em cerca de 4-8 horas deixando tempo suficiente para a montagem de placa. Seguramente assegurar os hidrogéis para a parte inferior dos aparelhos bem na manipulação de células: por exemplo, a lavagem vigorosa poderia desalojar hidrogéis não se firmemente preso. Se a mudança freqüente na célula mEDIA não é uma preocupação, então os géis podem ser temporariamente fixada à superfície bem por uma pequena gota de um líquido não-citotóxico e altamente viscoso, tal como glicerina.
Os passos finais antes da semeadura de células envolvem revestimento ECM da esterilização gel e então. Aqui revestimento de colagénio do tipo I é descrito (Figura 3) ainda que a mesma técnica pode ser aplicada por qualquer outra proteína da MEC. O bi-funcional crosslinker sulfo-SANPAH é utilizada para atingir um mesmo casaco monocamada. Pesquisa anterior tenha demonstrado que tal ligação covalente produz um revestimento mais uniforme do que simples adsorção de proteínas e também permite uma sintonização de 12 vezes da quantidade de proteína ligada usando simplesmente uma solução de proteína de concentração variável. 6 Finalmente, a placa de gel com múltiplas cavidades montado é esterilizado sob UV na capa cultura de tecidos por até 2 horas. A esterilização de UV permite para o ensaio a ser montado sobre uma bancada de laboratório fora da capa, quetorna o processo mais simples e logisticamente geral mais rápido.
As Figuras 4 e 5 ilustram alguns resultados representativos de células MDA-MB-231 com câncer de mama cultivadas em anexo de apoio de plástico PA géis flexíveis de diferentes rigidez. MDA-MB-231 foram escolhidas para demonstrar a utilidade método porque eles têm sido mostrados para reagir à rigidez do substrato subjacente por alterações mensuráveis na sua morfologia. 5,12 Como esperado, as células foram mais alongados e tinha uma área de difusão em maior as duras 100 kPa géis PA comparação com os macios 0,5 e 1 géis kPa PA (Figuras 4 e 5). A linha inferior na Figura 4 também demonstra o uso de dois corantes fluorescentes que coram o núcleo da célula e no citoplasma de células, que apresenta o facto de que o suporte de plástico flexível não interfere com a imagem ao microscópio fluorescente.
Em resumo, um método simples para preparar hidrogeles de poliacrilamida numaformato de placa de poços múltiplos é apresentada. A técnica é mais rápido, mais eficiente, e menos dispendioso do que os métodos actuais para a preparação de géis de PA a ser utilizados como substratos celulares, bem como permite a preparação de géis de tamanhos personalizados não se encontram disponíveis. Como ele não requer qualquer equipamento especializado, o método poderia ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa e seria particularmente útil em pesquisas voltadas para compreender as respostas celulares dependentes de rigidez.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K.
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D.
- Lin, Y. C., et al.
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J.
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C.
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
