Introduction
体内のほとんどの組織は、ソフト軟骨100キロパスカルに脳0.1キロパスカルの範囲のヤング率を有する軟質の粘弾性材料であり、まだ、 インビトロの細胞研究のほとんどは、約1 GPaの弾性率を有する組織培養ポリスチレン（TCP）上で実施される。1この剛性のミスマッチが大幅に細胞がその環境に対応方法に影響します。研究の成長体は、幹細胞を含む種々の細胞型、2,3の運命の基板の剛性の影響を解明するこうして専用である。4その結果、複数のヒドロゲルは剛性依存性細胞の理解を助けるために開発されている基板の剛性が細胞の運命に大きな影響を持っていることの証拠が増えている一方で、ポリアクリルアミド（PA）、5-7ポリエチレングリコール（PEG）、8,9-ジメチルシロキサン（PDMS）、10およびアルギン酸塩を含む、生物。11、ほとんどの研究は、上実施されるsの数が少ない小規模amples。細胞型または環境条件のアレイ用基板の剛性の影響に関する系統的、多次元研究は稀である。12
いくつかの有望なハイスループットヒドロゲル技術は、PEGに基づくマイクロアレイ、アガロースヒドロゲルマイクロビーズを製造するための13のマイクロ流体デバイス、14またはミクロ及び剛性がマイクロロッドの直径および高さによって変調されたナノロッドを含む、開発されてきた。15ただし、そのような基板を製造するための技術が洗練された研究室の限られた数に利用可能である。剛性変調細胞応答に関与する多くの研究が実施が安価で簡単であるだけでなく、ポリアクリルアミド（PA）ゲルを利用するだけでなく、ヤング率、すなわち、0.3の生理学的に関連する範囲を示す-を300kPaにPAを製造する16-22しかしながら、既存の方法細胞培養用ゲルは、労働集約的で、その結果、分取され小さなバッチでARED。細胞基質としてPAゲルの調製に関連する困難のいくつかは、ゲルを用意しなければならない要件から生じる：1）は、酸素の非存在下で完全な重合を可能にする、2）平滑な表面を有する均一なセルを可能にする付着及び拡散、および3）永久フローティング防止するための細胞培養皿の底に固定された。
いくつかのグループが、大きなバッチでの細胞培養のためのPAゲルを製造することを試みてきた。ゼムラーらパンチ、次いで「切断」であり、96ウェルプレートに入れ、PAゲルを調製した厚さのシート23は、しかしながら、この方法は、より堅いゲル、 すなわち、> 1キロパスカルのヤング率で、より柔らかいために制限されゲルは、カットすることは困難であり、容易に損傷を受けた「スティッキー」である。 MIH らは、ゲルが直接ガラスボトムウェルプレート中で重合することができ、より洗練された技術を開発した。
本論文では、簡単に任意の研究室によって採用することができ、マルチウェルプレートにPAゲルを組み立てるための簡単で安価な方法について説明します。撥PAゲルに疎水一つ、共有結合、堆積時PAゲルに結合する親水オン、 - ここで、柔軟なプラスチック支持体は、2つの側面を有し、利用される。 PAゲルシートは、可撓性プラスチック支持体に固定され永久に堆積された後は、任意の厚さまたは剛性のゲルを処理し、任意の所望の形状にして切断を可能にする。このAPPRoachは、PA結合溶液で、ガラスカバースリップまたは高価なガラスボトムマルチウェルプレートのウェルのいずれかを他の方法で市販されていないサイズのカスタムプラスチック「カバーガラス」を生成するだけでなく、ガラス表面-御馳走事前に必要がなくなるだけでなく、退屈で時間のかかる工程。最後に、均一なPAゲルシートは、大きなバッチで調製し、数ヶ月デ水和格納することができる。
要約すると、ここで提示アッセイは、いくつかの態様において、既存の方法の改良である。まず、マルチウェルプレートアセンブリのプロセスが効率的であり、必要な材料の全体的なコストが低い。第二に、ヒドロゲルは、単一の均質ゲルフィルムに大きなバッチで製造される。最終的に、市販されている唯一の材料が必要とされる。アッセイの有用性は、細胞形態の基板の剛性の影響を探索し、面積を広げることによって示されている。
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Protocol
ヒドロゲル関連ソリューションおよびアリコートの調製
- ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液の調製。
- アクリルアミド（A）を混合することにより、ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を製造（w / vの40％、Mは、rは 71.08グラム/モル）、架橋剤ビスアクリルアミド（B）（2％w / vの、Mは、154.17グラム/モルrの ）、およびデ表1に指定されたボリュームの割合でイオン水。
注：これらのソリューションは、大きなバッチで調製し、数ヶ月まで4℃で保存することができる。- 注意：アクリルアミドは特に、とき粉末状の、吸入または摂取時に有毒である：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすためにw / v溶液40パーセントを使用します。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（<23℃、換気の良い場所）に保管してください。
- 注意：ビス - アクリルアミドは特に、吸入または摂取時に有毒である、時粉末形態で：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすために2％w / v溶液を使用しています。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（<4℃、換気の良い場所）に保管してください。
- アクリルアミド（A）を混合することにより、ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を製造（w / vの40％、Mは、rは 71.08グラム/モル）、架橋剤ビスアクリルアミド（B）（2％w / vの、Mは、154.17グラム/モルrの ）、およびデ表1に指定されたボリュームの割合でイオン水。
- 調製およびN -Sulfosuccinimidyl -6-（4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートの使用アリコート（スルホSANPAHは、Mは、492.40グラム/モルrを）。注意：スルホSANPAHは深刻な眼刺激を引き起こす。手袋と適切な保護眼鏡または保護面を扱う。ストア受信時に-20℃で前分注する。
- スルホ - SANPAHを保存するには：50 mg / mlのでdimethylsulfoxane（DMSO）にスルホSANPAHを溶解する。チューブあたり20μlに50マイクロ遠心チューブにストック溶液を分注し。ドライアイス上または液体窒素中でフラッシュ凍結-80℃で、店舗（最大架橋剤効率を維持するために任意であるが好ましい工程）。
注：一定分量は、CAnは、数ヶ月間保存すること。 - スルホ - SANPAH使用するには：簡単にアリコートを解凍し、脱イオン水480μlの希釈する。すぐに使用してください。スルホSANPAHは水に迅速に加水分解する：ので、すぐに上記の手順をすべて実行するために注意を取る。
- スルホ - SANPAHを保存するには：50 mg / mlのでdimethylsulfoxane（DMSO）にスルホSANPAHを溶解する。チューブあたり20μlに50マイクロ遠心チューブにストック溶液を分注し。ドライアイス上または液体窒素中でフラッシュ凍結-80℃で、店舗（最大架橋剤効率を維持するために任意であるが好ましい工程）。
- 過硫酸アンモニウム（M rは 228.18グラム/モル）のアリコートを調製する。
注：過硫酸アンモニウムは、目、皮膚、呼吸器への刺激の原因となる。取り扱いの際に適切な個人保護具を着用する。化学ヒュームフードの過硫酸アンモニウム粉末を扱う。ドライ、風通しの良い場所に保管して粉末。分注した後、希釈溶液は、作業台の上に使用することができる。- w / vの10％の最終の硫酸アンモニウム濃度を達成するために、脱イオン水に過硫酸アンモニウムを溶解する。 -20℃で小分けし、保存。使用直前に解凍します。
- I型コラーゲン溶液の調製。
- そうストックを希釈することによって0.2 mg / mlのコラーゲン溶液を調製pH7.4での1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中リュー。簡単に氷の上に保管してくださいまたは希釈するとすぐに使用しています。
2.ハイドロゲル準備（図1を参照してください）
- 疎水性スライドガラスの調製。
- ガラス板上に疎水性溶液を数滴を置き、表面全体に広がってティッシュペーパーを使用しています。空気が乾燥してみましょうと疎水性コーティングを均等に再びティッシュペーパーで拭いてください。
注：RTで可燃性のキャビネットに保管して疎水性のソリューション。取り扱う際は保護具を着用。換気の良い場所で作業します。
- ガラス板上に疎水性溶液を数滴を置き、表面全体に広がってティッシュペーパーを使用しています。空気が乾燥してみましょうと疎水性コーティングを均等に再びティッシュペーパーで拭いてください。
- 可撓性プラスチック支持体の作製。
- 疎水性コーティングされたガラス板のサイズに合わせて柔軟なプラスチック支持体を切断した。
- 軽くそのような外科用メスなどの鋭利な工具で表面を引っ掻くことにより、柔軟なプラスチック支持体の疎水性側をマークします。
注： - 完全に透過的である - ゲル一度乾く、スクラッチマークは、柔軟なプラスチック製の支持体側がゲルを含む区別しやすくなります。
注：可撓性プラスチック支持体は、疎水性および親水性の側面を有する。蒸着後、ポリアクリルアミドは、恒久的に簡単に後続のヒドロゲルの取り扱いを容易にプラスチック支持体の親水性側に付着する。
- ゲルの調製（例えば容積5mlのゲル前駆体溶液のために与えられている）。
NOTE：ゲルの初期厚さが0.5mmである場合を5ml〜40のゲルを生成するのに十分であろう。ゲルの厚さを小さくすれば、よりゲルを製造することができる。- 50ミリリットルコニカルチューブに所望の最終濃度（ 表1）のポリアクリルアミド前駆体溶液の4972.5μLを置 きます。キャップで30分間脱ガスチャンバ内の場所を開け。
NOTE：酸素ラジカル捕捉剤として作用し、存在する、重合を阻害する。 - 過硫酸アンモニウムw / vの10パーセントの25μlを加え、最終的に達成するために（1.3を指すように参照してください。）0.05％の過硫酸アンモニウムの濃度。
- N、N、N '、N'-テトラメチルエチレンジアミンの2.5μl加え、0.5％の最終TEMED濃度を達成するために脱気したゲル溶液に（TEMED、Mは116.24グラム/モルをR）。
注：RTで可燃性のキャビネットに保管TEMED。適切な個人保護具を身に着けているときに、化学ドラフト内で取り扱ってください。それは非常に空気や水分に敏感であるように、しっかりと不活性ガス下で閉じておいてください。 - 5回 - ダウン3をピペッティングにより穏やかに溶液を混合する。ゲル前駆体溶液への酸素の拡散を回避するためにボルテックスしないでください。
- 疎水性コーティングされたスライドガラスを有する可撓性プラスチック支持体とサンドイッチの親水性側上にゲル溶液をピペット。所望の厚さ（ 例えば、0.5ミリメートル）のシリコーンスペーサーを2スライドを区切ります。ゲル化の指標として使用する50mlの円錐管中でポリマー前駆体溶液の少量（約100μl）を残す。
注意：任意のスペーサーを使用することができる。 120μmで - 例えば、パラフィルムの単一のストリップは、100の最後の膨潤ゲルの厚さを与えます。 - 重合時にさえヒドロゲル表面を確認するために柔軟なプラスチック支持体/ゲルサンドイッチの上に別のガラス板を置きます。
- 所望であれば、より少ない時間でより高い重量％のゲルのために使用することができるゲルを、45分間重合してみよう。ゲルが重合したことを確認するため、50ミリリットルコニカルチューブ中の残留溶液を観察する。残りの溶液がゲル化していれば、それはガラス板上にゲル化が同様に開始された可能性がある。しかし、金型の早期開口部が完全な重合を防止することに注意。
- ゲルが形成されると、上に共有結合したポリアクリルアミドゲルを有する可撓性プラスチック支持体から剥離し、空気乾燥ゲル側を上向きにして設定。
NOTE：対流または熱乾燥は、このステップを加速するためにも使用することができる。可撓性プラスチック支持体上に乾燥した後、ゲルをストアすることができ無期限dは。- ポリアクリルアミドゲルは、気泡のために形成されなかった柔軟なプラスチック支持体、のいずれかの裸のスポットをマークします。ゲルが乾燥したら、これは柔軟なプラスチック支持体に溶け込むようマークゲルはまだ水和されている間。
- 50ミリリットルコニカルチューブに所望の最終濃度（ 表1）のポリアクリルアミド前駆体溶液の4972.5μLを置 きます。キャップで30分間脱ガスチャンバ内の場所を開け。
3.マルチウェルプレートアセンブリ、コラーゲンコーティング、および滅菌
- マルチウェルプレートアセンブリ。
- 乾燥させた後、所望の形状にPAゲルをカット。
- 96ウェルプレートの場合は、〜6ミリメートルの直径を有する大型穴パンチを使用しています。正方形または長方形の形状にゲルをカットする大型ペーパーカッターを使用してください。代わりに、はさみを使用しています。
- 製造元の指示に従って、96ウェルプレート当たりPDMSの約500μlのを準備します。マルチウェルプレートの底にゲルを接着するために、各ウェルの中心にポリジメチルシロキサン（PDMS）の小滴（〜5μl）を配置します。鉗子を使用して、1つのポリアクリルアミドを配置ダウン各ウェル、可撓性プラスチック支持体側の電子ゲル。 PDMSを硬化できるようにするには、4時間の最小37℃で組み立てられたプレートを残す。
- 乾燥させた後、所望の形状にPAゲルをカット。
- ポリアクリルアミドゲルのコラーゲンコーティング。
- 転送ピペットを用いて、少量プレイス - スルホ - SANPAHの（7 8μl）をゲル表面に均一にコーティングするために左右によくスワールそれぞれに（1.2.2を指すように参照）。スルホ - SANPAHは水中で安定していないので、速やかに作業します。
- 5分間 - 高強度UVランプ（365nmの強度= 37ミリワット、λ= 302）の下でウェルプレートを置きます。過剰スルホ - SANPAHを除去してPBSでゲルを洗浄します。
- 0.2ミリグラムのピペットを50μl/ mlのI型コラーゲン溶液（1.4ポイントを参照）を各ウェルに。 4℃で少なくとも2時間またはO / N RTで覆われたプレートのままにしておきます。
NOTE：コラーゲンコーティングのプロセスをスピードアップするために、ピペットは、コラーゲン溶液を追加するために使用することができる。一般的に、1 - 溶液2滴が完了するのに十分であるべきであるLYゲル表面をカバーしています。 - コラーゲン結合を可能にするために、少なくとも2時間室温でウェルプレートにしておきます。
- 2時間、組織培養フード中の過剰コラーゲン溶液を除去し、UV（λ= 200 nm）の下で殺菌するためにPBSで洗浄すること。
- 水和平衡化するO / N（培地組成はセクション4.1を参照のこと）完全培地中でゲルを浸す。最大2日間すぐに播種細胞または冷蔵庫に店舗に使用します。
PA剛性アッセイ4.細胞播種
注：一般的な哺乳動物細胞株のための代表的なものの、ここで説明するプロトコルは、特に乳癌MDA-MB-231細胞株で使用される（ 図4及び図5を参照）。
- 37℃で5分間、5％トリプシン/ EDTAに暴露することにより組織培養フラスコから細胞を収集する。 〜培養フラスコ領域の各1cm 2当たりのトリプシン/ EDTA80μlのを使用します。例えば、トリプシン/ EDTA foの2 mlを使用RA T25細胞培養フラスコ。再懸濁所望の最終細胞濃度で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した完全培地中で回収された細胞である。細胞は、アッセイに播種される時間だけでなく、時間の長さを倍にアカウントセルに入れて、適切なサブコンフルエント細胞濃度を選択する。添加した培地を完全にヒドロゲルを沈めるのに十分であることを確認してください。
NOTE：ヒドロゲル培地で予め平衡化されているために十分であるべきで100μlの体積（3.2.6ステップを参照）。ゲルは前のステップでメディアで事前に平衡化されているので、マルチウェルプレートに使用される典型的なメディアのボリュームは十分なはずです。
注：このアッセイは、任意の付着依存性細胞型のために適切であろう。- 血球計を使用して、倒立顕微鏡下で細胞数をカウントする。負荷10の各血球計ポートに細胞懸濁液μlの少なくとも8象限から細胞数を平均化する。取得するため最終細胞濃度は、10 4細胞数を掛ける。
注：各血球計象限における細胞数が20である場合、最良の細胞計数結果が得られる - 50。
- 血球計を使用して、倒立顕微鏡下で細胞数をカウントする。負荷10の各血球計ポートに細胞懸濁液μlの少なくとも8象限から細胞数を平均化する。取得するため最終細胞濃度は、10 4細胞数を掛ける。
- 培養物を37℃で加湿インキュベーター中でPA剛性アッセイ上に細胞を、5％CO 2。 3日間 - すべての2メディアを変更します。 5分間37℃で5％トリプシン/ EDTAに暴露することによって、必要なときに、細胞を収集する。組織培養フラスコの1cm 2当たりのトリプシン/ EDTAの〜80μlのを使用してください。ヒドロゲルに触れるのではなく、わずかに横マルチウェルプレートを傾けると、各ウェルの側壁にピペットチップに触れることにより、吸引またはピペット媒体：全細胞操作工程の間に、ヒドロゲルの表面を破壊しないように特別な注意を払う。
注：標準的な組織培養処理時のヒドロゲルの表面を損傷しないように十分注意し除き、細胞は、それらが上に播種されたかのように剛性のアッセイは同じように操作することができる上に播種定期的なマルチウェルプレートに。
PA剛性アッセイ上に播種された細胞の5イメージング
- 直接PA剛性アッセイにおける画像セル。
注：すべての顕微鏡 - 倒立蛍光または共焦点顕微鏡は、細胞イメージングのために使用することができる。
NOTE：剛性アッセイを構築するために使用される可撓性プラスチック支持体は、完全に透明であり、autofluoresceまたは細胞画像化を妨害しない。しかし、可撓性プラスチック支持体自体が透明であっても、イメージング機能は対物レンズの作動距離によって制限される。柔軟なプラスチック支持体は、0.23ミリメートルの厚さを有し、10倍の対物レンズの典型的な作動距離が急激に高倍率のために減少〜4mmである。- 生細胞イメージングのための顕微鏡のプレートホルダー及び画像中の位置PA剛性アッセイ。 2時間の下でイメージングセッションを保持し、またはより長い撮影時刻のための環境室を備えた顕微鏡を使用しています。
- ときに生細胞イムエージングが目的ではない、0.1％の界面活性剤を補充した4％ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。 2時間の最小室温で固定液中で細胞を浸す。二回PBSですすぐ。指定された廃棄物容器内の固定液の廃棄物を捨てる。
注：細胞は、直ちに画像化することができる、または2週間まで4℃でPBS中に沈めて格納。注意：ホルムアルデヒドは吸入と接触した際に有毒である。化学ヒュームフード中で手袋を取り扱ってください。
注記：特定の固定剤は、いくつかの細胞タンパク質に損傷を与えるので、細胞の固定プロトコルは、その後の細胞染色および処理プロトコルに基づいて選択されなければならない。 - 蛍光イメージングのために、染色は、マルチウェルプレート中で直接所望の細胞染色で細胞を固定。画像をすぐに。
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Representative Results
ポリアクリルアミド（PA）ヒドロゲルは広く剛性依存性細胞応答を試験するために使用される。17,24アクリルアミド（A）とビスアクリルアミド（B）の種々の濃度を混合することにより、一つのほとんどの軟組織の剛性の範囲に及ぶPAゲルを作ることができるボディ- 0.3 -ここで300kPaのヤング率1が、ポリアクリルアミドゲルの調製が面倒であり、時間は、多くの場合、例えば薬物スクリーニングのために「ハイスループット」用途におけるその有用性を制限し、かかる12、簡単かつ迅速な方法が（ 図1）マルチウェルプレート中でPAゲルを組み立てまたは他の所望の組織培養容器が提供される。 図2Aは、（表1に要約）は、いくつかのAとBの濃度の関数としてのヤング率を示している。追加のA及びBの組み合わせの弾性率は、文献に報告されている。17,25,26完全swolleのゲル剛性10ヘルツ、及び2％の一定のひずみ - nはゲルは、上側平行ジオメトリ20ミリメートルとのレオロジー（ARの2000exレオメーター、TAインスツルメンツ）で振動周波数掃引試験1を測定した。予想通り、両方の貯蔵弾性率G '、損失弾性率G "は、周波数（ 図2B）とは無関係であることが実証された。また、乾燥した後、再水和ゲルは、それらのヤング率（ 図2C）に影響を与えないことを確認した。ヤング率は、以下の式での貯蔵弾性率に関連していた。 
ここで、Eはヤング率であり、vは、PAゲルを0.5に近似したポアソン比である。報告された値は、TEMEDを用いて調製したヒドロゲルのためのもの27留意。露光時間及びUV強度を最適化されているときにPAのヒドロゲルはまた、（UV架橋によって調製することができる
また、セルが異なるstiffneのヒドロゲルに播種することが示されたSSは異なる形態を示した。 72時間 - この実験では、乳癌MDA-MB-231細胞を、24 PAゲルの上に播種した。細胞を37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター内で10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI培地中で培養した。細胞を、1×10 5細胞/ mlの1×10 4細胞/ウェルで96ウェルプレート用で播種した。哺乳動物細胞株のための集密度が約1×10 5細胞/ cm 2に達したコンフルエントの細胞密度よりも4倍低い-これは典型的な細胞播種密度である。画像を、倒立蛍光顕微鏡で撮影し、形状記述子とエリアソフトウェアプラグインを介して、ImageJを分析した。これは、乳癌MDA-MB-231細胞は、ソフト0.5を1kPaゲル上で円形のままであるが、硬い100kPaのゲル（ 図4）上に広げ、細長くすることができた、24時間PAゲル上に播種したときことが観察された。 図4はまたshowcasエスヒドロゲルは、可撓性プラスチック支持体の上に作られているという事実は、透明であり、容易に可視化および顕微鏡検査を可能にする。また、柔軟なプラスチック支持体はautofluoresceせず、したがって、蛍光標識された細胞の画像化を妨害しない。円形（ 図5） -細胞の形態は、さらに、全体的な細胞拡散領域と細胞形状係数に関して定量した。セルの拡散領域は、各セルの境界をトレースするためにマスクを作成することによって測定した。セル形状（円形）は、以下の関係から算出した。 
1丸めセルを指定するために採取し、0 - - 0.5細長いセルを指定するために採取した0.6 1 - 真円0のスケールで測定される。少なくとも3つの独立した実験からの約300の細胞を各データPOINについて分析したトン。統計的な差は、データセットがp <0.05で有意差があると考えられた分散の単一因子分析（ANOVA）に基づいて計算した。
図1の可撓性プラスチック支持体上のポリアクリルアミドゲルの調製の概略図は図は、可撓性プラスチック支持体上のPAゲルの調製に関与する種々のステップを表す。ゲルが完全に乾燥した後、それは任意の所望の形状に切断または穿孔することができる。 96ウェルプレート用のゲルを調製する際に大型ペーパーカッターは、正方形または長方形の形状のために使用することができるが、全体パンチ（〜6mmの直径）は、最も便利である。図はまた、完成したウェルボトムカバレッジは、この方法で達成できることを実証するために、ゲルとすることなく両方のウェルのエッジを強調している。 OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
レオロジーによって測定されたPAの図2.剛性、ヒドロゲル。 （A）は、5つの異なるA＆Bの濃度（略語については表1を参照）のための代表的なヤング率;（B）は、周波数の関数としての貯蔵弾性率および損失弾性率レオロジーによって測定される;（C）ゲルは、最初は同じヤング率を示す（初期）そしてその後、それらは、ポリマー前駆体濃度とは無関係に（再水和）させ、再度水和されている。 （完全に膨潤時）1.5mmの高さ - レオロジー測定のためのすべてのゲルは、直径20mm及び1のスラブのように調製した。
/52643fig3.jpg "/>
PAゲルの図3コラーゲンコーティングコラーゲンコーティング（緑）が効率的に分布し、PAゲル（赤）ヒドロゲル剛性ヤング率の面に依存しない）に保持される。 Cy5で標識されたコラーゲンは、このデータのために使用した。赤色蛍光ビーズを可視化を補助するためにPAのヒドロゲルに包埋した。断面画像がZustiakらから適応共焦点顕微鏡（スケールバー=100μm）を。 画像上で撮影された。ら5 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
MDA-MB-231細胞の、図4の位相契約（上列）および蛍光（下の行）の画像は、24時間PAゲル上に播種した。MDA-MB-231細胞は、柔らかいゲル上のラウンド（ヤングとどまる 7; 0.5秒と1キロパスカルの弾性率）が、硬いPAゲル（100キロパスカルのヤング率）に細長い。細胞をエタノールで固定し、アクリジンオレンジ（AO - 緑）で染色し、24時間のゲル上に播種した細胞核を可視化するために細胞質及びDAPI（青色）を可視化する。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.細胞拡散面積と円形度は、下にある基板の剛性の影響を受けている。 （a）は、MDA-MB-231細胞の拡散領域は0.5kPaゲルとは対照的に、有意には100kPaに増加される。（b）の細胞円形度はPAゲル剛性の増加に伴って減少する。 p <0.05で、星印は、有意差を指定する。
図6に、可撓性プラスチック支持体上の代替ポリアクリルアミドゲル調製の概略図。図は、可撓性プラスチック支持体上のPAゲルの調製に関与する種々のステップを表す。ここでは、可撓性プラスチック支持体は、最初に、所望の形状およびサイズのプラスチック製「カバースリップ」に予め切断される。この手法は、ソフトなヒドロゲルに最適です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 頭字語 | アクリルアミド％ | ビス-アクリルアミド％ | 40％のストック溶液（溶液）からのアクリルアミド | 2％ストック溶液からビスアクリルアミド（ミリリットル） | 水（ml）を | SD±G '（キロパスカル） | SD±E（キロパスカル） |
| PA1 | 5 | 0.025 | 625 | 62.5 | 4312.5 | 0.62±0.19 | 1.85±0.57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55±0.12 | 10.64±0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 千 | 250 | 3750 | 9.71±0.64 | 29.14±1.93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 千 | 625 | 3375 | 22.00±2.10 | 66.01±6.31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1、500 | 625 | 2875 | 37.42±2.68 | 112.25±8.03 |
表ここでG 'およびEによって表されるアクリルアミド（A）と架橋剤ビスアクリルアミド（B）得られたPAゲル剛性。剛性の1の濃度 、レオロジーによって測定した。 G 'は、1Hzの周波数での貯蔵弾性率である。ヤング率、Eは、式から計算した。 1.標準偏差（SD）は、実験毎に測定試料3-5と3つの独立した実験に基づいて計算した。表中の略語は、 図2（a）に使用される頭字語に対応しています。
| UV強度= 15ミリワット/ cm 2程度 | 露光時間= 300秒 | ||
| 時間（s） | SD±E（キロパスカル） | でテンシティ出力（mW / cm 2）の | SD±E（キロパスカル） |
| 75 | 0.14±0.03 | 15 | 28.05±2.62 |
| 100 | 6.98±2.34 | 26 | 21.13±3.01 |
| 125 | 19.11±2.29 | 37 | 20.01±2.38 |
| 300 | 28.05±2.62 | 66 | 19.35±2.86 |
表2. UV重合は、代替とゲル化条件が最適化されているPAゲルを調製するための迅速な方法である。 PA3（表1参照）ゲルが描かれている。表には、（2つの列を左）露光時間やUV強度（右2列）のどちらかが同じ溶液のために変化させたとき、結果として得られるヤング率をまとめたもの。テーブルからの結果に基づいて、その300秒の露光時間を表示し、15ミリワット/ cm 2のUV強度を表1に報告したように、伝統的に重合したゲルの剛性に匹敵する最高PAゲル剛性を与える。
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Discussion
もともと電気泳動のために開発され、ポリアクリルアミドゲルは、28は、現在日常的に細胞の形態、運動性、および他の細胞特性のうち通信3,24,29上の基板の剛性の影響を研究するために細胞培養基質として使用される。ポリマー前駆体濃度の単純な変化- （300キロパスカル0.3）1（ 図2、表1も参照17,25,26参照 ）、ポリアクリルアミド、体内のすべての軟組織の剛性を包含するために、基板の剛性の操作を可能にする。 PAゲルを調製するために、かなり安価で簡単であるという事実に結合され、それらは、剛性依存性細胞性物質の相互作用の研究に不可欠なプラットフォームとなっている。にもかかわらず、簡単しかし、PAゲルを調製するための現在の技術は、小さなバッチに限定される。この制限は、過硫酸アンモニウムによって触媒されるフリーラジカル重合されたヒドロゲルのゲル化の性質に由来する反応は、フリーラジカル連鎖重合であるため、およびTEMED 30は、酸素などのフリーラジカル捕捉剤として機能する任意の要素によって阻害することができる。柔らかいゲルについて45分までかかる可能性 - - ポリマー溶液中への酸素の拡散が重合中に避けなければならないので、したがって、単に開いたマルチウェルプレートにPAゲルをピペットで実現可能ではない。また、2次元（2D）細胞基質として使用される、PAゲルの表面は平坦であるべきである。上記の要件の両方が2次元セル基板としてPAゲルを生成するためにそれを指示する、PAゲル前駆体溶液は、重合中に2つの平面の間に挟まれるべきである - 酸素の拡散を抑制し、ゲル表面を平坦化する。さらに、上面は、それが容易に細胞接着のための表面を露出させるゲルから剥がすことができるものとする必要がある。これは、典型的には、ガラス表面の疎水性コーティングによって達成される。番目に位置して最後に、マルチウェルプレートの電子ウェル、PAゲルをウエル表面全体をカバーする必要があり、フローティングを制限する。ボトムウェル完了表面被覆率は、細胞を評価するために使用されるアッセイが考慮よく（ 例えば、MTT）における全細胞集団をとるタイプである用途において特に重要である。 PAゲルを十分ウエル表面全体を覆っていない場合、注意は、細胞が容易にガラスまたはプラスチック上にゲルをロールオフができるように露出されたウェル表面への細胞接着をブロックするように注意しなければならない。必要に応じて、BSAブロッキングは、標準的なプロトコールに従って、オフシェルフBSAベースの細胞接着阻止キットウェルプレートの底への細胞接着を阻止するのに十分であるべきである使用。例えば、PBS中のBSAのBSAで覆われた表面を、0.5 mg / mlの溶液を調製し、pH7.4のPBSですすぎ、室温で20分間組織培養皿上に吸着させ、直ちに使用するか、または4℃で保存すべきである2週間まで。 BSAは、細胞接着oををブロックすることが示されている親水性と疎水性の両方のポリスチレン表面上のfの哺乳動物細胞培養原子間力顕微鏡によって測定されるように非常に細胞接着力を減少させることによって31 BSAは、哺乳動物細胞の接着を遮断するだけでなく、細胞のパターン化された表面を作成するために日常的に使用されている。32,33
この記事に示されている技術、を満たすカスタムサイズと形状の均一なPAゲルの大量生産を可能にする上記の要件のすべて。技法は、2つのカバーガラスの間にPAゲル前駆体溶液を挟んで現在の標準より簡単でより効率的である。さらに、すべての洗練された装置を必要としないため、簡単に任意の研究室によって採用可能である。それは高価なだけでなく、限られた大きさのものであるだけでなく、ガラス板またはガラスカバースリップの使用を必要としないように、また、よりコスト効果的である。技術は、いくつかの理由のためにも迅速である。まず、任意の前処理工程を必要としない永久アクリルアミドと容易にゲルを形成した後に剥離することができ、疎水性側に付着する親水性側 - 柔軟なプラスチック支持体は、二つの別個の表面を有するように設計されているので、ガラス表面の典型的な。プラスチック支持体が柔軟であるため、第二に、形成されたゲルを剥離し、簡単かつ迅速である：薄いゲルを2枚のスライドガラスの間に形成される場合、上部疎水性スライドを剥離することが困難であり、多くの場合、ゲルを損なう破損をもたらす。 45分（ 表2）を極力取ることができる標準TEMED系重合とは対照的に、最後に、なぜなら、可撓性プラスチック支持体の透明性を、より高速UV重合を採用することができる。 表2のデータは、重合時間及びUV光強度が最適化されている類似の剛性の両方TEMEDおよびUV重合法によって達成することができることを示している。
ヒドロゲルは、柔軟性のあるPL上に用意されているこれにより、ポリマー溶液を挟む2つの表面間の酸素拡散に対するゲルエッジ（ すなわち、エッジ効果）の不完全な重合を回避するために脱ガスチャンバ内でゲル化を行うことが推奨され、図1に示すように。asticサポート。目標は、このようにして、任意のサイズのガラス板が適切である可撓性プラスチック支持体の上部に大きなヒドロゲルフィルムを作成することであるが、それを達成することができるポリアクリルアミドフィルムの大きさが決まる。ガラスは、任意の疎水性コーティングで被覆することができ、または代替的に、可撓性プラスチック支持体の疎水性側を代わりに使用することができる。 PAゲルフィルムが形成されると、それは使用前に、乾燥させ、所望の形状に切断し、再度水和される。乾燥時に、ゲルは無期限に保存することができる。これは、PAゲル剛性ゲルを数ヶ月間（ 図2C）、乾燥状態で保存しても、再水和の際に変更されていないことを、レオロジーによって確認した。しかし、非常用のSOFトンゲル乾燥及び再水和（ヤング率≤1キロパスカル）の表面しわを悪化させ、亀裂形成。この動作は、幾何学的に拘束されながら、脱水和およびその後の再水和を受けるソフトゲルのが一般的である。34,35すべてではないのゲルのしわやクラック、したがって、それは視覚的に使用前にヒドロゲルを調べ、サンプルのみを使用することが可能であるそれは滑らかな表面を表示する。完全にしわの形成を回避し、クラッキングするために、ソフトハイドロゲルを調製するための代替方法は、 図6に示されている。ここでは、可撓性プラスチック支持体を所望の形状に事前に切断され、PAゲルが上部に形成され、従って、ゲルはない解除に水和されるが、準備として使用することができます必要があります。この代替戦略のさらなる利点は、〜2.5、よりゲルはヒドロゲル前駆体溶液（推定はプロトコルセクションに記載されているように、標準的な96ウェルプレートのためのゲルの準備に基づいて）同じ体積から製造することができることである。 One注意時このようにしてヒドロゲルを調製することは、特に小さなサイズのゲル（96ウェルプレート中で使用される、例えば、ゲル）のために、酸素の浸透を避けるために注意することである。ゲル前駆体溶液を完全に脱気した場合であっても、 すなわち、無酸素、酸素をPA溶液を挟む2つの表面の間に拡散される。したがって、エッジに沿ってエッジ効果または不完全なゲル形成を回避するためには、重合は、酸素の非存在下で起こることができるように最善である。我々の経験では、真空チャンバは、不活性ガス環境が等しく成功と共に使用することができるにもかかわらず、良好に機能する。
剛性依存性細胞応答を試験するために、細胞基質としてPAのヒドロゲルを調製する一つの最後の注意は、結果として得られるヒドロゲルの厚さが重要であることである。非常に薄いゲルについて、細胞は、下にある基板を感知することができる36理論と実験を使用して、 Lin らは 、細胞がfeのを缶における深度ことが実証されelは、下地基板は、セルの横方向寸法に依存する。29現在の研究は、数ミクロンから36最大60ミクロンであることが「隠れた」基板を感知から細胞を防止するために最低限必要な厚みを特定する、矛盾するので、 100μmの37最小ゲルの厚さが狙われるべきである。
マルチウェルプレートにPAゲルを組み立てる際に、PDMSの小滴がウェルの底にゲルを固定するために使用される。 PDMSは、それが硬化する際に、永久接着剤として機能するので、それは完全に透明であり、その後の顕微鏡実験を妨害しない選択された、それは完全に非細胞毒性であり、それは約4で硬化 - プレートアセンブリのための十分な時間を残して8時間。安全セル取り扱いもエイズの底にヒドロゲルを確保：しっかりと固定されていない場合など、積極的な洗浄がヒドロゲルを取り除くことができます。もしセルmの頻繁な変更EDIAその後、ゲルは、一時的にグリセリン等の非細胞毒性および高粘性液体の小滴によってウェル表面に固定することができる懸念ではない。
細胞播種前の最終段階は、ゲル、その後殺菌のECMコーティングを伴う。ここで、I型コラーゲンコーティングが同じ技術は、他のECMタンパク質に適用することができるにもかかわらず（ 図3）に示されている。二官能性架橋剤スルホ - SANPAHも単層被覆を達成するために利用される。以前の研究では、そのような共有結合は、単純なタンパク質吸着より均一なコーティングが得られ、また、単純に濃度を変化させたタンパク質溶液を用いて、添付されたタンパク質の量の12倍のチューニングを可能にすることを示した。6最後に、組み立てられたマルチウェルゲ ルプレートを最大2時間、組織培養フード内でUV下で殺菌する。アッセイはボンネット、外の実験台に組み立てられるようにするための紫外線滅菌が可能にするプロセスはロジスティック簡単で、全体的に速くなります。
4及び5は 、剛性を変化させる柔軟なプラスチック支持体付きPAゲル上で培養したMDA-MB-231乳癌細胞からのいくつかの代表的な結果を示している。彼らはそれらの形態における測定可能な変化により、下地基板の剛性に反応することが示されているため、MDA-MB-231細胞を、方法の有用性を実証するために選択された。5,12予想されるように、細胞がより細長くたと拡大拡散領域を有していたソフト0.5を1kPa PAゲルに比べて硬い100kPaのPAゲル（ 図4および5）。図4の一番下の行には、可撓性プラスチック支持体は、蛍光顕微鏡イメージングと干渉しないという事実を展示、細胞核と細胞質を染色する二つの蛍光色素の使用を示す。
要約すると、簡単な方法でポリアクリルアミドハイドロゲルを調製するマルチウェルプレートフォーマットで提示される。技術がより速く、より効率的、かつセル基板ならびに他の方法では入手できないカスタムサイズのゲルの調製を可能にするように使用されるPAゲルを調製するための現在の方法よりも安価である。それは、任意の特別な装置を必要としないように、この方法は簡単に研究室に採用される可能性があり、剛性依存性細胞応答を理解することに焦点を当てた研究に特に有用であろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
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