Summary
Протоколы описаны для изучения миграции клеток рака молочной железы, пролиферации и колонизации в костной ткани системе эксплантов модели человека.
Abstract
Кость является наиболее распространенным сайт метастазов рака молочной железы. Хотя широко признается, что поведение рака микроокружение влияет клеток, мало что известно о свойствах клеток рака молочной железы и поведения внутри родной микроокружения костной ткани человека. Мы разработали подходы для отслеживания, количественной оценки и модулируют человека клеток рака молочной железы в микросреде культурные фрагменты костной ткани человека, выделенные из выброшенных головки бедра после тотальной операции по замене тазобедренного сустава. Использование клеток рака молочной железы разработаны для люциферазы и усовершенствованные зеленый флуоресцентный белок (EGFP) выражение, мы можем воспроизводимо количественно миграции и пролиферации моделей с использованием изображений биолюминесценции (BLI), отслеживать клеточные взаимодействия в костных фрагментов с помощью флуоресцентной микроскопии и оценки клетки груди после колонизация проточной цитометрии. Основные преимущества этой модели включают в себя: 1) родной, архитектурно неповрежденной ткани microenvironment который включает в себя соответствующие виды клеток человека, и 2) прямой доступ к микросреде, что облегчает быстрый количественный и качественный мониторинг и возмущение молочной железы и костных клеток свойств, поведения и взаимодействия. Основным ограничением, в настоящее время, является конечным жизнеспособность фрагментов ткани, которая ограничивает окно исследования в краткосрочной культуры. Применение модели системы включают в себя изучение фундаментальной биологии рака молочной железы и других злокачественных опухолей костей, ищущих в метастатической ниши, а также разработка терапевтических стратегий для создания более эффективных адресных клеток рака молочной железы в костной ткани.
Introduction
Микросреда опухоли широко признается одним из важнейших факторов поведения раковых клеток во время прогрессирования рака молочной железы и метастазов 1-3. Цель метода, представленного здесь, чтобы облегчить изучение клеток рака молочной железы в микросреде человек костной ткани, наиболее частым местом рака молочной железы метастаз 4-6. Кость состоит из минерализованных и мозга отсеков 7-9, оба из которых укрывают клетки и секретируемые факторов, обуславливающих метастатического прогрессирования 10,11. Хотя широко используется в естественных условиях мышиных моделях облегчить системные исследования метастатического процесса 12-15, сотовые взаимодействия в скелете не легко доступны для наблюдения и прямого возмущения. Модельные системы для изучения и культивирования мыши костной ткани и клетки мыши мозга обеспечения лучшего доступа и дали много интересных идей относительно перекрестных помех и механизмы, лежащие в основе раковых клеток молочной железы мetastasis мышиного скелета 16-22. Тем не менее, исследования показали, что там может быть видоспецифичные модели osteotropism для костной ткани 23,24. Эти модели могут отражать присущие конкретным видам различия в свойствах костной ткани, различия, вытекающие из измененных населения костного мозга в иммунном-дефицитных мышей 11, и / или относительно молодой возраст мышей, используемых в экспериментах, все из которых, вероятно, детерминанты кости микросреда.
В пробирке подходы для изучения клеток рака молочной железы в кости человека сокультурах, как правило, сосредоточены на конкретных типов костных клеток, таких как мозга, полученных остеобластов или стромальных клеток, культивируемых в виде монослоев или внутри инженерных 3-мерной модели систем 25-35. Хотя модели 2-мерных клеток культуры сформировали оплот в пробирке подходы для исследования рака, она уже давно признано, что поведение клеток в корне изменило в мonolayer культуры систем 18,36,37. Это привело к разработке инженерных микросреды, которые имитируют сложность 3-мерных живых тканей, в том числе и матричным моделей лесов на основе составленных из натуральных материалов, таких как коллаген или синтетические полимеры высевают с определенными типами клеток, чтобы создать подобные ткани микросреды 36-41. Инженерные подходы были также включали в себя использование биореактора платформ для управления и изучения гормональной среды микроокружения 18,19,41-43. Хотя биомиметические модели и биореакторы обеспечивают многие элементы сложной ткани микросреды в контролируемых условиях, и успешно применяется для дальнейшего изучения рака молочной железы метастазы в кости 18,19,35,42,43, инженерные системы модели обычно не включают Полный спектр типов клеток и компонентов внеклеточного матрикса, присутствующих в природном окружении кости.
До недавнего времени, рак молочной железыклетки не были изучены в родном, неповрежденной, 3-мерной микроокружения тканей кости человека. Мы недавно сообщили о разработке модели сокультуры с использованием человеческих фрагментов ткани костей, выделенных из тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (THR) хирургии образцов 44. Эти образцы гавани и минерализованных и мозга отсеков, необходимые для изучения механизмов, лежащих в основе микро-метастазы в короткий срок культуры. В предыдущей работе мы установили чек, подтверждающий принципе для использования биолюминесценции томография (BLI), чтобы следить за распространением люциферазы выражения раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231-fLuc) совместно культивировали с костными фрагментами 44. Здесь мы представляем подробные экспериментальные протоколы для изучения распространения клеток молочной железы рак, колонизации и миграции в контексте родного микросреды, используя ткани эксплантов человеческой кости.
Сначала мы приводим протокол для совместного культивирования клеток рака молочной железы, прилегающих к костных фрагментов для измерения грудьпролиферации клеток с использованием BLI. В этом разделе, молочной суспензии клеток высевают в клеточных мест в 6-луночных планшетах, прилегающих к костных фрагментов, которые иммобилизованных на куски кости воска. Контрольные лунки содержат костный воск, но не костного фрагмента. После того, как сотовые пятна прикрепить, добавляли среду и пластины культивируют в течение 24 ч, после чего интенсивность биолюминесцентного сигнала (связанный с числом клеток) измеряется с ОУИ. В следующем шаге мы представляем методы для совместного культивирования клеток рака молочной железы, посеянных прямо на костных фрагментов для изучения колонизации и распространения. Здесь молочной клеточные суспензии пипеткой непосредственно на фрагменты тканей костей, которые контролируются в культуре BLI и флуоресцентной микроскопии с течением времени для отслеживания колонизации и количество клеток. В этом способе костный мозг отсека может быть промыта от костных фрагментов в любой момент времени для анализа колонизировали клеток рака молочной железы с помощью проточной цитометрии, или жизнеспособности мозга анализы.
Кроме того, мы деписец два различных подхода для измерения миграции клеток рака молочной железы. В первом способе шаги описаны для измерения миграции к костной ткани культуральных супернатантах. В этом протоколе клеток рака молочной железы высевают на внутреннюю, верхние поверхности Transwell вставки мембраны с размером пор 8 мкм (как показано на фиг.1А). Вставки затем помещают в приемник пластины с лунки, содержащие ткани супернатант кости или контрольной среде. В течение периода инкубации 20 ч, небольшое количество раковых клеток молочной железы мигрируют через вставку мембраны в нижнюю тканевых культур скважин, где они прикрепляются для обнаружения по BLI. Во втором способе миграции клеток рака молочной железы высевают на нижних, наружных поверхностей Transwell вставки мембран. Фрагменты костной ткани помещаются во вставку чашек и клетки рака молочной железы мигрируют через мембраны колонизировать костных фрагментов (как показано на рисунке 1б), чтоЗатем отображаемого использованием BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Головок бедренных костей были собраны из пациентов выборные THR операции в отделения ортопедической хирургии в Стэнфордском университете в Школе медицины. Все ткани были собраны в обезличенной образцов в соответствии с правилами Управления Стэнфордского университета научно-исследовательского соблюдению.
1. Выбор рака молочной железы клеточная линия (линии)
- Получить или трансфекции нужную линию (ы) клеток рака молочной железы с люциферазы-GFP репортер конструкции. Следующие эксперименты были выполнены с использованием MDA-MB-231 и MCF-7 линий рака молочной железы клеточные разработан для стабильной экспрессии люциферазы светляков (fLuc) и усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) с помощью трансфекции с Спящая красавица транспозонов плазмиды pKT2 / LuBiG и транспозаза плазмиды PK / hUbiC-SB11 45,46.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфицированные клеточные линии именуются MDA-MB-231-fLuc-EGFP и MCF-7-fLuc-EGFP.
2. Изоляция тканей Fragments из головок бедренных костей
- После операции THR, собирать отбрасываются головки бедренной кости в стерильный контейнер, заполненный физиологическим раствором. Передача образца в лабораторию и обработать его в течение 1-3 часов операции. Примечание: если есть задержка в обработке, поместите образец на 4 ° C.
- Подготовьте рабочую область, поместив следующие пункты на фильтровальную мат в ламинарного потока капот культуры ткани: стерильные перчатки, хирургические костные кусачки, пинцеты, стакан с 70% изопропилового спирта, чтобы промыть инструменты и культуры тканей сосудов, как это предусмотрено ниже для каждого типа эксперимента ,
- Ношение стерильные хирургические перчатки, чтобы держать круглую бедренной голову в одной руке, с помощью костными кусачками, с другой стороны, чтобы извлечь Трабекулярные костных фрагментов желаемого размера (~ 2-5 мм) от открытой верхней бедренной кости. Передача костных фрагментов в культуральный сосуд (например, 6-, 12- или 24-луночный планшет для тканевых культур или миграции камеры), в зависимости от типа пролиферации, столбецonization или миграции эксперимент, как описано в шагах 3, 4 или 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: фрагменты костной ткани должны быть собраны, как описано выше, после завершения первые шаги для каждого конкретного оружия, колонизации или анализа миграции. Фрагменты будет варьироваться в размерах, как показано на фиг.2. Фрагменты могут быть взвешены до и после экспериментов с целью стандартизации.
3. Совместное культивирование клеток рака молочной железы, прилегающих к отломков измерить груди клеточной пролиферации, используя BLI
- Перед экспериментом, приготовить суспензию, содержащую 2 х 10 5 клеток рака молочной железы / 50 мкл, и подготовить втулки костного воска для иммобилизации костных фрагментов в культуре. Вырезать наконечник P200 микропипетки на 3 части и использовать узкий конец крупнейшей части в "резака" таким образом, чтобы сократить мала (~ 35 мг) штук костного воска. Используйте широкий конец маленького куска, чтобы извлечь кости восковые пробки в чашку Петридля хранения.
- Место кусок кости воска в положении 12:00 в каждую лунку и осторожно надавите с помощью стерильного перчатке указательным пальцем.
- Пипетка 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 × 10 5 клеток рака молочной железы в среде DMEM-10% FBS + ручка-Strep в центре каждую лунку 6-луночного планшета. (В качестве альтернативы, затравочные клеток в диспергированном шаблона, если это необходимо.) Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе тканевых культур в течение 45 мин, чтобы способствовать прикрепление клеток.
- Поместите фрагмент 1 кости на 1 кусок кости воск для каждой экспериментальной скважины и применить мягкое давление с костными кусачками, чтобы закрепить его. Выполните эксперименты в трех экземплярах, таких, что 3 кости фрагменты из данного образца THR размещены в тройку скважин, в то время как нижние три скважины содержат кости воск только в качестве контроля.
- Использование 5 мл пипетку, медленно и осторожно поставить 5 мл DMEM,-10% FBS в сторону каждую лунку, чтобы избежать выбивании клетки молочной железы или костных фрагментов. Поместите пластину в 3776; C культуре ткани инкубатор для 20-24 часов.
- Для выполнения визуализации биолюминесценции (БЛИ) удалить пластину из инкубатора и добавить люциферин подложки (для достижения концентрации 300 мкг / мл) в каждую лунку. Изображение пластины сразу на IVIS изображениями платформы, используя следующие параметры: F-стоп от 1, мелкий биннинговые, время экспозиции 1 сек, уровень D. Мера интенсивности сигнала каждого также среднюю сияние (фотонов / сек / квадратный сантиметр / стер).
- Использование программного обеспечения визуализации определить области интереса (ROI) для количественного определения средней сияние для всех экспериментальных и контрольных скважин. Экспорт средние значения яркости с листе Excel для выполнения статистических данных и создавать графики.
4. Совместное культивирование клеток рака молочной железы, посеянных прямо на фрагменты костей для изучения колонизации и количество клеток
- Использование щипцов для размещения костных фрагментов непосредственно в пустые лунки тканевого культурального планшета 24-а (1 фрагмент / лунку).
- ПипEtte 50 мкл суспензии клеток капли DMEM-10% FBS, содержащей 1 × 10 3-6 клеток рака молочной железы непосредственно на верхней части каждого костного фрагмента. Место пластины в 37 ° С тканевой культуры инкубаторе в течение 45 мин, чтобы способствовать прикрепление клеток. Осторожно добавляют 1-2 мл DMEM,-10% FBS в сторону каждую лунку так, чтобы фрагмент полностью погружен в среду. Инкубируют планшет в 37 ° С тканевой культуры инкубаторе в течение 20-24 ч.
- После инкубации использовать щипцы для передачи каждого фрагмента костной ткани в свежую 24-луночного планшета, содержащего 1 мл DMEM-10% FBS в каждую лунку. Для выполнения BLI, выполните шаги 3,6-3,7 выше. Кроме того, фрагменты можно просматривать с помощью флуоресцентного микроскопа или промыть, чтобы получить популяцию мозга для анализа количества клеток рака молочной железы и свойств, как описано в пункте 6.
- Для получения нетронутыми фрагменты для качественной оценки с помощью флуоресцентной микроскопии после BLI, пипетки 5 мкл флуоресцентного решения бифосфонат маркировки (PREсравнению соответствии с инструкциями производителя) в каждую лунку, чтобы пометить минерализованных спикул костных фрагментов. Инкубируют планшет в инкубаторе тканевых культур в течение еще 24 ч.
- После 24 ч культуры в флуоресцентного мечения раствора бисфосфонат, использовать щипцы для передачи фрагментов с тканевой культуры пластины, содержащие фенолового красного среде и вид с помощью флуоресцентного микроскопа, выполненный с возможностью GFP изображения (485 нм) и бисфосфонатов этикетки (680 нм).
5. Измерение миграции клеток рака молочной железы костной ткани фрагментов и культурной фрагмент кости супернатантах
- Миграция к костной ткани культурального супернатанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эксперименты в трех экземплярах, таких, что 3 фрагменты из данного образца THR используются для создания 3 супернатантами. Для каждого эксперимента, миграция по сравнению через три лунки, содержащие кости супернатантами vs. три лунки, содержащие только контрольной среде.- Создание костей ТИСв суд супернатантов путем размещения костных фрагментов в лунки 12-луночного планшета, содержащего 2,2 мл DMEM,-10% FBS на лунку. Культура в С тканевой культуры инкубатор 37 ° С в течение 24 ч. Вывод среды при 24 ч и заменить 2,2 мл свежей DMEM-10% FBS. Лечить контрольные лунки, содержащие DMEM-10% FBS таким же образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: среда изменилась на 24 ч, чтобы устранить факторы, секретируемые в ответ на травмы ткани в результате операции. Потому что костная ткань надосадочные генерируются в FBS среде, содержащей, лунки, содержащие FBS-среде, содержащей только включены для контроля вкладов FBS миграции раковых клеток молочной железы. - В 48 ч, собирать 0,9 мл каждого супернатанта / контрольной среде и пипетки в лунки ствольной коробки. Вставки в дальнейшем будут помещены в этих скважинах. Выдержите ствольной коробки в культуре ткани инкубаторе в то время как посев вставки. Примечание: оставшиеся супернатант (~ 1 мл после испарения) могут быть собраны для анализа secretome-фактоRS при желании 44.
- Для семян вставки Transwell, поместите их в стандарт, пустой 24-луночного планшета для культуры. Пипетка 350 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 × 10 5 клеток рака молочной железы в DMEM,-10% FBS на верхней, внутренней поверхности мембраны каждой вставки, как показано на фиг.1А. Поместите 24-луночный планшет, содержащий затравочный вставки в 37 ° C инкубаторе тканевых культур в течение 45 мин, чтобы способствовать вложение.
- После того, как клетки прикреплены к вставкам, использовать щипцы для передачи вставки в приемник пластины в соответствии с инструкциями изготовителя. Угол каждая вставка при размещении его в приемник и для предотвращения образования пузырей между мембраной вставки и приемником и надосадочной. Инкубируйте приемника пластины с вставок в течение 20 часов в 37 ° C инкубаторе тканевых культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте нижнюю сторону ствольной коробки пузырьков между мембраной вставки и приемником хорошо supernatanт. Если видны пузырьки, снимите конкретные вставки и поместите их снова в трубку хорошо, пока никаких пузырей нет. - После 20 Использование ч щипцов для удаления вставки из ствольной коробки. Использование процедуры в шагах 3,6-3,7 выполнять BLI к изображению клетки, которые мигрировали в и прикрепленные к нижней части ствольной коробки скважин.
- Создание костей ТИСв суд супернатантов путем размещения костных фрагментов в лунки 12-луночного планшета, содержащего 2,2 мл DMEM,-10% FBS на лунку. Культура в С тканевой культуры инкубатор 37 ° С в течение 24 ч. Вывод среды при 24 ч и заменить 2,2 мл свежей DMEM-10% FBS. Лечить контрольные лунки, содержащие DMEM-10% FBS таким же образом.
- Миграция к фрагментов костной ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эксперименты в трех экземплярах, таких, что 3 фрагменты из данного образца THR помещают в 3 отдельных вставок и 3 стеклянные бусины помещают в 3 отдельных вставок в качестве контроля.- Подготовка приемника пластину с помощью пипетки 0,9 мл DMEM,-10% FBS в каждую лунку. Поместите его в культуре ткани инкубаторе при подготовке вставки.
- Потомству вставки, инвертировать их на поверхности пластиковой коробке пробирке, который имеет крышку. Внесите 50 мкл суспензии клеток капельку DMEM-10% FBS, содержащей 1 х 10 5 клеток рака молочной железы Directly на внешнюю, нижней поверхности каждой пластины мембраны (которая обращена на инвертированных вставок). Обложка трубка коробка микрофужную с крышкой приоткрылась и перенести его на 37 ° C ткани инкубаторе в течение 45 мин для содействия прикрепление клеток.
- Передача окно пробирке в капот культуры ткани, и использовать пинцет, чтобы превратить сеяных вставки правая сторона и перенести их в лунки ствольной коробки. Внесите 0,450 мл DMEM-10% FBS в каждой вставки чашки. Использование щипцов, переносить один костной ткани фрагмент (~ 3 мм) в каждую подготовленную чашку вставки. Возможно, использовать стеклянные бусины в качестве отрицательного контроля в дополнительные скважины. Поместите пластину в инкубаторе тканевых культур в течение 20 часов.
- Для измерения миграции, подготовить стандартный планшет для тканевых культур 24-а, содержащего 1 мл DMEM,-10% FBS на лунку. Удалить приемника пластины из инкубатора и использовать щипцы для передачи костных фрагментов и шарики друг от вставки в отдельные лунки стандартной пластины. Добавить люциферинПодложка (для достижения конечной концентрации 300 мкг / мл) в каждую лунку и выполнять BLI использованием процедур, описанных в шагах 3,6-3,7.
6. Дополнительные до и после эксперимента Анализ
- Анализ покрасневшее мозга.
- Передача костного фрагмента в сито 70 мкм клетки размещены в верхней части в 50 мл коническую пробирку. Использование 10 мл шприц с иглой 25 G энергично промыть фрагмент с 10 мл PBS с получением суспензии клеток костного мозга в коническую пробирку. Центрифуга клеточной суспензии в течение 3 мин при 300 х г и 21 ° С, аспирата супернатант и ресуспендируют осажденные клетки в PBS или другой желаемой решение для проточной цитометрии.
Примечание: объем ресуспендирования будет варьироваться в зависимости от размера клеточного осадка после центрифугирования, и применения. - На жизнеспособность анализов ~ 75-300 объемы мкл PBS подходят, и эти суспензии могут быть проанализированы с использованием коммерчески доступного fluorescencе жизнеспособности анализы, основанные в соответствии с инструкциями производителя, с помощью пипетки в обычном гемоцитометра, и подсчитывают с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа.
- Для анализа проточной цитометрии или сортировки на основе обнаружения GFP-положительных клеток рака молочной железы, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл PBS, содержащего 2% FBS, 2 мМ ЭДТА, и 10 мМ HEPES таким образом, что концентрация 1 × 10 6 клеток / мл.
- Передача костного фрагмента в сито 70 мкм клетки размещены в верхней части в 50 мл коническую пробирку. Использование 10 мл шприц с иглой 25 G энергично промыть фрагмент с 10 мл PBS с получением суспензии клеток костного мозга в коническую пробирку. Центрифуга клеточной суспензии в течение 3 мин при 300 х г и 21 ° С, аспирата супернатант и ресуспендируют осажденные клетки в PBS или другой желаемой решение для проточной цитометрии.
- H & E окрашивания и иммуногистохимического исследования.
- Для обработки фрагментов для гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием и / или иммуногистохимии, поместите фрагменты в пластиковых кассет меченных карандаш номер 2, и погрузите в емкость, заполненную 10% формалине с буфером в течение 24 часов.
- Процесс тканей для парафин, секционирования и окрашивания с использованием обычных протоколов, которые включают в себя шаг декальцинации для учета минерализованных спикул в пределах каждого фрагмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция Tissue фрагментов из головок бедренных костей
Головок бедренных костей были собраны из равного числа мужчин и у женщин (44-90 лет), перенесших плановое общее операцию эндопротезирования тазобедренного в отделения ортопедической хирургии в Стэнфордском университете в Школе медицины. Каждый отбрасываются головки бедренной кости, содержит небольшую часть верхней бедренной кости, который таит в трабекулярной костной ткани, состоящий из минерализованных игл и мозга. Эта ткань доступна через хирургическим подвергается сечении вала (фиг.2А) с помощью хирургического костными кусачками, чтобы извлечь небольшие фрагменты. Гистология извлеченных штук показано на рисунке 2B, показывая минерализованных и мозга компоненты. Появление извлеченных частей варьируется в зависимости от головки бедра, полученных из различных пациентов, в пределах от желтого до красного, в зависимости от содержания адипоцитов в костном мозге, как показано на фиг.2С. Wе продемонстрировать использование этих фрагментов костной ткани в короткий срок анализах для измерения динамических взаимодействий с клетками рака молочной железы разработаны для люциферазы и выражения EGFP.
Совместное культивирование клеток рака молочной железы, прилегающих к отломков измерить груди клеточной пролиферации с помощью биолюминесценции визуализации
Установка культуры пластина для совместного культивирования MDA-MB-231-fLuc-EGFP клеток рака молочной железы, прилегающих к иммобилизованных костных фрагментов для измерения пролиферации клеток молочной железы с использованием BLI показано на фиг.3А. БЛИ пластины на 24 ч показано на фиг.3В, и сигнал БЛИ от 3 экспериментов, демонстрирует повышенную пролиферацию клеток в присутствии против отсутствие костных фрагментов показано на фиг.3С.
Совместное культивирование клеток рака молочной железы, посеянных прямо на фрагменты костей для изучения колонизации и количество клеток
Колонизация MCF-7-fLuc-EGFP слоктей высевают непосредственно на фрагменты костной ткани, измеренная с помощью BLI в 24 ч показана на рисунке 4A, демонстрируя снизился сигнал, связанный со снижением плотности посева. Непосредственно семенами фрагмент показан на 48 ч на фиг.4В, после мечения флуоресцентным biphosophonate реагента, как изображается с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы показать колонизацию клеток рака молочной железы в минерализованных и мозга отсеков. Эти модели колонизации также показал, непосредственно односемянных фрагментов обрабатываемых после экспериментально для иммуногистохимического окрашивания цитокератин антител (рис 4C и 4D).
Измерение миграции клеток рака молочной железы костной ткани фрагментов и культурной фрагмент кости супернатантах
Миграция MDA-231-fLuc-EGFP клеток через пористые миграции мембран по отношению к костной ткани супернатантов культуры и в костных фрагментов обнаружены с BLI, как показано на рисунке 5. надежная модель миграции к культуре супернатантов, полученных из трех фрагментов данного THR образца показано на рисунке 5А, на котором изображены повышенной миграции в лунках, содержащих тканей супернатант кости по сравнению с контролем среды. Хотя не все причины миграции, как это прочный, миграция в сторону кости супернатантами, как правило, больше, чем к контрольной среде в большинстве экспериментов. Типичный характер миграции в костных фрагментов из заданного THR образца показано на фиг.5В.
Анализ Окрыленный кабачки
Кроме того, мы показывают, что клетки костного мозга могут быть сброшены из колонизировали фрагментов, и что промыть клетки рака молочной железы могут быть обнаружены среди этих клеток с помощью проточной цитометрии (фиг.6В), БЛИ (фиг 6C), и / или флуоресцентной микроскопии (рис 6D) ,
Измерение Жизнеспособность
Рисунок 1: Настройка миграции экспериментов. () В "вперед миграции" экспериментов, приемник планшетов заполнены ранее созданных костной ткани супернатантах культуры. Клетки рака груди, которые высевали на внутренних, верхних поверхностей Transwell мембран в чашках, содержащих вставки DME-10% FBS мигрируют через мембраны и прикрепить к нижней части лунки для детектирования ОУИ. 
Рисунок 2: Изоляция фрагментов ткани из головки бедра. () Извлечение фрагменты губчатой кости с помощью хирургического костными кусачками. (B) Гистология фрагмента фиксированной сразу после извлечения из бедренной ткани, показывая минерализованных (белая стрелка) и мозга (черная стрелка) отсеков. (C) Трабекулярные костные фрагменты извлечены из двух разных головок бедренных костей, демонстрирующие изменение в красном против содержания желтый костный мозг. 
Рисунок 3: Совместное культивирование клеток рака молочной железы, прилегающие к костных фрагментов для измерения распространения клеток молочной железы с использованием изображений биолюминесценции. (А) Культура установки пластины для совместного культивирования MDA-MB-231-fLuc-EGFP клеток рака молочной железы, прилегающих к иммобилизованных костных фрагментов, как показано стрелками: клеточных пятен (синий), костного воска (черный), и костного фрагмента (красный ). Положение костного воска также отметить, черной пунктирной окружности. Пластина показано перед добавлением среды. Верхние 3 скважины содержит костных фрагментов привязаны к воска кости и трех нижних скважин содержат только костного воска. (B) BLI пластины на 24 ч. (С) Количественное определение сигналов БЛИ для MDA-MB-231-fLuc-EGFP клетки росту в присутствии (фиолетовый бары) в зависимости от отсутствия (зеленые полосы) Фрагментов из трех THR образцов культивировали, как описано. Для каждого THR образца, бары представляют собой средние значения BLI измеренные через 3 фрагментов, содержащих - против 3 контрольных скважин. Этот результат демонстрирует более высокие уровни пролиферации в присутствии против отсутствие костных фрагментов. Усы представляют стандартную ошибку (р <0,01). Воспроизводится с разрешения 44. 
Рисунок 4: Обнаружение клеток рака молочной железы, посеянных прямо на костных фрагментов. () Колонизация MCF-7-fLuc-EGFP клеток, посеянных прямо на фрагменты костной ткани, как обнаруживается BLI в 24 ч, показывая снизился сигнал, связанный со снижением плотности посева. (B) непосредственно семенами фрагмент на 48 ч после посева, и 24 часов после маркировки с люминесцентными biphosophonate реагента. Флуоресцентная микроскопия показывает, EGFP + клеток рака молочной железы, каксопряженной с минерализованной спикулы (зеленая стрелка), а также с жировых клеток в купе мозга (белые стрелки). Эти модели колонизации также показал, непосредственно односемянных фрагментов, обработанных для иммуногистохимического окрашивания с пан-цитокератин антитела AE1 / AE3 следующей 72 ч сокультуры (С) и (D). В (С) цитокератиновых-положительных клеток рака молочной железы, обозначенных стрелками, наблюдаются вблизи адипоцитов в отсеке мозга. В (D), клеток рака молочной железы цитокератин-положительных наблюдаемую прикреплен к минерализованной спикулы. (С) и (D) воспроизводятся с разрешением 44. 
Рис. 5: Измерение миграцию клеток рака молочной железы с костными фрагментами ткани и культивированных супернатантов костного фрагмента Миграция MDA-MB-231-fLuc-EGFP клетки через пористые миграции мембран по отношению к костной ткани супернатантов культуры и в костных фрагментах, как, выявленных при 24 ч с BLI. (A) BLI сигнал Выявление усиливается миграция к культуре супернатантов, полученных из данного THR образца по сравнению с контрольной среде. (B ) BLI сигнал демонстрируя характер миграции клеток рака молочной железы в 3 фрагменты костей из одного образца THR. Фрагменты костной ткани обозначаются белыми пунктирными кругами. Контрольные лунки, содержащие стеклянные шарики показаны на дне. 
Рисунок 6:.. Обнаружение MDA-MB-231fLUC-EGFP клеток в кабачков вымываются из колонизированных фрагментов (А) Фрагменты без (слева) и с (справа) колонизировали раковые клетки молочной железы, как обнаруживается BLI (B) Анализ кабачков покраснел из фрагментов (А) на Fнизкий цитометрии. EGFP-положительные клетки рака молочной железы были обнаружены в мозге удаляется из БЛИ-положительного фрагмента, но не БЛИ-отрицательных фрагмент. (С) БЛИ обнаружение колоний клеток рака молочной железы в результате культуры костного мозга вымывали из более БЛИ-положительного фрагмента. (D), люминесцентной микроскопии отсека мозга вымывали из более BLI-положительных фрагмента, показывающий MDA-MB-231fLUC-EFGP клетки в области клеток костного мозга. 
Рис. 7: Измерение жизнеспособности Viabilities для клеток костного мозга вымывали из фрагментов, выделенных из тканей 4 THR образцов непосредственно после сбора и в 24, 48, 72 ч и 6 дней в культуре DMEM-10% FBS. Среду заменяли на 24 и 72 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мехра и др. Ранее описано сбор и анализ образцов костных посмертных от пациентов с метастатическим раком простаты, собранных во время вскрытия, показывая высокие ткани качества и проверки использования образцов кости человека для изучения метастатического процесса 47. Здесь мы описали протоколы для сбора, обработки и использования человеческих фрагментов ткани костей, полученные из выброшенных головки бедра следующих THR хирургии в краткосрочной системы сокультуры для изучения миграции клеток молочной железы, колонизации и распространения. Приблизительно 300 000 эндопротезирование тазобедренного сустава операции ежегодно проводится в США (Американской академии хирургов-ортопедов; Orthoinfo.aaos.org), и эти образцы, как правило, выбрасывают. Одним из наиболее частых показаний для этой операции является остеоартрит тазобедренного сустава, что приводит к постепенному пробоя хряща поверхностей, охватывающих головку бедренной кости, что приводит к боли в суставах. Во время тотального эндопротезирования тазобедренного replacemENT хирургии небольшая часть верхней бедренной кости, удаляется вместе с головки бедренной кости. Бедренная кость обычный участок рака молочной железы метастаз 48, и эти образцы содержат губчатую костную ткань, сайт метастатического колонизации клеток молочной железы. Большинство пациентов, которые подвергаются замене тазобедренного сустава, 50-80 лет, возрастной диапазон, что скобки годы пик заболеваемости раком молочной железы. Таким образом, эти ткани представляет собой ценный ресурс для изучения рака молочной железы кости метастатическим нишу.
Есть несколько важных шагов и соображения, связанные с этими методами. Во-первых, хорошее качество хирургического ronguer имеет важное значение для извлечения мелких Трабекулярные костных фрагментов, удерживая головку бедренной кости в противоположном, рукой в перчатке. Щипцы не будет работать, потому что они не являются достаточно крепкими, чтобы извлечь трабекулярной ткани, содержащей минерализованных спикулы. Еще одним важным фактором в этих анализах относится к обработке линии клеток молочной железы и пассажей, particuбенно в отношении миграции анализов. Долгосрочный проход и / или различия в процедурах обработки трипсином может привести к последовательного выбора более / менее популяций клеток упорные, потенциально изменяя мигрирующих реакции в экспериментах. Другой вопрос относится к стандартизации экспериментов, учитывая изменчивость хирургических тканей, полученных от больных разных возрастов и болезненных состояний. Для решения этой проблемы, мы используем внутрибрюшинную предметом экспериментального дизайна, в котором все переменные протестирована в трех экземплярах (например, через три фрагмента / экспериментальных скважин против трех фрагментов / контрольных лунок) с использованием фрагментов из хирургических образцов данного пациента. Переменные могут быть проверены с помощью этой конструкции на образцах из различных пациентов, и проанализированы на статистическую значимость с помощью парного теста T для данных в среднем за повторов, и / или в-субъектов в одну сторону ANOVA для данных по повторах. И, наконец, основным ограничением этого метода является короткое окно viability во Эксплант.
Наши измерения показали, viabilities мозга ~ 90% в день сбора, в соответствии с измерениями жизнеспособности, полученных из клетках костного мозга 49. Со временем, однако, мы наблюдали постепенное снижение в течение нескольких дней два и три, с резкой утраты жизнеспособности с помощью 6-й день Хотя мы не измеряли жизнеспособность минерализованной купе, качественные наблюдения показывают, что существует также ухудшение жизнеспособности костно-подкладка остеобласты и остеоциты, как показано на рисунке 4d. На основании этих экспериментов, мы ограничились наши эксперименты культуры краткосрочных исследований, проведенных в течение 48 или 72 часов. Предварительные эксперименты (не входит в комплект) показали, что жизнеспособность может быть улучшена с использованием коммерчески доступные средства массовой информации, сформулированный для поддержания клеток костного мозга. Однако мы не характерны для клеточной популяции мозга в этих экспериментах, и не знаю, если улучшенные результаты жизнеспособность от выбранногоследствием определенных групп населения клеточных мозга. Разработка протоколов для поддержания и расширения жизнеспособность этих эксплантов будет иметь важное значение для продвижения этой модели системы.
Хотя эта модель ограничивается короткие периоды времени, его основные преимущества по отношению к другим методам относятся следующие функции: 1) интактные 3-мерные ткани, несущие соответствующие типы клеток, которые составляют микросреду человеческой кости, 2) доступность к кости микросреды для мониторинга и возмущающие динамические взаимодействия, 3) большое число фрагментов в образце для репликации экспериментов, и 4) низкая стоимость по сравнению с моделями на животных.
В то время как мы описали анализов для изучения рака метастазы рака молочной к кости, эти образцы и подходы могут быть легко распространена на изучение других злокачественных опухолей костей ищет таких как рак простаты, а также других патологий костей. Хотя мы использовали сброшенные головок бедренных костей, прежде всего, как такurce фрагментов ткани, эти образцы также являются дополнительным источником человеческого костного мозга, который традиционно собраны путем аспирации костного мозга от молодых добровольцев. И, наконец, в то время как мы описали подходы с использованием клеточных линий разработан для биолюминесценции и флуоресценции, большинство процедур может быть изменена для использования с другими клетками, если эти клеточные линии и / или платформы визуализации не доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эти исследования были профинансированы, в частности, за счет субсидий из исследования по альтернативной и Фонда развития (107588), Национального института здоровья (1U54CA136465-04S1), и в Калифорнии молочной Программы исследований рака (201В-0141). Мы благодарим доктора. Андрей Уилбер и Р. Скотт McIvor за щедрое пожертвование от их
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Bissell, M. J., Radisky, D.
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al.
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M.
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
