Protokoll beskrivs för att studera bröstcancer cellmigration, spridning och kolonisering i en mänsklig benvävnad Explantation modellsystem.
Ben är den vanligaste platsen för bröstcancer metastasering. Även om det är allmänt accepterat att mikromiljön påverkar cancercellen beteende, lite är känt om fastigheter bröstcancerceller och beteenden inom infödda mikro av mänsklig benvävnad. Vi har utvecklat metoder för att spåra, kvantifiera och modulerar humana bröstcancerceller inom mikro av odlade humana skelettvävnadsfragment isolerade från kasse femurhuvuden efter total höftledsplastik operationer. Använda bröstcancerceller konstruerade för luciferas och förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryck, har vi möjlighet att reproducerbart kvantifiera migration och spridningsmönster som använder bioluminiscens imaging (BLI), spår cell interaktioner inom benfragment som använder fluorescensmikroskopi, och utvärdera bröstceller efter kolonisering med flödescytometri. De viktigaste fördelarna med denna modell är: 1) en infödd, arkitektoniskt intakt vävnad microeILJÖ som inbegriper relevanta humana celltyper, och 2) direkt tillgång till mikromiljö, vilket underlättar snabb kvantitativ och kvalitativ övervakning och störning av bröst- och ben cellegenskaper, beteenden och interaktioner. En primär begränsning, för närvarande, är det ändliga livskraft av vävnadsfragment, som begränsar fönstret i studien till korttidskultur. Tillämpningar av modellsystemet inkluderar studerar grundläggande biologi av bröstcancer och andra skelettsökande maligniteter inom metastaser nisch, och utveckla terapeutiska strategier för att effektivt nå bröstcancerceller i benvävnad.
Tumören mikromiljö är allmänt erkänd som en kritisk faktor för cancercell beteende under bröstcancer progression och metastasering 1-3. Målet med den metod som presenteras här är att underlätta studier av bröstcancerceller inom mikromiljön av mänsklig benvävnad, den vanligast förekommande stället för bröstcancermetastaser 4-6. Bone består av mineraliserade och märg fack 7-9, som båda hyser celler och utsöndrade faktorer inblandade i metastasutvecklingen 10,11. Även flitigt i vivo musmodeller underlättar system studier av metastaserad processen 12-15, cell interaktioner inom skelettet inte är lättillgängliga för observation och direkt störning. Modellsystem för att studera och odling musen benvävnad och mus benmärgsceller ger bättre åtkomst och har gett många insikter om överhörning och mekanismerna bakom bröstcancer cell metastasis av den murina skelettet 16-22. Men studier har antytt att det kan finnas artspecifika mönster osteotropism för benvävnaden 23,24. Dessa mönster kan återspegla inneboende artspecifika skillnader i benvävnad egenskaper, skillnader som härrör från förändrade benmärgs populationer i immunbristmöss 11, och / eller den relativt unga ålder av möss som används i experiment, som alla är sannbestämnings benet mikromiljö.
In vitro metoder för att studera bröstcancerceller i humana skelett samkulturer har oftast fokuserar på specifika ben celltyper såsom märghärstammande osteoblaster eller stromala celler odlade som monoskikt, eller inom manipulerade 3-dimensionella modellsystem 25-35. Även 2-dimensionell cellodlingsmodeller har bildat grunden för in vitro-metoder för cancerforskning, har det länge varit känt att cellens beteende är i grunden förändrad hos monolayer kultursystem 18,36,37. Detta har lett till utvecklingen av konstruerade mikromiljöer som efterliknar de komplicerade 3-dimensionella levande vävnader, inklusive matris och ställningsbaserade modeller sammansatta av naturliga material såsom kollagen, eller syntetiska polymerer ympats med specifika celltyper att skapa vävnadsliknande mikromiljöer 36-41. Engineered tillvägagångssätt har också användningen av bioreaktor plattformar för att styra och studera den hormonella miljön i mikromiljön 18,19,41-43. Även biomimetiska modeller och bioreaktorer ger många delar av en komplex vävnad mikromiljö i en kontrollerad miljö, och har tillämpats med framgång för att främja studiet av bröstcancer metastaser till ben 18,19,35,42,43 behöver manipulerade modellsystem i allmänhet inte innehålla hela spektrat av celltyper och extracellulära matrixkomponenter som finns inom eget ben miljön.
Tills nyligen, bröstcancerceller har inte studerats inom den nativa, intakta, 3-dimensionella mikromiljö av humana benvävnader. Vi rapporterade nyligen att utveckla en co-kultur modell med benvävnadsfragment isolerade från total höftledsplastik (THR) kirurgi prover 44 humana. Dessa prover hyser både de mineraliserade och märg fack som krävs för att studera mekanismerna bakom mikro metastas i korttidskultur. I tidigare arbete etablerade vi proof-of-princip för att använda bioluminiscens imaging (BLI) att övervaka spridningen av luciferas-uttryckbröstcancerceller (MDA-MB-231-Fluc) samar odlade med benfragment 44. Här presenterar vi detaljerade experimentella protokoll för att studera bröstcancer cell cancer proliferation, kolonisering, och migration inom ramen för den infödda mikro använder mänskliga ben vävnadsexplantat.
Först presenterar vi ett protokoll för samarbete odling bröstcancerceller intill benfragment att mäta bröstcellproliferation med användning av BLI. I detta avsnitt, är bröst cellsuspensioner seedade som cell fläckar i 6-hålsplattor intill benfragment, som är immobiliserade med benbitar vax. Kontrollbrunnar innehåller benvax, men ingen benfragment. När cell fläckar fäster, är medelsätts och plattan är odlade för 24 timmar, varefter självlysande signalstyrkan (i samband med cellnummer) mäts med BLI. I nästa steg presenterar vi metoder för co-odling bröstcancerceller seedade direkt på benfragment att studera kolonisering och spridning. Här bröstet cellsuspensioner pipetteras direkt på benvävnaden fragment, som övervakas i kultur av BLI och fluorescensmikroskopi över tid för att spåra koloniseringen och mobilnummer. I denna metod, kan den märgutrymmet spolas ur benfragmenten vid någon tidpunkt för analys av koloniserade bröstcancerceller genom flödescytometri eller märg viabilitetsanalyser.
Dessutom har vi frånskriftlärd två olika metoder för att mäta bröstcancer cell migration. I den första metoden steg beskrivs för att mäta migrering mot benvävnad odlingssupernatanter. I detta protokoll de bröstcancerceller sås på de inre, övre ytor Transwell sätter membran med en 8 um porstorlek (som visas i figur 1A). Skären placerades sedan i en mottagningsplatta med brunnar innehållande benvävnad supernatant eller kontrollmedium. Under loppet av en 20 h inkubationsperiod litet antal bröstcancerceller migrerar genom insatsmembran ned i de undre vävnadsodlingsbrunnar där de fäster för detektering av BLI. I den andra migreringsmetod de bröstcancerceller sås på de nedre, yttre ytor Transwell insatsmembran. Bone vävnadsfragment placeras i insats kopparna och bröstcancerceller migrerar uppåt genom membranen att kolonisera benfragmenten (såsom visas i Figur 1B), vilketsedan avbildas med BLI.
Mehra et al. Har tidigare beskrivit döden insamling och analys av skelettprover från metastaserande prostatacancer patienter skördas vid obduktionen, avslöjar högkvalitativa vävnader och validera användningen av mänskliga ben prover för att studera metastaser processen 47. Här har vi beskrivit protokoll för insamling, bearbetning och användning av benvävnadsfragment mänskliga erhållits från kasse femurhuvuden efter THR kirurgi i en kortsiktig samodlingssystemet att studera bröstcellm…
The authors have nothing to disclose.
Dessa studier har finansierats delvis med bidrag från Alternative forskning och utveckling Foundation (107.588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), och California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi tackar Drs. Andrew Wilber och R. Scott McIvor för den generösa donationen av deras transponson och pK / hUbiC-SB11 transposas plasmider. Vi tackar John Tamaresis, Ph.D. för råd om statistiska metoder, Timothy Brown för att utföra flödescytometri, Georgette Henrich för råd om migrationsflöden i analyser, och Nancy Bellagamba för att underlätta insamling av THR exemplar.
DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |