Summary
プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。
Abstract
骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。
Introduction
腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。
インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス - 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種36-41。工学的ア プローチも制御し、微小環境18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨18,19,35,42,43の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。
最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が44標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片44（MDA-MB-231-Fluc細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。
まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。
さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。
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Protocol
大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目THR手術を受けている患者から採取した。すべての組織は、スタンフォード大学の研究コンプライアンス室の規則に従って匿名化検体として採取した。
1。乳癌細胞株（複数可）を選択する
- 取得またはルシフェラーゼ-GFPレポーター構築物を有する所望の乳癌細胞株（複数可）をトランスフェクトする。以下の実験は、 スリーピングビューティートランスポゾンプラスミドPKT2 / LuBiGトランスフェクションすることによってMDA-MB-231およびMCF-7乳癌細胞株ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作（Fluc細胞）および高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いて行った。とトランスポザーゼプラスミドPK / hUbiC-SB11 45,46。
注：トランスフェクトされた細胞株は、MDA-MB-231-Flucを-EGFPおよびMCF-7-Fluc細胞-EGFPと呼ばれている。
2.組織Fの分離大腿ヘッドからragments
- THR手術後、生理食塩水で満たされた無菌の容器に廃棄された大腿骨頭を収集する。研究所に検体を移し、手術の1-3時間以内にそれを処理する。注：処理の遅延がある場合には、4℃で試料を置く。
- 実験の各タイプについては、以下に定める滅菌手袋、外科鉗子、ピンセット、器具をすすぐために、70％イソプロパノールでビーカー、および組織培養容器：層流の組織培養フード内で吸収マットの上、以下の項目を配置することによって、作業領域を準備する。
- 無菌手術用手袋を身に着けていることは、片方の手で丸い大腿骨ヘッドを保持する大腿骨の露出した上軸から希望のサイズ（〜2〜5ミリメートル）の小柱骨片を抽出する一方で骨鉗子を使用する。増殖のタイプに応じて、培養容器（ 例えば、6-、12-、または24ウェル組織培養プレートまたは遊走チャンバー）内に骨片を移し、コルonizationまたは遊走実験手順3、4または5に記載の方法。
注：上記のように骨組織断片は、それぞれ特定の増殖、コロニー化または移行アッセイのための最初のステップを完了した後に収穫する必要があります。 図2に示すように、断片は、サイズの範囲であろう。フラグメントの前または標準化の目的のために実験後に秤量することができる。
BLIを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接3.共培養乳癌細胞
- 実験の前に、/50μlの2×10 5乳癌細胞を含有する懸濁液を調製し、培養物中の骨片を固定するための骨ワックスのプラグを用意する。 3ピースにP200のマイクロピペットチップをカットし、骨ワックスの小さい（〜35 mg）の作品をカットする「クッキーカッター」の方法で最大の作品の狭い方の端を使用しています。ペトリ皿に骨ろうプラグを排出する最小単位の広い方の端を使用してくださいストレージ用。
- 各ウェルの12時の位置に骨ろうの部分を置き、静かに滅菌手袋をはめた人差し指で押し下げます。
- ピペット6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10％FBS +ペニシリン-ストレプトマイシン中で1×10 5乳癌細胞を含む細胞懸濁液50μl。 （あるいは、必要に応じて分散されたパターンでシード細胞が）、細胞付着を促進するために、45分間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。
- 各実験ウェルについての骨のワックスの1枚に1骨片を置き、それを確保するために骨鉗子で穏やかな圧力を適用します。下の3つのウェルのみをコントロールとして、骨のワックスを含有しながら、与えられたTHR標本から3骨片は、トップ3ウェルに入れられるように三連で実験を行う。
- を5mlピペットを用いて、穏やかにゆっくりと乳房細胞または骨断片を追い出し回避するために、各ウェルの側にDMEM-10％FBSを5ml提供。 37でプレートを置き76; 20〜24時間、C組織培養インキュベーター。
- 生物発光イメージング（BLI）を実行するために、各ウェルに（300μgの/ mlの濃度を達成する）インキュベーターからプレートを除去し、ルシフェリン基質を加える。イメージは、次のパラメータを用いてIVISイメージングプラットフォーム上ですぐにプレート：1のFストップ、小さなビニング、1秒の露光時間は、レベルD.は、信号それぞれの強度だけでなく、平均的な輝き（光子/秒/平方センチメートルを測定/ステラジアン）。
- すべての実験およびコントロールウェルについての平均輝きを定量するために関心領域（ROI）の領域を定義するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 Excelシートにエクスポート平均放射輝度値は、統計を実行し、グラフを生成する。
4.共培養コロニー形成を研究する骨の断片上に直接播種乳癌細胞と細胞数
- 直接24ウェル組織培養プレート（1断片/ウェル）の空のウェルに骨片を配置するために鉗子を使用する。
- ピップ各骨片の上に直接1 X 10 3-6乳がん細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をETTE。細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。静かにフラグメントが完全に培地中に沈められていることを各ウェルなどの側面に1〜2ミリリットルDMEM-10％FBSを追加します。 20-24時間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
- インキュベーション後、各ウェルを1mlのDMEM-10％FBSを含有する新鮮な24ウェルプレートに、各骨組織フラグメントを転送するために鉗子を使用する。 BLIを実行するには、手順上記の3.6から3.7に従ってください。さらに、断片は、蛍光顕微鏡を使用して表示、またはステップ6で説明したように、乳癌細胞数および特性の分析のための骨髄集団を得るためにフラッシュされる。
- BLI、ピペット蛍光ビスホスホネート標識溶液を5μl（事前以下の蛍光顕微鏡で定性的な評価のための完全な断片を製造するために、骨片の鉱化骨片を標識するために、各ウェルに）、製造業者の指示に従って比べ。さらに24時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
- 蛍光ビスホスホネート標識溶液中での培養の24時間後に、画像GFP（485 nm）であり、ビスホスホネートラベル（680 nm）に設定され、蛍光顕微鏡を用いて、フェノールレッドを含まない培地とビューを含む組織培養プレートにフラグメントを転送するために鉗子を使用する。
5.骨組織フラグメントに乳癌細胞の移行を測定し、培養骨断片上清
- 骨組織培養上清の方へ移行。
注記：特定のTHR標本から3断片を3上清を生成するために使用されるような三連での実験を行います。各実験について、マイグレーションが骨上清対コントロール培地のみを含む3つのウェルを含む3つのウェル間で比較される。- 骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。
注：培地は、手術に起因する組織損傷に応答して分泌された因子を除去するために24時間後に変更される。骨組織の上清を、FBS含有培地中で生成されるので、FBS含有培地を含むウェルのみ乳癌細胞遊走に対するFBSの寄与を制御するために含まれる。 - 48時間後に、レシーバプレートのウェルに各上清/対照培地とピペット0.9mlの収集。インサートは、後に、これらのウェルに配置される。挿入物を播種しながら組織培養インキュベーター中レシーバープレートをインキュベートする。注：残りの上清（蒸発後〜1ml）をセクレトーム事実上の分析のために収集することができるRS場合は44を希望する。
- トランスウェルインサートをシードするには、標準の、空の24ウェル組織培養プレートに入れます。 図1Aに示すように、各インサートの上部の、内膜表面にDMEM-10％FBS中に1×10 5個の乳癌細胞を含むピペット350μlの細胞懸濁液。付着を促進するために45分間37℃で組織培養インキュベーター中に播種された挿入物を含有する24ウェルプレートを置く。
- 細胞をインサートに取り付けた後、製造業者の説明書に従って受け板にインサートを転送するために鉗子を使用する。角度インサート膜とウェル上清受信機との間の気泡の形成を防止するだけでなく、受信機にそれを置く各インサート。 37℃の組織培養インキュベーター中で20時間インサートレシーバープレートをインキュベートする。
注：インサート膜と受信機の間に気泡のためのレシーバープレートの下側を確認してもsupernatanトン。泡が表示されている場合は、特定のインサートを削除し、気泡が存在しないまでも受信機に再配置します。 - 20時間後、レシーバープレートからのインサートを削除する鉗子を使用しています。ステップの手順を使用すると、3.6から3.7イメージにに移行し、レシーバプレートウェルの底部に取り付けた細胞をBLIを行う。
- 骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。
- 骨組織片の方へ移行。
注記：特定のTHR標本から3フラグメントは、3つの別々のインサート内に配置され、3ガラスビーズを対照として、3つの別々のインサート内に配置されるように三連での実験を行います。- 各ウェルに0.9ミリリットルDMEM-10％FBSをピペッティングすることによりレシーバプレートを準備します。挿入を準備している間、組織培養インキュベータにそれを置きます。
- 挿入を種子に、蓋を持つプラスチック製のマイクロチューブボックスの表面にそれらを反転。 dは1×10 5乳癌細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をピペットirectly（反転インサート上で上を向いている）各挿入膜の外、底面に。蓋付きのマイクロチューブボックスが開いて割れてカバーし、細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養器に移す。
- 組織培養フードにマイクロチューブボックスを転送し、右側アップシードの挿入をオンにし、レシーバプレートのウェル中にそれらを転送するために鉗子を使用する。各インサートカップにピペット0.450ミリリットルDMEM-10％FBS。ピンセットを用いて、それぞれの準備インサートカップにつの骨組織片（約3 mm）を転送する。必要に応じて、追加のウェルにおけるネガティブコントロールとしてガラスビーズを使用しています。 20時間組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
- 遊走を測定するために、ウェルあたり1mlのDMEM-10％FBSを含有する標準的な24ウェル組織培養プレートを準備する。インキュベーターからレシーバープレートを取り外し、それぞれから骨片とビーズを転送するために鉗子を使用する標準プレートの別々のウェルに挿入します。ルシフェリンを追加基板を各ウェルに（300μgの/ mlの最終濃度を達成するため）、ステップ3.6から3.7までの手順を使用してBLIを行う。
6.追加前後の実験的解析
- フラッシュされた骨髄の分析。
- 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。
注：再懸濁体積は遠心分離後の細胞ペレットのサイズは、用途に応じて変化する。 - 生存率アッセイのため〜PBSの75〜300μlの体積は適切であり、これらの懸濁液は、市販fluorescencを用いて分析することができる電子基づく生存率アッセイは、製造業者の指示に従って、従来の血球計数器にピペットで入れ、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。
- GFP陽性乳癌細胞の検出に基づいてフローサイトメトリー分析またはソーティングのために、濃度が1×10 6細胞/ mlであることFBS、2mMのEDTA、および10mM HEPES、例えば2％を含有する1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。
- 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。
- H＆E染色および免疫組織化学。
- ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）染色および/または免疫組織化学のための断片を処理するには、番号2鉛筆で標識されたプラスチック製のカセット内の断片を配置し、24時間、10％緩衝ホルマリンを満たした容器に水没。
- パラフィン包埋のためのプロセス組織切片、各フラグメント内鉱化骨片を考慮して脱灰工程を含む慣用のプロトコールを用いて染色する。
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Representative Results
大腿ヘッドから組織片を分離
大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目人工股関節全置換術を受けた男性と女性患者（年齢の44から90歳）の同数から収集した。各廃棄された大腿骨頭は、鉱化骨片と骨髄から構成される小柱骨組織を保有上部の大腿骨の小部分が含まれています。この組織は、小さな断片を抽出するために、外科骨鉗子を使用して、シャフト（図2A）の外科的に露出断面を通じてアクセス可能です。抽出された片の組織学は、鉱化および骨髄成分を明らかにし、 図2Bに示されている。抽出された部品の外観は、図2Cに示すように、骨髄の脂肪含有量に応じて、黄色から赤色の範囲の異なる患者から得られた大腿骨頭を横切って変化する。 W電子ルシフェラーゼ及びEGFPの発現のために操作乳癌細胞との動的相互作用を測定するために短期的アッセイにおいてこれらの骨組織フラグメントの使用を示す。
生物発光イメージングを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接して乳癌細胞を共培養
BLIを使用して、乳癌細胞の増殖を測定するために固定化された骨片に隣接して共培養MDA-MB-231-Fluc細胞-EGFP乳癌細胞培養プレート設定は、 図3Aに示されている。 24時間で、プレートのBLIは、 図3Bに示されており、3つの実験からのBLI信号、骨片の不在対存在下で強化された細胞増殖を示すが、図3Cに示されている。
骨の断片上に直接播種共培養乳癌細胞は、コロニー形成および細胞数を研究する
MCF-7-Flucを-EGFP Cの植民図4Aに示されている24時間の時点でBLIを介して測定されるのエルが減少播種密度に関連したシグナルの減少を実証、骨組織断片上に直接播種した。鉱化骨髄区画内乳癌細胞のコロニー形成を明らかにし、蛍光顕微鏡で画像として直接播種断片は、蛍光biphosophonate試薬で標識した後、図4（b）の48時間で示されている。これらの植民パターンもサイトケラチン抗体（ 図4Cおよび4D）を用いた免疫組織化学染色のために、ポスト実験的に処理された直接播種断片的に明らかにされている。
骨組織片培養骨断片上清に乳癌細胞の移行の測定
骨組織培養上清に向かって骨断片に多孔移行膜を横切るMDA-231-Fluc細胞-EGFP細胞の移動は、Bで検出される図5に示すように、LIは、与えられたTHR試料の3つのフラグメントから誘導された培養上清に向かって強固な移行パターンは、対照培地対骨組織の上清を含むウェルに増加移行を示し、図5（a）に示されている。すべての移動パターンは、この堅牢であるが、骨上清に向かって移行は、通常、ほとんどの実験の対照媒体に向けてよりも大きい。所与THR試料から骨片に標準的な移行パターンは、 図5Bに示されている。
フラッシュされマローの分析
さらに、我々は、骨髄細胞がコロニー化断片から洗い流すことができることを示しており、そのフラッシュ乳癌細胞は、フローサイトメトリー（ 図6B）、BLI（図6C）によるこれらの細胞の中で検出することができ、かつ/または蛍光顕微鏡（ 図6D） 。
生存率の測定
図1：移行実験のセットアップします。 「前方移行」の実験では（A）は 、レシーバプレートのウェルは、以前に生成された骨組織培養上清で充填される。 DME-10％FBSを含有する挿入カップにトランスウェル膜の内側、上面上に播種された乳癌細胞は、膜を通って移動し、BLIによる検出のためのウェルの底に付着する。 
図2：大腿骨頭から組織片を分離する。 （A）外科鉗子を用いて海綿骨の断片を抽出する。（B）組織学は、大腿骨の組織から抽出した直後に固定フラグメントの鉱化（白矢印）および骨髄（黒矢印）の区画を示す。（C）骨梁の骨片は、2つの異なるから抽出赤対黄色骨髄含有量の変化を示す大腿骨頭。 
図3：生物発光イメージングを用いて乳房細胞増殖を測定するために、骨片に隣接して共培養乳癌細胞。 （A）共培養矢印で示すように、固定化された骨片に隣接するMDA-MB-231-Fluc細胞-EGFP乳癌細胞のための培養プレートセットアップ：セルスポット（青）、骨ろう（黒）、及び骨片（赤）。骨ワックスの位置も黒い点線の円によって示されている。プレートは、培地の添加の前に示されている。トップ3のウェルは、24時間後に、プレートの骨ワックスのみ（B）BLIを含む骨ワックス、下の3つのウェルに繋留骨片を含む。MDA-MB-231-Fluc細胞-EGFP細胞のためのBLI信号（C）の定量存在下で成長している不在（緑色のバー対（紫のバー）説明したように）3 THRからの断片のは、培養標本。対3の対照ウェル - 各THR標本の場合は、バーが3フラグメントを含む全体で測定された平均BLI値を表す。この結果は、骨断片の対不在下で増殖のより高いレベルを示している。エラーバーは標準誤差た（p <0.01）を表す。許可44で再現。 
図4の骨片に直接播種乳癌細胞の検出。 MCF-7-Fluc細胞-EGFPの（A）コロニー形成細胞は、24時間でBLIによって検出されるように48時間播種後に（B）を直接播種断片。減少播種密度に関連したシグナルの減少を示す、骨組織断片上に直接播種し、そして蛍光biphosophonate試薬と24時間後のラベリング。蛍光顕微鏡は、EGFP +乳癌細胞などを明らかにする鉱化骨片（緑色の矢印）と、および骨髄コンパートメント（白矢印）における脂肪細胞とsociated。これらのコロニー形成パターンも72共培養の時間（C）及び（D）下記AE1 / AE3パンサイトケラチン抗体を用いた免疫組織化学的染色のために処理し、直接播種断片で明らかにされている。矢印で示される（C）サイトケラチン陽性乳癌細胞において、骨髄区画における脂肪細胞に隣接して観察される。に（D）サイトケラチン陽性乳癌細胞は鉱化骨片に付着が観察された。（C）及び（D）は、許可を得て複製44。 
図5：骨組織片培養骨片の上澄みに乳癌細胞の遊走測定 MDA-MB-231の移行。骨組織培養上清に向かって骨断片に多孔移行膜を横切る-fLuc-EGFP細胞BLI 24時間で検出された。対照培地対所与THR試料から誘導培養上清に向かって移動の増強を明らかにし（A）BLI信号（B単一THR標本から3の骨断片に乳癌細胞の遊走パターンを示す）BLI信号。骨組織断片を白い点線の円で示されている。ガラスビーズを含有する対照ウェルは、底部に示されている。 
図6：フラッシュマローの保菌断片からフラッシュマローにおけるMDA-MB-231fLUC-EGFP細胞の検出 （左）無し（A）フラグメントおよびBLIによって検出された（右）、乳癌細胞を植民と（B）の分析Fによる断片（A）からローサイトメトリー。 EGFP陽性乳癌細胞は、BLI陽性の断片ではなく、BLI陰性断片からフラッシュ骨髄中で検出された。BLI陽性断片からフラッシュ骨髄の培養物から得られた乳癌細胞コロニーの（C）BLI検出。 （D）BLI陽性断片からフラッシュ骨髄区画の蛍光顕微鏡検査、骨髄細胞の分野におけるMDA-MB-231fLUC-EFGP細胞を示す。 
図7：生存能力の測定生存率4 THRから単離された組織断片からフラッシュ骨髄細胞については、収集後に直ちに試験片24、48、72時間、およびDMEM-10％FBS中で培養6日目。培地を24および72時間後に変更されました。
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Discussion
Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するためのプロトコルを記載している。約30万股関節置換手術は、米国（米国整形外科学会、Orthoinfo.aaos.org）で毎年行われており、これらの標本は、一般的に破棄されます。この手術のための最も頻繁な適応症の一つは、関節痛を生じる大腿骨頭を覆う軟骨表面の漸進的な破壊につながる、股関節の変形性関節症である。人工股関節全replacem間、ENT手術は、上大腿骨の小部分は、大腿骨頭と一緒に削除されます。大腿骨は、乳癌転移48の一般的な部位であり、そしてこれらの試料は、小柱骨組織、転移性乳癌細胞のコロニー形成の部位を含む。人工股関節置換を受けるほとんどの患者は、ピーク乳がん発生率の年をブラケット年齢範囲50〜80歳です。したがって、これらの組織は、乳癌骨転移ニッチを研究するための貴重なリソースを構成している。
これらの技術に関連するいくつかの重要なステップと考慮事項があります。まず、良い品質外科ronguerは反対、手袋をはめた手で大腿骨頭を保持しながら、小さな小柱骨片を抽出するために不可欠である。彼らは鉱化骨片を含む小柱組織を抽出するのに十分頑丈ではないため、鉗子は動作しません。これらのアッセイにおける別の重要な考慮事項は、乳癌細胞株の取り扱いおよび継代、particuに関係遊走アッセイに関してlarly。トリプシン処理手続の長期的な通路及び/または変動性は、潜在的に実験における渡り鳥の応答を変更すること、より多くの/より少ない粘り強い細胞集団の順次選択につながることができます。もう一つの問題は、異なる年齢および疾患状態の患者から得られた外科的組織の変動性を考えると、実験の標準化にも関する。これに対処するために、我々はすべての変数が連で試験されている被検体内実験的なデザインを採用して（ 例えば 、3つの断片/実験ウェル対3つの断片/対照ウェル全体で）指定された患者の手術標本からのフラグメントを使用する。変数は、複数の患者からの検体でこの設計を用いて試験し、そして反復を介してデータのための複製にわたって平均化、および/または対象内の一方向ANOVAデータに対する対のT検定を用いて統計的有意性について分析することができる。そして最後に、この方法の主な制限は、viabの短いウィンドウです移植片培養中にility。
我々の測定は、骨髄穿刺液49から得られた生存率の測定値と一致して、収集の日に約90％で骨髄の生存率を明らかにした。時間が経つにつれて、しかし、私たちは鉱化コンパートメントの生存能力を測定していないが、定性的な観測がの生存率の類似の減少があることを示唆している日6で生存能力の劇的な損失で、日2と3の上緩やかな低下を観察図4Dに見られるように、骨ライニング骨芽細胞および骨細胞、。これらの実験に基づいて、我々は、48または72時間にわたって行わ短期研究に我々の培養実験を制限している。予備実験は、（含まれていない）生存率が骨髄細胞を維持するために処方され、商業的に利用可能なメディアを使用して向上させることができることを示した。しかし、本発明者らは、これらの実験における骨髄細胞集団を特徴付けておらず、選択されたのであれば改善された生存率の結果はわからない特定の骨髄細胞集団の成長。維持及びこれらの外植片の生存を延長するためのプロトコルの開発は、このモデル系を進めることが重要である。
このモデルは、短い期間に限られているが、他の方法との関係で、その主な利点は、以下の特徴が含まれる：ヒト骨微小環境、2を構成する関連する細胞型を保有する1）無傷の3次元組織）は、骨微小環境へのアクセスを監視するためのそして摂動動的相互作用は、3）反復実験用試料当たりのフラグメントの高番号、および4）低コスト、動物モデルと比べ。
我々は、骨への乳癌転移を研究するためのアッセイを記載してきたが、これらの試料およびアプローチは、容易に、前立腺癌、ならびに他の骨の病変のような他の骨求め悪性腫瘍の研究に拡張することができる。私たちは主にように廃棄された大腿骨頭を使用してきたが、組織フラグメントのurce、これらの試料はまた、伝統的に若いボランティアから骨髄穿刺を介して収集されたヒト骨髄の追加のソースを構成する。我々は生物発光と蛍光を操作された細胞株を使用してのアプローチを説明してきたが、これらの細胞株および/または画像化プラットフォームが利用できない場合、最終的に、手順のほとんどは、他の細胞との使用のために改変され得る。
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Acknowledgments
これらの研究は、部分的には、オルタナティブ研究開発財団（107588）、国立衛生研究所（1U54CA136465-04S1）、およびカリフォルニア乳がん研究プログラム（201B-0141）からの補助金により、賄われた。私たちは、博士に感謝。彼らの寛大な寄付のためのアンドリュー·ウィルバーとR.スコット·マッキバー
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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