Summary
Protokoll beskrivs för att studera bröstcancer cellmigration, spridning och kolonisering i en mänsklig benvävnad Explantation modellsystem.
Abstract
Ben är den vanligaste platsen för bröstcancer metastasering. Även om det är allmänt accepterat att mikromiljön påverkar cancercellen beteende, lite är känt om fastigheter bröstcancerceller och beteenden inom infödda mikro av mänsklig benvävnad. Vi har utvecklat metoder för att spåra, kvantifiera och modulerar humana bröstcancerceller inom mikro av odlade humana skelettvävnadsfragment isolerade från kasse femurhuvuden efter total höftledsplastik operationer. Använda bröstcancerceller konstruerade för luciferas och förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryck, har vi möjlighet att reproducerbart kvantifiera migration och spridningsmönster som använder bioluminiscens imaging (BLI), spår cell interaktioner inom benfragment som använder fluorescensmikroskopi, och utvärdera bröstceller efter kolonisering med flödescytometri. De viktigaste fördelarna med denna modell är: 1) en infödd, arkitektoniskt intakt vävnad microeILJÖ som inbegriper relevanta humana celltyper, och 2) direkt tillgång till mikromiljö, vilket underlättar snabb kvantitativ och kvalitativ övervakning och störning av bröst- och ben cellegenskaper, beteenden och interaktioner. En primär begränsning, för närvarande, är det ändliga livskraft av vävnadsfragment, som begränsar fönstret i studien till korttidskultur. Tillämpningar av modellsystemet inkluderar studerar grundläggande biologi av bröstcancer och andra skelettsökande maligniteter inom metastaser nisch, och utveckla terapeutiska strategier för att effektivt nå bröstcancerceller i benvävnad.
Introduction
Tumören mikromiljö är allmänt erkänd som en kritisk faktor för cancercell beteende under bröstcancer progression och metastasering 1-3. Målet med den metod som presenteras här är att underlätta studier av bröstcancerceller inom mikromiljön av mänsklig benvävnad, den vanligast förekommande stället för bröstcancermetastaser 4-6. Bone består av mineraliserade och märg fack 7-9, som båda hyser celler och utsöndrade faktorer inblandade i metastasutvecklingen 10,11. Även flitigt i vivo musmodeller underlättar system studier av metastaserad processen 12-15, cell interaktioner inom skelettet inte är lättillgängliga för observation och direkt störning. Modellsystem för att studera och odling musen benvävnad och mus benmärgsceller ger bättre åtkomst och har gett många insikter om överhörning och mekanismerna bakom bröstcancer cell metastasis av den murina skelettet 16-22. Men studier har antytt att det kan finnas artspecifika mönster osteotropism för benvävnaden 23,24. Dessa mönster kan återspegla inneboende artspecifika skillnader i benvävnad egenskaper, skillnader som härrör från förändrade benmärgs populationer i immunbristmöss 11, och / eller den relativt unga ålder av möss som används i experiment, som alla är sannbestämnings benet mikromiljö.
In vitro metoder för att studera bröstcancerceller i humana skelett samkulturer har oftast fokuserar på specifika ben celltyper såsom märghärstammande osteoblaster eller stromala celler odlade som monoskikt, eller inom manipulerade 3-dimensionella modellsystem 25-35. Även 2-dimensionell cellodlingsmodeller har bildat grunden för in vitro-metoder för cancerforskning, har det länge varit känt att cellens beteende är i grunden förändrad hos monolayer kultursystem 18,36,37. Detta har lett till utvecklingen av konstruerade mikromiljöer som efterliknar de komplicerade 3-dimensionella levande vävnader, inklusive matris och ställningsbaserade modeller sammansatta av naturliga material såsom kollagen, eller syntetiska polymerer ympats med specifika celltyper att skapa vävnadsliknande mikromiljöer 36-41. Engineered tillvägagångssätt har också användningen av bioreaktor plattformar för att styra och studera den hormonella miljön i mikromiljön 18,19,41-43. Även biomimetiska modeller och bioreaktorer ger många delar av en komplex vävnad mikromiljö i en kontrollerad miljö, och har tillämpats med framgång för att främja studiet av bröstcancer metastaser till ben 18,19,35,42,43 behöver manipulerade modellsystem i allmänhet inte innehålla hela spektrat av celltyper och extracellulära matrixkomponenter som finns inom eget ben miljön.
Tills nyligen, bröstcancerceller har inte studerats inom den nativa, intakta, 3-dimensionella mikromiljö av humana benvävnader. Vi rapporterade nyligen att utveckla en co-kultur modell med benvävnadsfragment isolerade från total höftledsplastik (THR) kirurgi prover 44 humana. Dessa prover hyser både de mineraliserade och märg fack som krävs för att studera mekanismerna bakom mikro metastas i korttidskultur. I tidigare arbete etablerade vi proof-of-princip för att använda bioluminiscens imaging (BLI) att övervaka spridningen av luciferas-uttryckbröstcancerceller (MDA-MB-231-Fluc) samar odlade med benfragment 44. Här presenterar vi detaljerade experimentella protokoll för att studera bröstcancer cell cancer proliferation, kolonisering, och migration inom ramen för den infödda mikro använder mänskliga ben vävnadsexplantat.
Först presenterar vi ett protokoll för samarbete odling bröstcancerceller intill benfragment att mäta bröstcellproliferation med användning av BLI. I detta avsnitt, är bröst cellsuspensioner seedade som cell fläckar i 6-hålsplattor intill benfragment, som är immobiliserade med benbitar vax. Kontrollbrunnar innehåller benvax, men ingen benfragment. När cell fläckar fäster, är medelsätts och plattan är odlade för 24 timmar, varefter självlysande signalstyrkan (i samband med cellnummer) mäts med BLI. I nästa steg presenterar vi metoder för co-odling bröstcancerceller seedade direkt på benfragment att studera kolonisering och spridning. Här bröstet cellsuspensioner pipetteras direkt på benvävnaden fragment, som övervakas i kultur av BLI och fluorescensmikroskopi över tid för att spåra koloniseringen och mobilnummer. I denna metod, kan den märgutrymmet spolas ur benfragmenten vid någon tidpunkt för analys av koloniserade bröstcancerceller genom flödescytometri eller märg viabilitetsanalyser.
Dessutom har vi frånskriftlärd två olika metoder för att mäta bröstcancer cell migration. I den första metoden steg beskrivs för att mäta migrering mot benvävnad odlingssupernatanter. I detta protokoll de bröstcancerceller sås på de inre, övre ytor Transwell sätter membran med en 8 um porstorlek (som visas i figur 1A). Skären placerades sedan i en mottagningsplatta med brunnar innehållande benvävnad supernatant eller kontrollmedium. Under loppet av en 20 h inkubationsperiod litet antal bröstcancerceller migrerar genom insatsmembran ned i de undre vävnadsodlingsbrunnar där de fäster för detektering av BLI. I den andra migreringsmetod de bröstcancerceller sås på de nedre, yttre ytor Transwell insatsmembran. Bone vävnadsfragment placeras i insats kopparna och bröstcancerceller migrerar uppåt genom membranen att kolonisera benfragmenten (såsom visas i Figur 1B), vilketsedan avbildas med BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Femurhuvuden samlades in från patienter som genomgick elektiv THR kirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Alla vävnader saml som avidentifierade prover i enlighet med reglerna i Research regelefterlevnad på Stanford University.
1. Val av en bröstcancercellinje (er)
- Skaffa eller transfektera önskad bröstcancer cellinje (s) med en luciferas-GFP reporter konstruktion. Följande experiment utfördes med användning av MDA-MB-231 och MCF-7 bröstcancercellinjer konstruerade för stabilt uttryck av eldflugeluciferas (Fluc) och förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) genom transfektion med Törnrosa transposonen plasmiden pKT2 / LuBiG och transposaset plasmiden pK / hUbiC-SB11 45,46.
OBS: De transfekterade cellinjer kallas MDA-MB-231-Fluc-EGFP, och MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isolera Vävnads Fragments från femurhuvuden
- Efter THR kirurgi, samla kasselårbenshuvudet i en steril behållare fylld med fysiologisk saltlösning. Flytta över provexemplaret till laboratoriet och bearbeta den inom 1-3 timmar av kirurgi. OBS: Om det finns en fördröjning i bearbetningen, placera provet vid 4 ° C.
- Förbered ett arbetsområde genom att placera följande saker på ett absorberande matta i ett laminärt flöde vävnadsodling huva: sterila handskar, kirurgisk rongeur, pincett, bägare med 70% isopropanol att skölja instrument och vävnadsodlingskärl som anges nedan för varje typ av experiment .
- Iklädd en steril operationshandske för att hålla den runda lårbenshuvudet i ena handen, använd rongeur i den andra handen för att extrahera trabekulära benfragment av önskad storlek (~ 2-5 mm) från den exponerade övre axeln av lårbenet. Överför benfragment i odlingskärlet (t.ex., 6-, 12-, eller 24-brunnars vävnadsodlingsplatta eller migration kammaren), beroende på vilken typ av proliferation, colonization eller migration experiment, som beskrivs i steg 3, 4 eller 5.
OBS: benvävnad fragment bör skördas enligt ovan efter att ha avslutat de första stegen för varje specifik proliferation, kolonisering eller migrationsanalys. Fragment kommer variera i storlek som visas i figur 2. Fragment kan vägas före eller efter experiment i syfte att standardiseringen.
3. Co-odling bröstcancerceller Intill benfragment att mäta Bröst Cell Proliferation Använda BLI
- Före experimentet, förbereda en suspension innehållande 2 x 10 5 bröstcancerceller / 50 ^, och förbereda pluggar ben vax för att immobilisera benfragment i kultur. Skär en P200 mikropipett spets i 3 bitar och använd den smala änden av den största biten i en "cookie cutter" sätt att skära små (~ 35 mg) benbitar vax. Använd den breda änden av den minsta delen för att mata ut de benvax pluggar i en petriskålför lagring.
- Lägg en bit ben vax vid klockan 12 på varje brunn och tryck försiktigt ned med en steril-handske pekfinger.
- Pipettera 50 | il av cellsuspension innehållande 1 x 10 5 bröstcancerceller i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i centrum av varje brunn i en 6-brunnsplatta. (Alternativt fröceller i ett dispergerat mönster om så önskas.) Placera plattan i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 45 minuter för att främja cellvidhäftning.
- Placera 1 benfragment på 1 bit benvax för varje experimentell väl och tryck lätt med rongeur att säkra den. Utföra experiment i tre exemplar, så att 3 benfragment från en given THR provet placeras i de tre brunnar, medan de nedre tre brunnar innehåller benvax endast som kontroller.
- Med hjälp av en 5 ml pipett, sakta och försiktigt leverera 5 ml DMEM-10% FBS till sidan av varje brunn för att undvika att rubba bröstceller eller benfragment. Placera plattan i en 3776; C vävnadskultur inkubator under 20 till 24 h.
- För att utföra mareld imaging (BLI) ta bort plattan från kuvösen och lägger luciferinsubstrat (för att uppnå en koncentration av 300 mikrogram / ml) till varje brunn. Bild plattan omedelbart på en IVIS Imaging plattformen med hjälp av följande parametrar: f-stop på 1, liten binning, exponeringstid på 1 sek, nivå D. Mät signalstyrkan för varje samt genomsnittlig radians (fotoner / sekund / kvadratcentimeter / steradian).
- Använd bildbehandlingsprogram för att definiera områden av intresse (ROI) för att kvantifiera den genomsnittliga strålglans för alla försöks- och kontrollbrunnar. Exportera genomsnittliga Radiance värden till ett Excel-ark för att utföra statistik och generera grafer.
4. samodling bröstcancerceller Ympade direkt på benfragment att studera Colonization och cellantal
- Använd pincett för att placera benfragment direkt in i de tomma brunnar i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta (1 fragment / brunn).
- Pipette en 50 | il cellsuspension droppe av DMEM-10% FBS innehållande 1 X oktober 3-06 bröstcancerceller direkt på toppen av varje benfragment. Placera plattan i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 45 minuter för att främja cellvidhäftning. Försiktigt till 1-2 ml DMEM-10% FBS i sidan av varje brunn så att fragmentet är helt nedsänkt i mediet. Inkubera plattan i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 20 till 24 h.
- Efter inkubation använder pincett för att överföra varje benvävnad fragmentet till en färsk 24-brunnsplatta innehållande 1 ml DMEM-10% FBS i varje brunn. För att utföra BLI, följ steg 3,6-3,7 ovan. Dessutom kan fragment ses med hjälp av ett fluorescensmikroskop, eller spolas för att erhålla märgen populationen för analyser av bröstcancercellantal och egenskaper, såsom beskrivs i steg 6.
- För att förbereda de intakta fragment för kvalitativ utvärdering av fluorescensmikroskopi efter BLI, pipett 5 pl fluorescerande bisfosfonat märkningslösning (preupprättas enligt tillverkarens anvisningar) i varje brunn för att märka de mineraliserade nålar av benfragment. Inkubera plattan i vävnadsodlingsinkubator under ytterligare 24 h.
- Efter 24 timmar av kultur i fluorescerande bisfosfonat märkning lösning, använd pincett för att överföra fragmenten till vävnadsodlingsplattor innehållande fenolrött fritt medium och vyn med ett fluorescensmikroskop konfigurerad att bild GFP (485 nm) och bisfosfonat etikett (680 nm).
5. Att mäta Migration av bröstcancerceller till benvävnad Fragment och Odlade Bone Fragment Supematanter
- Migration mot benvävnad odlingssupematant.
OBS: Utför experiment i tre exemplar, så att 3 fragment från en given THR provet används för att generera 3 supernatanter. För varje experiment, är migrationen jämfört över tre brunnar som innehåller ben supernatanter vs. tre brunnar som innehåller enbart kontrollmedium.- Generera ben tisstämma supernatanter genom att placera benfragment i brunnarna hos en 12-brunnars platta innehållande 2,2 ml DMEM-10% FBS per brunn. Kultur i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 24 timmar. Dra ut mediet vid 24 timmar och ersätta med 2,2 ml färskt DMEM-10% FBS. Treat kontrollbrunnar innehållande DMEM-10% FBS på samma sätt.
OBS: Mediet ändras vid 24 tim för att avlägsna faktorer som utsöndras som svar på vävnadstrauma följd av kirurgi. Eftersom benvävnad supernatanter genereras i FBS-innehållande medel, brunnar innehåller FBS-medium enbart ingår att kontrollera för bidrag FBS till bröstcancercellmigration. - Vid 48 h, samla 0,9 ml av varje supematant / kontrollmedium och pipetten i brunnarna hos en mottagningsplatta. Skären kommer senare att placeras in i dessa brunnar. Inkubera mottagaren plattan i vävnadsodling inkubatorn samtidigt sådd skären. Obs: Den återstående supernatanten (~ 1 ml efter avdunstning) kan tas för analys av secretome factors om så önskas 44.
- Att ympa Transwell skär, placera dem i en standard, tom 24-väl vävnadsodlingsplatta. Pipettera 350 | il cellsuspension innehållande 1 x 10 5 bröstcancerceller i DMEM-10% FBS på den övre, inre membranytan av varje insats som visas i figur 1A. Placera 24-brunnsplatta innehållande de sådda skär in i den 37 ° C vävnadskultur inkubator under 45 minuter för att främja infästning.
- När cellerna har fäst till skären, använd pincett för att överföra skären till mottagaren platta enligt tillverkarens instruktioner. Vinkel varje insats när du placerar den i mottagaren väl för att förhindra bubblor bildas mellan insatsen membranet och mottagaren väl supernatanten. Inkubera mottagaren plattan med skär för 20 h i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator.
OBSERVERA: Kontrollera bottensidan av mottagaren platta för bubblor mellan insatsen membranet och mottagaren väl supernatant. Om bubblor är synliga, ta bort de särskilda insatserna och placera dem igen i mottagaren väl tills inga bubblor. - Efter 20 tim använda pincett för att ta bort inläggen från mottagaren plattan. Användning av procedurerna i steg 3,6-3,7 utför BLI till bilden cellerna som har migrerat in i och fästa till botten av mottagarens plattbrunnarna.
- Generera ben tisstämma supernatanter genom att placera benfragment i brunnarna hos en 12-brunnars platta innehållande 2,2 ml DMEM-10% FBS per brunn. Kultur i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 24 timmar. Dra ut mediet vid 24 timmar och ersätta med 2,2 ml färskt DMEM-10% FBS. Treat kontrollbrunnar innehållande DMEM-10% FBS på samma sätt.
- Migration mot ben vävnad fragment.
OBS: Utför experiment i tre exemplar, så att 3 fragment från en given THR provet placeras i tre separata inlägg, och 3 glaspärlor placeras i tre separata insatser som kontroller.- Förbered mottagaren plattan genom att pipettera 0,9 ml DMEM-10% FBS i varje brunn. Placera den i vävnadsodling inkubatorn medan du förbereder skären.
- För att ympa skären, invertera dem på ytan av en plast mikrofugrör låda som har ett lock. Pipettera en 50 pl cellsuspension droppe av DMEM-10% FBS innehållande 1 x 10 5 bröstcancerceller directly på den yttre, nedre ytan på varje insats membran (som är vänd uppåt på de inverterade skär). Täck röret rutan mikrofugrör med locket knäckt öppna och överföra den till 37 ° C vävnads inkubator i 45 minuter för att främja cellbindning.
- Överför mikrofugrör rutan till vävnadsodling huven, och använda pincett för att vända de seedade skär rätt sida upp och överföra dem till brunnarna i mottagarens plattan. Pipett 0,450 ml DMEM-10% FBS i varje insats kopp. Använd pincett, överföra en benvävnad fragment (~ 3 mm) i varje förberedda insats cup. Eventuellt använder glaspärlor som negativa kontroller i ytterligare brunnar. Placera plattan i en vävnadsodlingsinkubator under 20 timmar.
- För att mäta migration bereds en standard 24-och vävnadsodling skylt som innehåller 1 ml DMEM-10% FBS per brunn. Avlägsna mottagaren plattan från inkubatorn och använda pincett för att överföra benfragmenten och pärlor från varje insats till separata brunnar i standardplattan. Lägg luciferinsubstrat (för att uppnå en slutlig koncentration av 300 mikrogram / ml) till varje brunn och utföra BLI användning av förfarandena i steg 3,6-3,7.
6. Ytterligare för- och efter experimentella analyser
- Analys av spolas märg.
- Överför ett ben fragment i en 70 ìm cell sil placerad på toppen av en 50 ml koniska rör. Använd en 10 ml spruta med en 25 G nål för att kraftfullt spola fragmentet med 10 ml PBS för att erhålla en suspension av benmärgsceller i den koniska röret. Centrifugera cellsuspensionen under 3 minuter vid 300 xg och 21 ° C, aspirera supernatanten och resuspendera de pelleterade cellerna i PBS eller annan önskad lösning för flödescytometri.
OBS: resuspension volymer kommer att variera beroende på storleken av cellpelleten efter centrifugering, och tillämpning. - För viabilitetsanalyser ~ 75-300 il volymer av PBS är lämpliga, och dessa suspensioner kan analyseras med användning av kommersiellt tillgängliga fluorescence baserade viabilitetsanalyser enligt tillverkarens instruktioner, pipetterades i en konventionell hemocytometer, och räknades med ett inverterat fluorescensmikroskop.
- För flödescytometrisk analys eller sortering baserad på detektion av GFP-positiva bröstcancerceller, resuspendera cellpelleten i 1 ml PBS innehållande 2% FBS, 2 mM EDTA och 10 mM HEPES så att koncentrationen är en x 10 6 celler / ml.
- Överför ett ben fragment i en 70 ìm cell sil placerad på toppen av en 50 ml koniska rör. Använd en 10 ml spruta med en 25 G nål för att kraftfullt spola fragmentet med 10 ml PBS för att erhålla en suspension av benmärgsceller i den koniska röret. Centrifugera cellsuspensionen under 3 minuter vid 300 xg och 21 ° C, aspirera supernatanten och resuspendera de pelleterade cellerna i PBS eller annan önskad lösning för flödescytometri.
- H & E färgning och immunohistokemi.
- För att bearbeta de fragment för hematoxylin & eosin (H & E) färgning och / eller immunohistokemi, placera fragmenten i plastkassetter märkta med ett nummer 2 penna, och dränka i en behållare fylld med 10% formalin i 24 timmar.
- Process vävnader för paraffininbäddning, sektione och färgning använder rutinprotokoll som inkluderar en urkalkning steg för att redogöra för de mineraliserade spicules inom varje fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolera vävnadsfragment från femurhuvuden
Femurhuvuden samlades från lika många manliga och kvinnliga patienter (44-90 år) som genomgår elektiv höftledskirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Varje kasselårbenshuvudet innehåller en liten del av den övre femur, vilken härbärgerar trabekulär benvävnad består av mineraliserade nålar och märg. Denna vävnad är tillgänglig genom den kirurgiskt exponerade tvärsektion av axeln (Figur 2A) med användning av en kirurgisk rongeur att extrahera små fragment. Den histologi av de extraherade bitar visas i figur 2B, avslöjar de mineraliserade och märgkomponenter. Utseendet på de extraherade bitarna varierar mellan femurhuvuden erhållits från olika patienter, allt från gult till rött, beroende på innehållet i märgen adipocyt enligt figur 2C. We demonstrera användningen av dessa ben vävnadsfragment i kortsiktiga analyser för att mäta dynamiska interaktioner med bröstcancerceller konstruerade för luciferas och EGFP uttryck.
Co-odling bröstcancerceller intill till benfragment att mäta Bröst Cell Proliferation använder Bioluminescence Imaging
Den odlingsplatta setup för samodling MDA-MB-231-Fluc-EGFP bröstcancerceller angränsande till immobiliserade benfragment att mäta bröstcellproliferation med användning BLI visas i figur 3A. BLI av plattan vid 24 h illustreras i figur 3B, och BLI signal från tre experiment, vilket visar förbättrad cellproliferation i närvaro vs frånvaro av benfragment visas i figur 3C.
Co-odling bröstcancerceller Ympade direkt på benfragment att studera Colonization och cellantal
Kolonisering av MCF-7-Fluc-EGFP calnar såddes direkt på benvävnadsfragment, mätt via BLI vid 24 h illustreras i figur 4A, som visar minskad signal förbunden med minskande såddtäthet. En direkt sådd fragment visas vid 48 h i figur 4B, efter märkning med fluorescerande biphosophonate reagens, såsom avbildas genom fluorescensmikroskopi att avslöja koloniseringen av bröstcancerceller inom de mineraliserade och märgutrymmena. Dessa kolonisering mönster är också visat i direkt-seedade fragment bearbetade efter experimentellt för immunhistokemisk färgning med cytokeratin antikropp (figur 4C och 4D).
Mätning Migration av bröstcancerceller till benvävnad Fragment och Odlade Bone Fragment Supematanter
Migration av MDA-231-Fluc-EGFP celler inom porösa migrationsmembran mot benvävnad odlingssupernatanter och in benfragment detekteras med BLI som visas i figur 5. En robust migrationsmönster mot odlingssupematanter härrör från tre fragment av en given THR provet visas i figur 5A, som skildrar en ökad migration i brunnar som innehåller benvävnad supernatant kontra kontrollmedium. Även om inte alla migrationsmönster är denna robusta, migration mot ben supernatanter är vanligtvis större än mot kontrollmedium i de flesta experiment. Ett typiskt migrationsmönstret i benfragment från en given THR provet visas i figur 5B.
Analys av spolas squash
Dessutom visar vi att märgceller kan spolas från koloniserade fragment, och att spolas bröstcancerceller kan detekteras bland dessa celler genom flödescytometri (figur 6B), BLI (fig 6C), och / eller fluorescensmikroskopi (figur 6D) .
Mätning Viabilitet
Figur 1: Ställ in på migrationsexperiment. (A) I "framåt migrations" experiment, är mottagare brunnar fyllda med tidigare genererade benvävnad odlingssupernatanter. Bröstcancerceller som är seedade på de inre, övre ytor Transwell membran i skärsbägare som innehåller DME-10% FBS migrera genom membranen och fäst till botten av brunnarna för detektion av BLI. 
Figur 2: Isolera vävnadsfragment från femurhuvuden. (A) Extrahera fragment av bentrabekeln med en kirurgisk rongeur. (B) Histologi av fragment fast direkt efter extraktion från lårbenet vävnad visar mineraliserade (vit pil) och märg (svart pil) fack. (C) Trabekulärt benfragment utvinns från två olika femurhuvuden visar variation i rött vs gul märg innehåll. 
Figur 3: Co-odling bröstcancerceller intill benfragment att mäta bröstcellproliferation använder bioluminiscens imaging. (A) Kultur Platta setup för co-odling MDA-MB-231-Fluc-EGFP bröstcancerceller intill immobiliserade benfragment, som anges med pilar: cellfläckar (blå), benvax (svart), och benfragment (röd ). Positionen för benvax noteras också av en svart streckad cirkel. Plattan visas före tillsats av medium. De översta tre brunnarna innehåller benfragment tjudras till benvax och de nedersta tre brunnarna innehåller endast benvax. (B) BLI av plattan vid 24 h. (C) Kvantifiering av BLI signaler för MDA-MB-231-Fluc-EGFP-celler växer i närvaro (lila staplar) jämfört frånvaro (gröna staplar) Av fragment från tre THR prover odlas enligt beskrivningen. För varje THR exemplar, staplar representerar genomsnitts BLI värden som uppmätts över 3 fragmentinnehållande - vs. 3 kontrollbrunnar. Detta resultat visar högre nivåer av proliferation i närvaro vs frånvaro av benfragment. Felstaplar representerar standardavvikelsen (p <0,01). Reproducerad med tillstånd 44. 
Figur 4: Detektion av bröstcancerceller ympats direkt på benfragment. (A) Kolonisering av MCF-7-Fluc-EGFP celler seedade direkt på benvävnad fragment som upptäcks av BLI vid 24 tim, visande minskad signal i samband med sjunkande seedning densitet. (B) Direkt-seedade fragment vid 48 timmar efter sådd, och 24 h efter märkning med fluorescerande biphosophonate reagens. Fluorescensmikroskopi avslöjar EGFP + bröstcancerceller somförknippade med en mineraliserad spikler (grön pil), och med fettceller i benmärgen facket (vita pilar). Dessa kolonisering mönster är också visat i direkt-seedade fragment som behandlats för immunhistokemisk färgning med en AE1 / AE3 pan-cytokeratin antikropp efter 72 timmar av samodling (C) och (D). I (C) cytokeratin-positiva bröstcancerceller, betecknade med pilar, observeras i anslutning till adipocyter i märgutrymmet. I (D) en cytokeratin-positiv bröstcancer cell observeras i anslutning till en mineraliserad spikler. (C) och (D) som återges med tillstånd 44. 
Figur 5:. Mätning migration av bröstcancerceller till benvävnadsfragment och odlade benfragment supernatanter Migration av MDA-MB-231-fLuc-EGFP celler inom porösa migrationsmembran mot benvävnad odlingssupernatanter och in benfragment som upptäckts vid 24 tim med BLI. (A) BLI signal avslöjande förbättrad migrering mot odlingssupematanter härrör från en given THR prov kontra kontrollmedium. (B ) BLI signal visar migrationsmönster av bröstcancerceller i 3 benfragment från en enda THR exemplar. Bone vävnadsfragment betecknas med vita streckade cirklar. Kontrollbrunnar innehållande glaspärlor visas på botten. 
Figur 6:.. Detektion av MDA-MB-231fLUC-EGFP-celler i squash spolas från koloniserade fragment (A) Fragment utan (vänster) och med (höger) koloniserat bröstcancerceller, såsom detekteras av BLI (B) Analys av squash spolas från fragmenten (A) genom flåg cytometri. EGFP-positiva bröstcancerceller detekterades i märg spolas från Bli-positiva fragment, men inte den Bli-negativa fragment. (C) BLI-detektion av bröstcancercellkolonier som härrör från odlingen av märg spolas från en Bli-positiv fragmentet. (D) Fluorescensmikroskopi av märgen utrymmet spolas ur ett BLI-positiv fragment, visar MDA-MB-231fLUC-EFGP celler i ett fält av benmärgsceller. 
Figur 7:. Mätning livskraft viabilitet för märgceller spolas från vävnadsfragment isolerade från 4 THR prover omedelbart efter samlingen och vid 24, 48, 72 timmar och 6 dagars odling i DMEM-10% FBS. Medium byttes vid 24 och 72 tim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehra et al. Har tidigare beskrivit döden insamling och analys av skelettprover från metastaserande prostatacancer patienter skördas vid obduktionen, avslöjar högkvalitativa vävnader och validera användningen av mänskliga ben prover för att studera metastaser processen 47. Här har vi beskrivit protokoll för insamling, bearbetning och användning av benvävnadsfragment mänskliga erhållits från kasse femurhuvuden efter THR kirurgi i en kortsiktig samodlingssystemet att studera bröstcellmigration, kolonisation och spridning. Cirka 300.000 höftledsoperationer utförs årligen i USA (American Academy of Orthopaedic Surgeons, Orthoinfo.aaos.org), och dessa prover typiskt kastas. En av de vanligaste indikationerna för denna operation är artros i höftleden, vilket leder till en gradvis nedbrytning av brosk ytor som täcker lårbenshuvudet, vilket resulterar i ledvärk. Under total höftleds replacement kirurgi en liten del av den övre femur avlägsnas tillsammans med lårbenshuvudet. Lårbenet är en vanlig plats för bröstcancermetastaser 48, och dessa provkroppar innehåller trabekulärt benvävnad, platsen för metastaserad bröstcancer cellkolonisering. De flesta patienter som genomgår höftleds är 50-80 år gammal, en åldersgrupp som konsoler de år av topp förekomsten bröstcancer. Således är dessa vävnader utgör en värdefull resurs för att studera bröstcancer benet metastaserad nisch.
Det finns flera viktiga steg och överväganden i samband med dessa tekniker. För det första är en god kvalitet kirurgisk ronguer viktigt för att extrahera de små trabekulära benfragment medan du håller lårbenshuvudet i motsatt, behandskade hand. Tång fungerar inte eftersom de inte är robust nog för att extrahera trabekulärt vävnad som innehåller mineraliserade spicules. En annan viktig faktor i dessa analyser avser bröst cellinje hantering och aging, särallt i fråga om migrationsanalyser. Långsiktig passage och / eller en förändring i trypsinization förfaranden kan leda till den sekventiella urval av fler / mindre envisa cellpopulationer, potentiellt förändra de flyttande svar i experiment. En annan fråga handlar om standardisering av experiment, med tanke på variationen av kirurgiska vävnaderna från patienter i olika åldrar och sjukdomstillstånd. För att lösa detta, anställer vi en intraindividuell experimentell design där alla variabler testas i tre exemplar (t.ex. över tre fragment / experimentella brunnar vs. tre fragment / kontrollbrunnar) med hjälp av fragment från en given patientens kirurgiska exemplar. Variabler kan testas med hjälp av denna design på prover från flera patienter, och analyserades för statistisk signifikans med den parade T-test för data genomsnitt över replikat, och / eller en inom-ämnen envägs ANOVA för data över replikat. Och slutligen, är en primär begränsning av denna metod den korta fönster av VIABbilitet under explantat kultur.
Våra mätningar avslöjade märg viabilitet av ~ 90% på dagen för insamling, i linje med lönsamhets mätvärdena från benmärgsaspirat 49. Med tiden dock observerade vi en successiv nedgång under dagarna två och tre, med dramatiska förlust av livskraft genom dagen 6. Även om vi inte har mätt livskraft den mineraliserade facket, kvalitativa observationer tyder på att det finns en liknande nedgång i lönsamheten för ben lining osteoblaster och osteocyter, som sett i figur 4D. Utifrån dessa experiment har vi begränsat våra kulturexperiment till korttidsstudier som utförts under 48 eller 72 timmar. Preliminära experiment (ingår ej) visade att lönsamheten kan förbättras med hjälp av kommersiellt tillgängliga medier formulerade för att upprätthålla benmärgsceller. Men vi har inte präglat märgcellpopulationer i dessa experiment, och vet inte om de förbättrade lönsamhets resultaten från den valdautväxt av vissa märg cellsubpopulationer. Utvecklingen av protokoll för att upprätthålla och utöka livskraft dessa explants kommer att vara viktigt att föra detta modellsystem.
Även om denna modell är begränsad till korta tidsperioder, dess viktiga fördelar i förhållande till andra metoder inkluderar följande funktioner: 1) intakta 3-dimensionella vävnader hyser relevanta celltyper som utgör den mänskliga ben mikro, 2) tillgänglighet till benet mikro för övervakning och störande dynamiska interaktioner, 3) ett stort antal fragment per exemplar för upprepade experiment, och 4) låg kostnad jämfört med djurmodeller.
Medan vi har beskrivit analyser för att studera bröstcancer metastasering till ben, kan dessa prover och metoder lätt utsträckas till studiet av andra bensökande maligniteter såsom prostatacancer, liksom andra skelett patologier. Även om vi har använt de kasse femurhuvuden primärt som en såKä lla av vävnadsfragment, dessa prover utgör också en ytterligare källa till mänsklig benmärg, som traditionellt samlas in via benmärg aspiration från unga volontärer. Och slutligen, medan vi har beskrivit metoder använder cellinjer manipulerade för mareld och fluorescens, de flesta av de förfaranden kan modifieras för användning med andra celler om dessa cellinjer och / eller avbildningsplattformar är inte tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dessa studier har finansierats delvis med bidrag från Alternative forskning och utveckling Foundation (107.588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), och California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi tackar Drs. Andrew Wilber och R. Scott McIvor för den generösa donationen av deras
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
