Protocol
1. خطوات لتنفيذ يوم قبل الفحص
- اختيار L4 مرحلة الديدان إلى الطازجة المتوسطة النمو الخيطية (NGM) لوحات مع المصنف حشيش OP50 E. القولونية، والثقافة لهم في 20 CO / N. كل شرط الفحص يتطلب 10 الديدان. اختيار وجود فائض من الديدان للسماح O / N فقدان الديدان.
- الحيوانات الفحص فقط التي هي البالغين اليوم الأول؛ العديد من المسوخ تنمو بسرعة أبطأ من النوع البري. ضبط توقيت التقاط لسلالات التي لديها تأخر في النمو حتى يتسنى لجميع الحيوانات المختبرة هم من البالغين اليوم الأول.
2. خطوات إلى تنفيذ يوم من الفحص
- التحضير للفحص:
- أداء المقايسات على القياسية غير المصنف 60 × 15 ملم لوحات NGM. تجف كل من لوحات لاستخدامها في 37 مئوية لمدة 2 ساعة، مع أغطية قبالة. لكل محاكمة التجريبية، استخدم أربع لوحات NGM المجففة. هذه ستكون ملي و 400 ملي 0 لوحات الإيثانول فحص والمرافق لوحات التأقلم الخاصة بهم.
ملاحظة:استخدام لوحات NGM مهم هنا. الاختلافات في تكوين لوحات، وبخاصة الأسمولية، ويمكن أن تؤثر بقوة على الاستجابة للجرعة من الايثانول على السلوك، وهذا هو الواجب، جزئيا على الأقل، إلى تغيرات في كمية الإيثانول التي تراكمت لدى الحيوانات 20. NGM أجار 160 الميلي أسمول. - بعد التجفيف، وتزن كل واحدة من لوحات NGM غير المصنف لاستخدامها في مقايسة ولاحظ الوزن. تحديد حجم وسائل الإعلام في لوحات على أساس الوزن من لوحة فارغة. لتقريب تحويل الوزن من أجار للحجم، افترض أن وسائل الإعلام يزن نفس حجم مساو من الماء.
ملاحظة: تم العثور على نتائجنا أكثر اتساقا مع وسائل الإعلام NGM التي المجففة بما فيه الكفاية أن حجم الأصلي 10 مل لديه حجم ما بعد التجفيف بين 8،3-8،9 مل. بديلا للفي الوقت الجافة 2 ساعة هو لتجف حتى تصل لوحات هذا النطاق حجم لحساب الفروق في حاضنات. - تذوب 4 حلقات النحاس (القطر الداخلي من 1.6 سم) في سطح كل من لوحات ليكون بمثابة حظائر للتراكيب وراثية مختلفة أو مجموعات العلاج من worms.Grasp كل حلقة مع ملقط، والحرارة في لهب (لهب قوي من موقد بنسن يعمل بشكل جيد) لحوالي 3 ثانية. وضع على الفور الطوق على طبق من ذهب وهو لا يزال يشغل الحلبة مع ملقط لمنعه من "تخطي".
- تأكد من أن عصابة تقع شقة ضد سطح أجار عن طريق الضغط برفق مع ملقط في عدة نقاط على الحلبة. عند وضع الحلبة، وتوخي الحذر من ترك مساحة لثلاث حلقات إضافية.
- إذابة النحاس حلقات إضافية ثلاثة إلى السطح من لوحة، مع الحرص على وضعها باعتبارها قريبة من بعضها البعض ممكن حتى يتسنى لجميع أربعة سوف تكون في مجال الرؤية من الكاميرا.
ملاحظة: جعل ختم جيدة مع آغار ضروري للحفاظ على الديدان في الحلقات خلال الفحص. من غير المرجح أن جعل ختم الصحيح مع أجار الحلقات التي تخطي حول على لوحة وقد ندبة آغار، والذي يسمح لتحفر الديدان وتتعارض مع الرؤية والديدان. - لكل لوحة الفحص إعداد المرفقة لوحة "التأقلم"، والتي ينبغي أن تجفف وغير المصنف ولن تحصل على أي الإيثانول. وضع أربع حلقات من النحاس على هذه اللوحات.
- تسمية الجزء السفلي من لوحات بجوار كل حلقة مع سلالة دودة لاستخدامها في الحلقة، مع الحرص على عدم الكتابة في مجال الرؤية من الحلبة نفسها. تطابق العلامات على لوحة فحص مع المرافقين لوحة التأقلم لها.
- حساب كمية الإيثانول بنسبة 100٪ لتضيف إلى كل لوحة الفحص بحيث التركيز النهائي هو 0 ملم أو 400 ملم الإيثانول (الوزن للحجم). لكل تجربة (ن = 1)، سوف يكون هناك واحد 0 ملي واحد 400 ملي لوحة الإيثانول. لوحات التأقلم لا يحصلون الايثانول. إضافة الإيثانول، pipetting لفي جميع أنحاء سطح اللوحة. استخدام فيلم مختبر لختم لوحة والسماح لها لكي تتوازن على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 2 ساعة.
- عندما انقضت 1.5 ساعة، تبدأ الخطوة التأقلم للمقايسة، خطوة 2.2.
- أداء المقايسات على القياسية غير المصنف 60 × 15 ملم لوحات NGM. تجف كل من لوحات لاستخدامها في 37 مئوية لمدة 2 ساعة، مع أغطية قبالة. لكل محاكمة التجريبية، استخدم أربع لوحات NGM المجففة. هذه ستكون ملي و 400 ملي 0 لوحات الإيثانول فحص والمرافق لوحات التأقلم الخاصة بهم.
- أداء تنقل الفحص: لوحات الفحص
- نقل بعناية 10 الديدان من كل مجموعة التجريبية لمركز خاتم من النحاس على لوحة التأقلم. إزالة أي طعام غير مرئية على أجار في هذه المرحلة عن طريق كشط بلطف مع اختيار دودة. تختلف الترتيب الذي يتم وضع المجموعات التجريبية على لوحات عبر التجارب التجريبية بحيث لا يتم وضع نفس الضغوط على لوحات في نفس الترتيب عبر المحاكمات.
ملاحظة: إن الهدف هو نقل الحيوانات إلى لوحة مع كميات ضئيلة من الطعام، لأنه إذا كان يتم نقل الطعام على لوحة التأقلم على لوحة فحص والديدان تجميع حول الغذاء وتأثير المخدرات على تنقل سيتم حجبه. - يجب الحرص على عدم كسر سطح أجار مع اختيار، وهذا سوف يسمح الديدان إلى الجحر وسوف تعطيل الفحص. احتضان الديدان في RT لمدة 30 دقيقة.
- ضمان وجود فاصل زمني مناسب بين المبدئية من كل لوحة. مجرب ذوي الخبرة يمكن ان تتحرك الحيوانات 40، 10 / حلقة لمدة 4 حلقات في <1.5 دقيقة، ولكن أي فترة تصل إلى 2 دقيقة غير مقبول. الفحص القياسية ديه الأفلام تسجيل في 10-12 دقيقة و30-32 دقيقة من التعرض لكلا 0 ملي و 400 ملي الايثانول.
- بدء لوحة التأقلم لالتعرض 0 مم والتأقلم لوحة لتعرض 400 ملي حوالي 2 دقيقة و 30 ثانية بعيدا للسماح لانقاذ من ملف الفيلم الأول قبل يجب أن يبدأ الفيلم الثاني.
- بعد فترة التأقلم 30 دقيقة، ونقل الديدان من لوحات التأقلم لوحات الفحص. نقل الديدان لوحات الفحص (0 ملم أو 400 ملم الإيثانول) في نفس الترتيب الذي تمت إضافتها إلى لوحة التأقلم، تتبع توقيت بين الاكمال من كل لوحة. ختم لوحة مع فيلم مختبر لتقليل الخسائر في الإيثانول لتبخير.
- Uحد ذاتها حركة شفط مع اختيار دودة بالارض فوز رقيقة لجمع الديدان على رأس المعول بالارض. أداء نقل الديدان من لوحة التأقلم غير المصنف على لوحة الفحص دون استخدام البكتيريا، والذي يستخدم عادة في نقل الديدان لأنها تساعد على الغراء الدودة لبيك.
ملاحظة: السرعة التي يتم نقل الحيوانات في هذه الخطوة مهمة جدا لأنه سيتم يتعرض الأولى الديدان على لوحة لالإيثانول أطول من الديدان مشاركة تضاف الى لوحة، ويمكن أن تظهر نقطة زمنية سابقة بعض الآثار التي تعتمد على الوقت. هذا هو السبب الرئيسي لالدورية التي توضع سلالات على طبق من ذهب لأول مرة عبر مكررات التجريبية.
- نقل بعناية 10 الديدان من كل مجموعة التجريبية لمركز خاتم من النحاس على لوحة التأقلم. إزالة أي طعام غير مرئية على أجار في هذه المرحلة عن طريق كشط بلطف مع اختيار دودة. تختلف الترتيب الذي يتم وضع المجموعات التجريبية على لوحات عبر التجارب التجريبية بحيث لا يتم وضع نفس الضغوط على لوحات في نفس الترتيب عبر المحاكمات.
- أداء تنقل الفحص: التصوير
- استخدام مزيج المجهر / الكاميرا التي تسمح للتصوير المتزامن لجميع الحلقات الأربع في مجال الرؤية (حوالي 42x42 مم 2 مربع)، مثل الهدف المجهر 0.5X، 0.8x التكبير وكاميرا مع 2048x2048 7.481؛ م بكسل CCD.
- استخدام الإضاءة حتى عبر مجال الرؤية، والذي يساعد في التعرف على الكائن في الخطوة عتبة شدة (انظر أدناه). A 3 "X3" الخلفية يعمل بشكل جيد.
- صورة الديدان على طبق من ذهب وضعه من جانب وسائل الإعلام حتى (غطاء أسفل)، والذي يولد المقابل أن يتم فقدان عند استخدام الإضاءة الخلفية مقارنة مع المجهر التقليدية التي تنتقل عن طريق مصدر الضوء.
- تحضير صورة برامج التحليل لالتقاط الأفلام الوقت الفاصل بين الديدان تتحرك. تعيين البرنامج لالتقاط 12 بت الصور الرمادية النطاق كل 1 ثانية، كفيلم 2-مين (120 الإطار). للحد من حجم ملف الإخراج، في حين لا يزال الإبقاء على دقة وضوح الصورة كافيا، استخدم وضع binning 2X2 إلى التقاط الصور 1024x1024 بكسل.
- تسجيل الأفلام. بدء تسجيل فيلم 120 إطار لوحة الأولى (0 ملي الإيثانول) وضعت 10 دقيقة بعد الديدان الأخيرة على أن اللوحة. حفظ ملف الفيلم.
- تسجيل لوحة الثانية (400 ملي الإيثانول). كرر هذه العملية لوضعت كل من لوحات ابتداء 30 دقيقة بعد الديدان الأخيرة على لوحة الأولى (0 ملي الإيثانول) لالتقاط 30-32 نقطة زمنية دقيقة لكل التعرض.
ملاحظة: السماح الوقت الكافي لحفظ ملفات الصور بعد كل دورة التقاط قبل البدء في تسجيل لوحة القادمة ليتم تحليلها. - من أجل مستقبل التدقيق من الأفلام المحفوظة وللسماح لهذه الأفلام ليتم فتحه وتحليلها من قبل برامج أخرى المجال العام البرمجيات المفتوحة المصدر والتصوير، مثل يماغيج 28، وتحويل نسخة من كل فيلم إلى 256 ملفات TIFF مقياس الرمادية 8 بت.
ملاحظة: البرنامج تحليل الصور الموصوفة هنا يستخدم تنسيق ملف الملكية.
- تحليل الأفلام باستخدام برنامج ImagePro.
- مرة واحدة القبض، وتحليل الأفلام باستخدام صورة-برو بلس البرامج أو ما يعادلها.
ملاحظة: مجموعة متنوعة من البرامج الأخرى تتبع الكائن يتوفر التي تم استخدامها لتعقب متعددة C. بنجاح ايليجانس في وقت واحد 29 و مثلالبرنامج يمكن أن تكون بديلا معقول لذلك توصف هنا تستند الخطوات تحديد الكائن على مبادئ مماثلة. الطريقة الموصوفة يتصل-صورة برو بلس إصدارات البرامج 6،0-6،3 و 7.0 إصدارات أحدث من صورة برو بلس البرامج قد يكون الاختلافات الطفيفة. - تحليل الأفلام في 2 دقيقة (120 الإطار) قطاعات. أولا، تطبيق عامل تصفية الصور لشد الخلفية وتعزيز النقيض من الكائنات دودة. حدد مرشح على النحو التالي: القائمة> عملية> مرشحات> تعزيز> تسطيح: المعلمات: الخلفية = الظلام. ميزة العرض = 20 بيكسل.
- إعادة حفظ الأفلام بعد خطوة الترشيح ولكن الاحتفاظ دائما الفيلم الأصلي في شكله فلتر.
- تحليل تنقل الحيوانات في كل حلقة على حدة مع منطقة دائرية ذات الاهتمام (ROI) التي يتم وضعها والحجم لتتداخل مع خاتم من النحاس. تحديد وتتبع الديدان مع القائمة> قياس> المسار كائنات ... القيادة؛ هذا إحضار تتبع Dآتا نافذة الجدول. الزر خيارات تتبع يسمح مسارات محددة لاستبعاد وتحد من أي التحف التجريبية.
- ضمن علامة التبويب تتبع السيارات، استخدم المعلمات التالية: المسار المعلمات: الحد السرعة (دائرة نصف قطرها البحث) = 400 ميكرون / الإطار، الحد تسريع = السيارات، الحد الأدنى للمجموع طول المسار = 400 ميكرون، سائدة نوع الحركة = الفوضى. الكائنات في المسارات المعلمات: السماح مسارات جزئية = نعم، مين طول = 21 الإطارات، وتتبع عمق التنبؤ = 1 الإطار.
- لبدء عملية تتبع، انقر فوق البحث عن جميع المسارات تلقائيا زر وظيفة لإظهار مربع الحوار عدد / خيارات الحجم ومربع الحوار تتبع. حدد الخيار يدوي لاختيار المدى كثافة في مربع الحوار عدد / الحجم، والذي يوفر خطوة عتبة مهمة يستخدم كثافة مقياس الرمادية للبكسل دودة لتسليط الضوء على وجوه دودة للتحليل وتجاهل أخف بكسل الخلفية.
- ضبط سلي عتبة كثافةDERS (واحد لضبط الحد الأعلى، واحدة لتعيين الحد الأدنى) لإنشاء مجموعة شاملة تسلط الضوء على كافة الكائنات المظلمة. وهناك مجموعة من 0-1،500 على مقياس من 0-4،095 هو نقطة انطلاق جيدة لضبط الدقيقة.
- تطبيق عامل تصفية حجم استبعاد الأشياء التي هي أكبر وأصغر من كائن دودة واحد، مثل خاتم من النحاس وأي حطام على لوحات. تعيين معلمتين حجم للقيام بذلك التي تغطي الأحجام للديدان الفردية في مجموعة متنوعة من المواقف مع قياس> تحديد قياسات عنصر القائمة في مربع الحوار خيارات الكونت / الحجم. (المدى المساحة: 28،000-120،000 ميكرون 2 ومجموعة محيط: 600-2،500 ميكرون).
- إذا سلالة متحولة هو أصغر بكثير أو أكبر من غيرها من الحيوانات على لوحة ليتم تحليلها، وتوسيع نطاق إعدادات التصفية للاعتراف الكائن لاستيعاب أحجام مختلفة من سلالات أولا قبل تتبع الحيوانات بحيث الإعدادات لا تحتاج إلى تغيير منتصف التحليل.
- إتمام عملية تتبع عن طريق النقر متابعة في مربع الحوار تتبع. مقارنة بصريا المسارات الإخراج مع التقدم المحرز في كل دودة في الفيلم لضمان أن كل دودة ويمثل ما لم يكن هناك سبب وجيه لاستبعاده بناء على إعدادات التصفية التلقائية. حذف المسارات التي تم إنتاجها من خلال وجود أكدت الأجسام غير الدودة التي التقى معايير التصفية حجم يدويا.
- استخدام البرنامج لحساب سرعة كل دودة بين كل إطار (المسافة المقطوعة للالنقطه الوسطى من كائن في 1 ثانية بين الإطارات) وعرض متوسط السرعة لكل مسار ومتوسط السرعة في جميع المسارات للسكان من الديدان في خاتم من النحاس. النظر في هذا المعدل النهائي ليكون ن = 1 من حيث التجارب التجريبية. تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات للالتحليلات الإحصائية وحفظ البيانات.
- مرة واحدة وقد تم تسجيل البيانات للحلقة الأولى على لوحة، ونقل ROI إلى الحلبة القادمة وتكرار عملية تتبع، من دون تغيير أي من المعلمات.
- حساب السرعة النسبية للتنقل من خلال:
- السرعة النسبية (٪) = المعالجة (400 ملم) سرعة / غير المعالجة (0 مم) سرعة × 100.
ملاحظة: التلاعب الجيني مختلفة غالبا ما يغير معدل تنقل القاعدية من الحيوانات. من أجل تحديد تأثير الايثانول على سرعة تنقل الحيوانات وأن تكون قادرة على مقارنة هذه الآثار عبر المورثات أو ظروف مختلفة، وحساب السرعة النسبية.
- مرة واحدة القبض، وتحليل الأفلام باستخدام صورة-برو بلس البرامج أو ما يعادلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتعرض بيانات تمثيلية (الشكل 1) من عدة تراكيب وراثية مختلفة، وضوابطها يقترن 8،24. تم اختيار البيانات على وجه التحديد أن الاختلافات تسليط الضوء في الحيوانات يعاير. وتعتبر درجة من التأثير في 10 دقيقة من التعرض لحساسية الأولية للسلالة، والذي يظهر على المحاور اليسار في الشكل 1B-G. تعتبر سلالات متحولة مع السرعة النسبية أكبر من السيطرة على 10 دقيقة لتكون مقاومة لل(الشكل 1F، G) الإيثانول، في حين سلالات متحولة مع السرعة النسبية التي هي أقل من تعتبر شديدة الحساسية لالإيثانول (1D الشكل سيطرة، E). المحاور الصحيحة في الشكل رقم 1 تظهر درجة التعافي من السرعة بين الفترات الزمنية 10- و 30 دقيقة. وهذا يمثل مقياسا لمعدل التنمية التسامح وظيفي حاد (AFT) وتحسب على النحو السرعة النسبية في 10 دقيقة تطرح من جمعية مهندسي البترول النسبيإد في 30 دقيقة. تعتبر سلالات مع القيم انتعاش أكبر لديهم معدل أكثر السريع للتطوير AFT مقارنة مع الحيوانات التحكم (1D الشكل، F) وسلالات مع القيم الانتعاش أقل من تعتبر الحيوانات التحكم لديك انخفاض معدلات تنمية AFT (الشكل 1C ، E). لاحظ أن AFT قياس لsbp1 (ep79) (الشكل 1G) يتجه نحو التعافي السلبي ولكن لم يكن مختلفا إحصائيا من النوع البري بسبب التباين الكبير (ع = 0.08 للمقارنة ضد الانتعاش N2). الحوض-1 يشفر homolog بدين ، BBS-1 يشفر homolog إلى BBS1 الإنسان؛ الشفاه-7 يشفر الليباز الدهون الثلاثية، الدهون-1 بترميز لdesaturase أسيل أوميغا 3 الدهنية، الدهون-3 بترميز دلتا-6 الاحماض الدهنية desaturase، SBP-1 يشفر homolog ل الإنسان ستيرول عنصر تنظيم ملزم البروتينات (SREBPs).
هناك العديد من الخصائص المهمة للالبيانات أن نلاحظ: أولا، N2 (البرية من نوع) بيانات التحكم تختلف عبر التجارب. هذا ومن المرجح أن يكون بسبب العوامل البيئية التي يصعب السيطرة عليها، مثل المحتوى المطلق الماء أو تركيز الملح في وسائل الإعلام المجففة ودرجة الحرارة في المختبر. عادة، 400 ملي الإيثانول خارجي يخفض سرعة N2 إلى ما يقرب من 30٪ من الضوابط غير المعالجة. إلا أن درجة مطلقة من الاكتئاب تختلف من تجربة إلى تجربة. وعلاوة على ذلك، في حين عادة ما يتوقع انتعاش ما يقرب من 12٪ من سرعة تنقل أكثر من 30 دقيقة في N2، وهنا مرة أخرى وتختلف الأرقام. الأهم من ذلك، في حين أن المستويات المطلقة للحساسية ومعرض AFT الاختلاف يوما بعد يوم، والمقارنات بين الأنماط الجينية أو شروط لا تختلف عموما. وهذا هو، من النوع البري وسوف متحولة دائما آثار مماثلة بالنسبة لبعضها البعض. إذا تسبب المسخ انخفاض في AFT نسبة إلى البرية من نوع، وهذا الانخفاض تحجيم مع كمية من AFT يتبين من النوع البري. هذا يسلط الضوء علىأهمية الأداء المقترنة الضوابط على نفس وحات في نفس الوقت لسلالات أو الظروف التي يجري مقارنة.
ثانيا، إن الظواهر الحساسية الأولية وAFT هي فصل وراثيا. لاحظ أن حساسية الأولية والتسامح وظيفي حاد يمكن أن تختلف معا أو بشكل منفصل. تم تضمين نماذج من مجموعة متنوعة من الظواهر التي حساسية الأولية وAFT تختلف بشكل مستقل. تغيير في واحدة من الظواهر لا يتوقع تغييرا في النمط الظاهري آخر، كما لا توقع اتجاه تغيير النمط الظاهري الثاني (إما زيادة أو نقصان ردا على الإيثانول).
الشكل 1. حساسية الإيثانول الأولية ومعدل التنمية التسامح وظيفي حاد (AFT) والاستجابات السلوكية للانفصال. الجدول (A) ملخص لاتجاه آثار الطفرات في الجينات اسمه على مستوى الحساسية الأولية إلى الإيثانول ومعدل التنمية من AFT، وكلاهما في مقارنة مع الضوابط البرية من نوع (N2 في كل حالة). (B-G) ردود تنقل الحادة إلى 400 ملي يتم قياس الإيثانول خارجي في 10-12 دقيقة و30-32 دقيقة من التعرض الإيثانول المستمر. وترد بسرعة النسبية (٪ من سرعة غير المعالجة) على المحاور نقاط. وتظهر درجات الانتعاش في السرعة على المحاور الصحيحة وتمثل مقياسا لمعدل AFT خلال تلك الفترة 20 دقيقة. عدد المحاكمات مقارنة على النحو التالي: B، C، E: ن = 6؛ G: ن = 7؛ D: ن = 9؛ F: ن = 11. مقارنات ذات دلالة إحصائية (تقرن تي الاختبارات) وترد: *، ف <0.05. **، ف <0.01. 8،24 البيانات المعروضة في يتم تعديلها من 8،24 هذا الرقم. Pتأجير انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في بيولوجيا الأعصاب بسيطة والأدوات الوراثية متاحة في C. ايليجانس جعل دودة نموذجا ممتازا للدراسة الأسس الجزيئية لتأثير الايثانول على السلوك. هنا، نحن تصف مقايسة التي استخدمت لتحديد عدة وسطاء الجزيئية والبيئية للاستجابة سلوكية حادة لالإيثانول 8،10،20،24،25. هذا الأسلوب يسمح للتمايز والفحص في وقت واحد من اثنين من مختلف الظواهر السلوك استجابة الإيثانول، والحساسية الأولية وتطوير التسامح وظيفي حاد، وهذا نموذج معا النمط الظاهري مركب من مستوى الاستجابة في الثدييات. نفس الفحص يمكن تكييفها بسهولة لدراسة كلاء الدوائية الأخرى، وبالتالي الاستفادة من التجارب في وقت واحد من سلالات متعددة في تقييم الآثار السلوكية للأدوية أخرى.
يوفر نافذة الوقت 10-12 دقيقة نقطة زمنية مفيدة لقياس حساسية الأولية من سلالة لوآخرونhanol. تحليل للآثار 400 ملي الإيثانول عبر 10 دقيقة الأولى من التعرض يظهر لم يتحقق آثار سرعة بدءا من الدقيقة الثانية من التعرض ولكن حالة مستقرة من المفعول حتى الدقيقة السابعة من التعرض الايثانول 20. ونتيجة لهذا تعتمد على الوقت تأثير على سرعة تحرك، فإن الترتيب الذي يتم وضعها سلالات معينة على لوحة يكون هاما بالنسبة لأي قياسات سرعة قبل الدقيقة الثامنة أو التاسعة (على افتراض أنه يستغرق أقل من 2 دقيقة لوضع كل من الديدان على لوحة الإيثانول). في هذه النقاط وقت سابق بعض الديدان ستكون أكثر المتضررين من الإيثانول ببساطة لأنها وضعت على لوحة في وقت سابق. على الرغم من أن تأثير الأولي مستقرة من الإيثانول يتحقق من خلال الدقيقة السابعة، فمن المستحسن أن الترتيب الذي يتم وضعها على لوحات سلالات أن تختلف عبر التجارب تكرار للحد من أي أثر منتظم عبر سلالات بسبب هذا التأثير تعتمد على الوقت من الإيثانول و الوقت اللازم لنقل الديدان إلى بلاته.
وقد تم اختيار معايير محددة في تتبع الكائن خطوات للحد من التحيز من الديدان التي يصطدم مرارا وتكرارا مع خاتم من النحاس أو مع الديدان الأخرى. يجب أن الخطوة مرشح حجم الكائن القضاء على أي كائن من تتبع أكبر من دودة واحدة، من بينهم اثنان من الديدان مؤثرة. إذا دودة اللمسات دودة أخرى أو خاتم من النحاس ثم المسار ينتهي ويجب أن لم يعد من الممكن التعرف على أنها كائن صالح في حين أنها لا تزال على اتصال. عندما تفقد الدودة اتصال مع كائن آخر، يصبح كائن جديد ويبدأ مسار جديد. إذا المسار التي أدلى بها دودة هو أقل من 20 ثانية في الطول، ثم يتم استبعاده تلقائيا من خلال تحديد الحد الأدنى للطول المسار من 21 الإطارات. هذا الفلتر يمنع حالات دودة تتحرك إلى الأمام إلى كائن آخر (دودة أو عصابة)، عكس ثم المضي قدما للمس هذا الكائن مرة أخرى، نوبات قصيرة اعتبارا من انتكاسات سريعة يجوز التحيز متوسط الشاملة سرعة السكان من الحيوانات. باستخدام هذه الإعدادات، طt غير ممكن، وغير المألوف بالنسبة للدودة واحدة للمساهمة المسار أكثر من واحد أكبر من 20 ثانية في الطول (ولكن أقل من 99 ثانية) إلى المعدل العام. ويمكن تغيير الإعدادات بحيث يكون لكل دودة يساهم سوى مسار واحد عن طريق جعل الحد الأدنى لطول المسار 61 ثانية (من أصل ما مجموعه 120 ثانية)، ولكن تحديد الملاحظة التجريبية أن هذا القضاء على عدد كبير من المسارات وتبين أن أبطأ الديدان التي اصطدمت مع الديدان الأخرى أقل كثيرا من شأنه أن يكون أكثر من ممثلة. بدلا من ذلك، يمكن رفضه مسارات جديدة لتبدأ بعدها الإطار الأول من الفيلم ولكن بعد ذلك الديدان التي تصطدم في الفترة 2-مين في وقت مبكر يتم إزالتها من التحليل وسوف يتم فقدان البيانات المفيدة. وأخيرا، واستخدام الديدان في 10 خاتم من النحاس يمثل حلا وسطا جيدا بين وجود مسارات متعددة تمثيلية المساهمة في المتوسط ومشكلة الكثير من الاصطدامات دودة.
هذا الاختبار السلوكي لديها العديد من أهميةمزايا لدراسة السلوكيات استجابة الإيثانول في الديدان. اختبار المتزامن لعدة الأنماط الجينية على نفس لوحة ممكن من خلال استخدام النحاس "حظائر". هذا الابتكار لديها العديد من مزايا واضحة. أولا، في هذا الاختبار، يتم اختبار الشرط التحكم أو سلالة دائما على نفس لوحة في نفس الوقت كشرط التجريبية أو سلالة، والحيوانات الوحيدة اختبار في وقت واحد وتتم مقارنة مباشرة. ولهذا الأمر أهمية خاصة لأن كثيرا ما تتأثر المقايسات السلوكية عن البيئة، والاختلاف يوما بعد يوم في الاستجابات السلوكية يمكن أن تزيد من الضوضاء في الفحص وتقليل القدرة على الكشف عن الإشارات. المقارنة جنبا إلى جنب من المجموعات التجريبية في ظروف مماثلة يقلل إلى حد كبير من تأثير يوما بعد يوم الاختلاف البيئي، وهو الميزة الرئيسية لهذا النهج. ثانيا، استخدام حظائر النحاس يحتوي على الحيوانات في مجال الرؤية، مما يسمح للتحرك المقايسات التي يتعين القيام بها في لbsence من المواد الغذائية. عندما يحرم من الطعام والديدان تتحرك بسرعة، وتميل لتفريق بحثا عن البكتيريا. دون الخواتم، وسوف الديدان ترك مجال الرؤية أثناء الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، وصدت الديدان التي كتبها النحاس وتميل إلى البقاء أقرب إلى منتصف الحلقات، مما يجعلها سهلة لتصور. حقيقة أن الديدان تتحرك بسرعة في هذه الظروف فحص يزيد بدرجة كبيرة من الدقة للكشف عن آثار اكتئاب من الايثانول. عندما تتحرك الديدان ببطء، وبسرعة تصل إلى الأرض من القدرة على الكشف عليهم في وقت سابق. لاحظ أن النحاس هي سامة بالنسبة للديدان. في حين لا تظهر حلقات تؤثر على استجابات حادة لالإيثانول يعاير في هذا البروتوكول، مدد حضانة الحيوانات في حلقات (على مدى عدة ساعات) غير مستحسن. ثالثا، مع هذا التصميم التجريبي، يمكن فحص واحد تقييم الاستجابات السلوكية لمدة تصل إلى أربع مجموعات تجريبية مختلفة. ولذلك، فإن الوقت الذي يستغرقه لتجميع إحصائيا وانخفض البيانات ذات مغزى. في additiعلى، منذ يتم فيلم رقمي واحد، وهذا يقلل متطلبات مساحة الذاكرة لتخزين على المدى الطويل من البيانات الأولية. وأخيرا، في كل تجربة، يتم فحص سلوك الحيوانات 10 الفردية لكل المجموعة التجريبية. وبلغ متوسط سرعات هؤلاء الأفراد 10 لتوليد سرعة المركبة للفحص واحد، بحيث ن = 1 المحاكمة. هذا المتوسط من سلوك العديد من الحيوانات يقلل مزيد من التباين في هذه المقايسات السلوكية الحساسة، ومواصلة يزيد من قرار للكشف عن آثار خفية على السلوكيات استجابة الايثانول.
هناك قيود على الأساليب المذكورة هنا، والبعض منها ينطبق على التحليلات السلوكية للأي الحيوانات متحولة. واحد الحد كبيرا لهذا النهج هو أن الديدان الطافرة التي خفضت بشكل كبير جدا بسرعة القاعدية، وذلك بسبب اتناسق أو بالقرب منها الشلل، ويمكن تحديد بأنها إيجابية زورا للمقاومة لآثار الإيثانول بسبب سرعتهم قياس تنخفض إلى قيمة الفي أقل من عتبة كشف دقيق لإعداد التصوير معين. كما تستخدم معظم البرامج تتبع الكائن والنقطه الوسطى (مركز الكتلة)، وموقف يمكن من خلالها قياس المسافة المقطوعة بين الإطارات، دودة الثابتة التي تتحرك رأسه لا يزال يولد تحولا في موقف النقطه الوسطى، وسوف يتم الكشف عن هذا التحول كما الحركة. لذلك دودة تحتاج إلى أن تتحرك بشكل أسرع مما هو الناجمة عن التحولات الطفيفة في موقف الهيئة من أجل قياس تنقل صحيح كما. لا شلت الديدان تتعرض لالإيثانول لكنها غير منسقة للغاية، وذلك مع الديدان التي لديها بالفعل عجزا في تحرك كان من الممكن أن التعرض الإيثانول ستنخفض معدلات السرعة دون هذا التأثير الطابق التقني. زيادة الوقت بين الإطارات بحيث تغييرات أكبر في وضع الجسم يكون فصل من التحولات الطفيفة في موقف النقطه الوسطى لا يحل هذه المشكلة، إذا تم تطول الفترة الزمنية بين إطارات أكثر بكثير من 1 ثانية يصبح الأمر أكثر صعوبة بالنسبة سbject تتبع البرمجيات لضمان أن نفس دودة يساهم في مسار بدلا من القفز المسار بين الديدان وثيقة ولكن ليس لمس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وتم دعم هذه الدراسات من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للإدمان الكحول وتعاطي الكحول: R01AA016837 (JCB) وP20AA017828 (AGD وJCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
