Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של Published: April 9, 2015 doi: 10.3791/52681
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

Protocol

1. צעדים לביצוע ביום לפני Assay

  1. בחרו תולעי שלב L4 למדיום גידול נמטודות טרי צלחות (NGM) זורעים עם דשא של OP50 E. coli, ותרבותם בשיתוף 20 / N. כל מצב assay דורש 10 תולעים; לאסוף עודף של תולעים, כדי לאפשר O / הפסד N של תולעים.
    1. בעלי חיים רק assay כי הם מבוגרים ראשון-יום; מוטציות רבות לגדול במהירות איטית יותר מאשר סוג בר. התאם את עיתוי קטיף לזנים שיש לי עיכובים התפתחותיים, כך שכל בעלי החיים שנבדקו הם מבוגרים ראשון-יום.

2. צעדים לביצוע ביום Assay

  1. הכנה לassay:
    1. לבצע מבחני על צלחות unseeded סטנדרטיים 60 x 15 מ"מ NGM. ייבש את כל הצלחות לשימוש ב 37 צלזיוס למשך 2 שעות, עם מכסים מ. לכל ניסוי ניסוי, להשתמש בארבע צלחות NGM מיובשות; אלה יהיו 0 מ"מ ו -400 מ"מ צלחות assay אתנול וצלחות ההסתגלות אשר נלוו אליהם.
      הערה:השימוש בצלחות NGM הוא חשובה כאן; הבדלים בהרכב של הצלחות, בosmolarity בפרט, יכולים מאוד להשפיע על תגובת המינון של אתנול על התנהגות, וזאת בשל, לפחות בחלקו, לשינויים בכמות של אתנול שנצברה על ידי בעלי החיים 20. אגר NGM הוא 160 mOsm.
    2. לאחר ייבוש, שוקל כל אחת מצלחות NGM unseeded לשימוש בassay ושם לב במשקל. לקבוע את עוצמת הקול של מדיה בצלחות המבוססות על המשקל של צלחת ריקה. כקירוב להמרת משקל של אגר להיקף, מניח שהתקשורת שוקלת כמו נפח שווה של מים.
      הערה: התוצאות עקביות ביותר שלנו כבר נמצאה עם תקשורת NGM שייבש מספיק שיש לו מקורי 10 מיליליטר נפח פוסט-ייבוש בין 8.3-8.9 מיליליטר נפח. אלטרנטיבה לזמן היבש 2 hr היא להתייבש עד הצלחות להגיע לטווח כרך זה כדי להסביר את הבדלים בחממות.
    3. להמס 4 טבעות נחושת (קוטר פנימי של 1.6 סנטימטרים) לתוך השטח של כל אחת מהצלחות לפעול כמכלאות לגנוטיפים או קבוצות טיפול של worms.Grasp כל טבעת עם מלקחיים, וחום השונים בלהבה (להבה חזקה ממבער בונזן עובדת היטב) למשך כ 3 שניות. מייד למקם את הטבעת על צלחת ועדיין מחזיק את הטבעת עם המלקחיים כדי למנוע ממנה 'דילוג'.
      1. ודא שהטבעת נשענת שטוחה נגד פני השטח של אגר על ידי לחיצה בעדינות עם המלקחיים במספר נקודות על הטבעת. בעת ביצוע הטבעת, להיות זהיר כדי להשאיר מקום לשלוש טבעות נוספות.
      2. ממסים שלוש טבעות נחושת נוספות לתוך השטח של הצלחת, דואג למקם אותם כקרוב זה לזה ככל האפשר, כך שכל ארבעת יהיו בשדה הראייה של המצלמה.
        הערה: ביצוע חותם טוב עם אגר הוא חיוני כדי לשמור על התולעים בטבעות במהלך assay. טבעות שלדלג סביב על הצלחת צפויים להפוך את החותם הנכון עם אגר וייתכן ויהיה הצלקת אגר, המאפשר תולעים להתחפר ומפריע לדמיין את התולעים.
      3. לכל צלחת assay להכין צלחת נלווית "הסתגלות", שאמור להיות יבשה וunseeded ויקבל שום אתנול. הנח ארבע טבעות נחושת על צלחות אלה.
    4. תווית התחתונה של הצלחות ליד כל טבעת עם מתח התולעת לשימוש בטבעת, נזהרת שלא לכתוב בשדה הראייה של הטבעת עצמה. התאם את התוויות על צלחת assay עם צלחת ההסתגלות הנלווית אליה.
    5. לחשב את הסכום של 100% אתנול להוסיף לכל צלחת assay כך שהריכוז הסופי הוא 0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול (משקל לנפח). עבור כל ניסוי (n = 1), יהיה אחד 0 מ"מ וצלחת אתנול מ"מ אחד 400; צלחות הסתגלות אינן מקבלות אתנול. הוסף את אתנול, pipetting אותו סביב פני השטח של הצלחת. השתמש בסרט מעבדה כדי לאטום את הצלחת ולאפשר לו לאזן על גבי הספסל עבור שעה 2.
    6. כאשר 1.5 שעות חלפו, מתחיל שלב ההסתגלות של assay, שלב 2.2.
  2. בצע assay תנועה: צלחות Assay
    1. זהירות להעביר 10 תולעים של כל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת ההסתגלות. הסר את כל מזון המופיע על אגר בשלב זה על ידי גירוד עדין עם בחירת התולעת. להשתנות את הסדר שבו שמו את קבוצות ניסוי על הצלחות על פני ניסויים ניסיוניים, כך שאותו הזנים לא לשים על הצלחות באותו סדר על פני ניסויים.
      הערה: המטרה היא להעביר את בעלי החיים לצלחת עם כמויות מזעריות של מזון, כי אם אוכל על צלחת ההסתגלות מועבר לצלחת assay התולעים לצבור סביב האוכל ואת ההשפעה של התרופה על תנועה יהיה מוסתרת.
    2. היזהר שלא לשבור את פני השטח של אגר עם הבחירה, כפי שזה יאפשר התולעים להתחפר וישבש את assay. דגירה התולעים ב RT למשך 30 דקות.
    3. ודא שיש מרווח מתאים בין החניכות של כל צלחת. הנסיין מנוסה יכול להעביר 40 בעלי חיים, 10 / טבעת במשך 4 טבעות ב< 1.5 דקות, אבל כל מרווח של עד 2 דקות מקובל. יש assay הסטנדרטי סרטי הקלטה ב 10-12 דקות ו30-32 דקות של חשיפה לשני מ"מ 0 ו -400 מ"מ אתנול.
    4. ליזום את צלחת ההסתגלות לחשיפת 0 מ"מ וצלחת ההסתגלות לחשיפה של 400 מ"מ כ 2 דקות ו- 30 שניות לגזרים כדי לאפשר חיסכון של קובץ הסרט הראשון לפני חייב להתחיל את הסרט השני.
    5. לאחר תקופת ההסתגלות של 30 דקות, להעביר את התולעים מצלחות ההסתגלות לצלחות assay. העבר את התולעים לצלחות assay (0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול) באותו סדר שבו נוספו לצלחת ההסתגלות, שמירה על המסלול של התזמון בין הגמר של כל צלחת. חותם את הצלחת עם סרט מעבדה כדי להקטין את איבוד של אתנול לאידוי.
    6. Use תנועה גורף עם בחירת תולעת שטוחה עם קצוות דקות כדי לאסוף תולעים על גבי הטנדר השטוח. לבצע את ההעברה של תולעים מצלחת הסתגלות unseeded לצלחת assay ללא השימוש בחיידקים, המשמש בדרך כלל בהעברת תולעים כמו זה עוזר להדביק את התולעת לבחירה.
      הערה: המהירות שבה בעלי החיים מועברים בשלב זה היא חשובה מאוד, כי התולעים הראשונים על הצלחת יהיו חשופים לאתנול יותר מהתולעים האחרונים שנוספו לצלחת, ונקודות זמן קודמות עשויות להראות כמה תופעות תלויות זמן. זו הסיבה העיקרית למסתובב אשר זנים מונחים על צלחת ראשונה על פני משכפל ניסיוני.
  3. בצע תנועת Assay: צילומים
    1. השתמש בשילוב מיקרוסקופ / מצלמה המאפשר הדמיה בו זמנית של כל ארבע הטבעות בשדה הראייה (כ 2 מ"מ המרובע 42x42), כגון מטרת מיקרוסקופ 0.5x, הגדלת 0.8x ומצלמה עם 2048x2048 7.481; CCD פיקסל מ '.
    2. השתמש אפילו תאורה על פני שדה הראייה, אשר מסייע בזיהוי אובייקט בשלב סף עוצמה (ראה להלן). תאורה אחורית "x3" 3 עובדת היטב.
    3. תמונת התולעים בתקשורת בצד את צלחת מיקום (מכסה למטה), אשר מייצר ניגוד כי הוא איבד בעת השימוש בתאורה האחורית לעומת מיקרוסקופ מסורתי מועבר מקור אור.
    4. הכן את תוכנת ניתוח תמונה כדי ללכוד זמן לשגות סרטים של התולעים נעו. הגדר את התוכנה לצילום תמונות בגוונים אפורים 12-bit כל 1 שניות, כסרט 2-דקות (120 מסגרת). כדי להקטין את הגודל של קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספיק, להשתמש במצב binning 2x2 כדי ללכוד תמונות 1024x1024 פיקסלים.
    5. רשום את הסרטים. להתחיל בהקלטת סרט 120-מסגרת של הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) 10 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על צלחת ש. שמור את קובץ הסרט.
    6. רשום את הצלחת השנייה (400 אתנול מ"מ). חזור על תהליך זה עבורשני הצלחות מתחילות 30 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) כדי ללכוד את נקודות הזמן דק '30-32 לכל חשיפה.
      הערה: אפשר מספיק זמן כדי לשמור את קבצי תמונה לאחר כל פגישת לכידה לפני תחילת הקלטה של ​​הצלחת הבאה כדי להיות מנותחות.
    7. לעתיד-הגהה של סרטי ארכיון ולאפשר את הסרטים האלה שייפתחו ונותחו על ידי תוכנת הדמיה תוכניות אחרות ברשות הציבור בקוד פתוח, כגון 28 ImageJ, להמיר עותק של כל סרט עד 8 ​​סיביות 256 קבצי TIFF בקנה מידה אפורה.
      הערה: תוכנת ניתוח תמונה המתוארת כאן משתמשת בפורמט קובץ קניינית.
  4. ניתוח של סרטים באמצעות תוכנת ImagePro.
    1. ברגע שנתפס, לנתח את הסרטים באמצעות תמונה-Pro Plus תוכנה או שווה ערך.
      הערה: מגוון רחב של תוכנות מעקב אובייקט אחרות זמינה שנעשה שימוש כדי לעקוב אחר הצלחה מרובה C. elegans בפעם אחת 29 וכאלהתוכנה יכולה להחליף באופן סביר לזה שתואר כאן כצעדי זיהוי אובייקטים מבוססים על עקרונות דומים. השיטה המתוארת מתייחסת לגרסאות תמונה-Pro Plus תוכנת 6.0-6.3 ו 7.0, גרסאות חדשות יותר של תמונה-Pro Plus תוכנה עשוי להיות הבדלים קלים.
    2. לנתח סרטים ב2-דקות (120 מסגרת) מגזרים. ראשית, להחיל מסנן לתמונות כדי לשטח את הרקע ולשפר את הניגודיות של אובייקטי התולעת. בחר את המסנן באופן הבא: תפריט> תהליך> מסננים> שיפור> לרדד: פרמטרים: רקע = Dark; כוללים רוחב = 20 Pix.
    3. Re-להציל את הסרטים לאחר שלב הסינון אבל תמיד לשמור את הסרט המקורי בצורה לא המסוננת שלה.
      1. לנתח את התנועה של בעלי חיים בכל טבעת בנפרד עם אזור מעגלי של העניין (ROI) הממוקם בגודל וחפיפה עם טבעת הנחושת. לזהות ולעקוב אחר התולעים עם התפריט> מדוד> לעקוב אחר אובייקטים ... הפקודה; זה מעלה את המעקב Dחלון טבלת אתא. לחצן אפשרויות המעקב מאפשר מסלולים ספציפיים שנכללו ולהגביל כל חפצים ניסיוניים.
    4. תחת הלשונית האוטומטית המעקב, השתמש בפרמטרים הבאים: פרמטרי מסלול: מגבלת מהירות (רדיוס חיפוש) = 400 מיקרומטר / מסגרת, גבול ההאצה = Auto, הכולל אורך מסלול מינימאלי = 400 מיקרומטר, סוג תנועה שולט = כאוטי; אובייקטים בפרמטרי מסלולים: אפשר מסלולים חלקיים = כן, אורך Min = 21 מסגרות, מעקב עומק חיזוי = 1 מסגרת.
    5. כדי להתחיל בתהליך המעקב, לחץ על הציגו את כל המסלולים באופן אוטומטי לתפקד כפתור כדי להעלות את ספירה / תיבת הדו-שיח אפשרויות גודל ותיבת הדו-שיח המעקב. בחר באפשרות ידנית לבחירת טווח עצימות בתיבת הדו-שיח רוזן / גודל, אשר מספקת את צעד הסף החשוב שמשתמש בעוצמה האפורה בקנה המידה של פיקסלים התולעת כדי להדגיש אובייקט תולעת לניתוח ולהתעלם פיקסלים רקע הבהירים יותר.
      1. התאם את SLI סף העצמהders (אחד כדי לקבוע את הגבול העליון, אחד כדי לקבוע את הגבול התחתון) כדי ליצור מגוון כולל שמדגיש אובייקטים כל חושך. מגוון של 0-1,500 בסולם של 0-4,095 הוא נקודת התחלה טובה לכוונון עדין יותר.
      2. החל מסנן גודל שלא לכלול אובייקטים שגודלם וקטנים יותר מאשר אובייקט תולעת אחת, כגון טבעת הנחושת ופסולת כלשהי על הצלחות. להגדיר שני פרמטרים גודל לעשות את זה כי לכסות גדלים לתולעים בודדים במגוון תנוחות עם מדוד> פריט תפריט מדידות בחרו בתיבת הדו-שיח אפשרויות רוזן / גודל. (פינת טווח: 28,000-120,000 מיקרומטר 2 ומגוון היקפי: 600-2,500 מיקרומטר).
      3. אם מתח מוטציה הוא קטן יותר באופן משמעותי או גדול יותר מבעלי חיים אחרים על הצלחת להיות מנותח, להרחיב את מגוון הגדרות המסנן לזיהוי אובייקט כדי להתאים את הגדלים השונים של הזנים הראשונים לפני מעקב אחר בעלי חיים, כך שהגדרות לא צריכים להיות שונה אמצע ניתוח.
      </ Li>
    6. השלם את תהליך המעקב על ידי לחיצה על המשך בתיבת הדו-שיח המעקב. מבחינה ויזואלית להשוות מסלולי פלט עם ההתקדמות של כל תולעת בסרט על מנת להבטיח שכל תולעת מיוצגת, אלא אם יש סיבה טובה שלא לכלול אותו מבוסס על הגדרות מסנן אוטומטיות. מחקו באופן ידני מסלולים שהופקו על ידי הנוכחות של אובייקטים שאינם תולעת אישרו כי עמדו בקריטריוני מסנן הגודל.
    7. להשתמש בתוכנה כדי לחשב את המהירות של כל תולעת בין כל מסגרת (המרחק נסע לcentroid של אובייקט ל1 שניות בין מסגרות) ולהציג את המהירות ממוצעת לכל מסלול ומהירות הממוצעת על פני כל המסלולים לאוכלוסייה של תולעים טבעת נחושת. שקול ממוצע סופי זה להיות n = 1 במונחים של ניסויים ניסיוניים. לייצא את הנתונים לתכנית גיליון אלקטרוני עבור ניתוחים סטטיסטיים ונתונים בארכיון.
    8. ברגע שהנתונים כבר נרשמו לטבעת הראשונה על הצלחת, להעביר את ההחזר על ההשקעה לטבעת הבאה וחזור על תהליך המעקב, מבלי לשנות כל אחד מהפרמטרים.
    9. לחשב את המהירות היחסית של תנועה באמצעות:
    10. מהירות היחסית (%) = טופל (400 מ"מ) מהירות / מטופל (0 מ"מ) מהירות x 100.
      הערה: מניפולציות גנטיות שונות לעתים קרובות לשנות את שיעור התנועה הבסיסי של בעלי חיים. על מנת לקבוע את ההשפעה של אתנול על מהירות התנועה של בעלי חיים ולהיות מסוגל להשוות את ההשפעות הללו על פני גנוטיפים או תנאים שונים, לחשב את מהירות היחסית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נציגי נתונים (איור 1) מכמה גנוטיפים שונים ובקרות לזווגם מוצגים 8,24; הנתונים שנבחרו במיוחד שהבדלי גולת הכותרת בבעלי החיים assayed. מידת ההשפעה על 10 דקות של חשיפה נחשבת הרגישות הראשונית של מתח, אשר מוצג על הצירים שנותרו באיור 1 ב-G. זנים מוטנטים עם מהירות היחסית גדולה יותר מהשליטה בשעה 10 דקות נחשבים לעמיד אתנול (איור 1F, G), ואילו זנים מוטנטים עם מהירות היחסית שהיא פחות מהשליטה נחשב לרגיש לאתנול (1D איור, E). הצירים הנכונים באיור 1 מראים את מידת ההתאוששות של מהירות בין פרקי הזמן של 10 ו- 30-דקות. זה מייצג מדד לקצב התפתחות של סובלנות פונקציונלית חריפה (AFT) ומחושב כמהירות היחסית בשעה 10 דקות מופחתים SPE היחסיed ב- 30 דקות. זנים עם ערכי התאוששות גדולים יותר נחשבים לבעלי קצב מהיר יותר של התפתחות של AFT לעומת בעלי חיים שליטה (1D איור, F) וזנים עם ערכי התאוששות נמוכים יותר מאשר בעלי החיים השליטה נחשבים כבעלות שיעורים נמוכים יותר של התפתחות AFT (איור 1 ג , E). שים לב שAFT נמדד sbp1 (ep79) (איור 1G) הוא במגמה לכיוון התאוששות שלילית אך לא היה שונה מבחינה סטטיסטית מסוג בר בשל שונות גדולות (p = 0.08 להשוואה מול התאוששות N2). אמבטיה-1 מקודדת homolog טאבי ; BBS-1 מקודד homolog לBBS1 האנושי; פת-7 מקודד lipase triacylglycerol; שומן 1 מקודד desaturase acyl שומן האומגה -3, שומן 3 מקודד desaturase חומצת שומן delta-6; SBP-1 מקודד homolog ל אדם סטרולים תקינה אלמנט כריכת חלבונים (SREBPs).

ישנם מספר מאפיינים החשובים שלנתונים ללבך: ראשית, N2 (wild-type) נתוני שליטה שונים על פני ניסויים; זו עשויה להיות כתוצאה מגורמים סביבתיים שקשה לשלוט, כגון תוכן מוחלט מים או ריכוז מלח של התקשורת מיובשת וטמפרטורה במעבדה. בדרך כלל, אתנול אקסוגניים 400 מ"מ מדכא את המהירות של N2 לכ -30% מפקדים שלא טופלו; עם זאת התואר המוחלט של דיכאון משתנה מניסוי לניסוי. יתר על כן, בעוד שהתאוששות כ -12% ממהירות תנועה מעל 30 דקות בN2 בדרך כלל צפויה, כאן שוב את המספרים משתנים. חשוב לציין, בזמן שהרמות המוחלטת של רגישות ווריאציה היום-יום תערוכת AFT, ההשוואות בין גנוטיפים או תנאים בדרך כלל אינן שונות. כלומר, wild-type ומוטציה תמיד תהיה השפעות דומות יחסית זה לזה; אם מוטציה גורמת לירידה בAFT ביחס לwild-type, ירידה שתהיה בסדר גודל עם הכמות של AFT הפגינה סוג בר. מדגיש זההחשיבות של ביצוע לזווג בקרות על אותו הצלחות באותו הזמן לזנים או תנאים שנמצאים בהשוואה.

שנית, פנוטיפים של רגישות וAFT ראשוניים מבחינה גנטית להפרדה. שים לב שרגישות ראשונית וסובלנות תפקודית אקוטית יכול להשתנות ביחד או בנפרד; דוגמאות נכללו של מגוון רחב של פנוטיפים בי רגישות וAFT ראשוניים שונה באופן עצמאי. שינוי באחד מפנוטיפים אינו מנבא שינוי בפנוטיפ האחר, וגם לא לחזות את כיוון השינוי של פנוטיפ השני (או להגדיל או להקטין תגובה לאתנול).

איור 1
איור 1. רגישות אתנול ראשונית וקצב התפתחות של סובלנות פונקציונלית חריפה (AFT) הן תגובות התנהגותיות להפרדה. טבלת סיכום () לכיוון ההשפעות של מוטציות בגנים בשם ברמת רגישות ראשונית לאתנול וקצב התפתחות של AFT, שניהם בהשוואה לבקרות wild-type (N2 בכל מקרה). (B-G) תגובות חריפות תנועה 400 מ"מ אתנול אקסוגניים נמדד לפי 10-12 דקות ו30-32 דקות של חשיפת אתנול רציפה. מהירויות יחסי (% ממהירות שלא טופלה) מוצגות בצירים עזבו. מעלות של התאוששות במהירות מוצגות על הצירים הנכונים ומייצגות מדד לשיעור של AFT שבמרווח של 20 דקות. מספר הניסויים בהשוואה הוא כדלקמן: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. השוואות מובהקות סטטיסטי (מבחני t מזווגים) מוצגים: *, p <0.05; ** P <0.01. 8,24 נתונים המוצגים בנתון זה משתנה מ8,24. Pלהחכיר לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נוירוביולוגיה הפשוטה וכלים גנטיים זמינה ב C. elegans לעשות תולעת מודל מצוין שבו ללמוד את הבסיסים המולקולריים של ההשפעות של אתנול על התנהגות. כאן אנו מתארים assay שנעשה שימוש כדי לזהות כמה מתווכים מולקולריים וסביבתיים של התגובה התנהגותית החריפה כדי אתנול 8,10,20,24,25. שיטה זו מאפשרת בידול ובדיקה בו זמנית של שני פנוטיפים שונים תגובת אתנול התנהגות, רגישות ראשונית והפיתוח של סובלנות פונקציונלית חריפה, שביחד מודל פנוטיפ שילוב של רמת התגובה ביונקים. אותו assay יכול להיות מותאם בקלות ללמוד סוכנים תרופתיים אחרים, ובכך מנצל את הבדיקות סימולטני של זנים רבים בהערכת ההשפעות ההתנהגותיות של תרופות אחרות.

חלון הזמן 10-12 דקות מספק נקודת זמן שימושית למדידת רגישות ראשונית של מתח ולאחhanol. ניתוח ההשפעות של 400 מ"מ לרוחב אתנול הראשון 10 דקות של חשיפה מציג אפקטי מהירות מתחילים בדקה השנייה של חשיפה אך מצב יציב של השפעה לא יושגו עד הדקה השביעית של חשיפת אתנול 20. בשל השפעה זו תלוי זמן על מהירות תנועה, את הסדר שבי זנים מסוימים מונחים על הצלחת יהיה חשוב עבור כל מדידות מהירות לפני הדקה השמינית או תשיעית (בהנחה שזה לוקח פחות מ 2 דקות למקם את כל התולעים על צלחת אתנול). בנקודות זמן אלה קודם לכן כמה תולעים יהיו מושפעים יותר על ידי אתנול פשוט משום שהם הונחו על הצלחת קודם לכן. למרות שאפקט ראשוני יציב של אתנול מושגת על ידי הדקה השביעית, מומלץ כי הסדר שבו זנים מונחים על צלחות להיות מגוון על פני ניסויים לשכפל כדי למזער את השפעה שיטתית על פני זנים בשל השפעה זו תלוי זמן של אתנול ו את הזמן הנדרש כדי להעביר תולעים לplatדואר.

פרמטרים ספציפיים נבחרו בשלבי מעקב אובייקט כדי למזער את ההטיה מתולעים שמתנגשים שוב ושוב עם טבעת הנחושת או עם תולעים אחרים. צעד מסנן גודל האובייקט צריך לחסל כל אובייקט ממעקב שהוא גדול מתולעת אחת, ובם שני תולעים נוגעים ללב. אם תולעת נוגעת תולעת אחרת או טבעת הנחושת אז המסלול מסתיים וזה כבר לא צריך להיות מוכר כאובייקט תקף בזמן שהוא נשאר בקשר. כאשר התולעת מאבדת קשר עם האובייקט האחר, הוא הופך להיות אובייקט חדש ויוזם מסלול חדש. אם המסלול שנעשה על ידי תולעת היא פחות מ -20 שניות באורך, אז זה לא נכלל באופן אוטומטי על ידי הגדרת אורך מסלול מינימאלי של 21 מסגרות. מסנן זה מונע מקרים של תולעת נעו קדימה לתוך אובייקט אחר (תולעת או טבעת), היפוך ולאחר מכן הולכים קדימה לגעת אובייקט ששוב, התקפים קצרים של תהפוכות מהירות עלול להטות את המהירות הממוצעת הכוללת של האוכלוסייה של בעלי חיים. שימוש בהגדרות אלה, it הוא אפשרי ולא נדיר עבור תולעת אחת לתרום מסלול יותר מפעם אחת שהוא גדול מ -20 שניות באורך (אך פחות מ 99 שניות) לממוצע הכללי. ההגדרות אפשר לשנות, כך שכל תולעת תורמת מסלול אחד בלבד על ידי ביצוע שניות אורך מסלול מינימום 61 (מתוך סך כולל של 120 שניות), אבל תצפית אמפירית קבעה כי זו בוטלה מספר משמעותי של מסלולים ונמצא כי איטי יותר תולעים שהתנגשו בתולעים אחרים בתדירות נמוכה יותר יהיו ייצוג יתר. לחלופין, יכולים להיות אסורים מסלולים חדשים כדי להתחיל אחרי הפריים הראשון של הסרט, אבל אז תולעים שמתנגשים בתחילת התקופה 2-דקות יוסרו מהניתוח ונתונים שימושיים יהיו אבודים. לבסוף, השימוש בתולעים 10 לטבעת נחושת מהווה פשרה טובה בין שיש מסלולי נציג מרובים תורמים לממוצע והבעיה של התנגשויות תולעת רבות מדי.

יש assay התנהגות זו מספר חשוביתרונות ללימוד התנהגויות תגובת אתנול בתולעים. בדיקות בו זמנית של מספר גנוטיפים על אותה הצלחת אפשרית באמצעות השימוש בנחושת "מכלאות". יש חידוש זה מספר יתרונות בולטים. ראשית, בassay זה, המצב בשליטה או במתח תמיד נבדק על אותה הצלחת באותו הזמן כתנאי ניסוי או מתח, ובעלי החיים רק נבדקו בו-זמנית הם בהשוואה ישירה. זה הוא בעלת חשיבות מיוחדת משום שמבחני התנהגות לעתים קרובות מושפעים מהסביבה, ווריאציה היום-יום בתגובות התנהגותיות יכולה להגדיל את הרעש בassay ולהקטין את היכולת לזהות אותות. השוואת Side-by-side של קבוצות ניסוי בתנאים זהים באופן משמעותי מפחיתה את ההשפעה סביבתית וריאציה היום-יום, וזה יתרון גדול של גישה זו של. שנית, השימוש במכלאות נחושת מכילה בעלי חיים בשדה הראייה, המאפשר למבחני התנועה שיש לבצע בbsence של מזון. כאשר יש מחסור במזון, תולעים לנוע במהירות ונוטים להתפזר בחיפוש של חיידקים; ללא טבעות, תולעים יעזבו את שדה הראייה במהלך assay. בנוסף, התולעים נרתעים מנחושת ונוטים להישאר קרוב יותר לאמצע הטבעות, מה שהופך אותם קל לדמיין. העובדה שהתולעים לנוע במהירות בתנאי assay אלה מגבירה באופן משמעותי את הרזולוציה כדי לזהות תופעות דיכאון של אתנול; כאשר תולעים לנוע באיטיות, במהירויות מגיעות לרצפה של היכולת לזהות אותם קודם לכן. שים לב כי הנחושת היא רעילה לתולעים; בעוד הטבעות אינן מופיעות כדי להשפיע על התגובות חריפות לאתנול assayed בפרוטוקול זה, הרחיב את הדגירה של בעלי חיים בטבעות (על פני מספר שעות) אינו מומלץ. שלישי, עם עיצוב ניסיוני זה, assay אחד יכול להעריך את התגובות התנהגותיות של עד ארבע קבוצות ניסוי שונות. לכן, הזמן שנדרש כדי לצבור סטטיסטי נתונים משמעותיים הוא ירד. בadditiב, מאז שעשה סרט דיגיטלי אחת, זה מקטין את דרישות שטח זיכרון לאחסון לטווח ארוך של נתונים ראשוניים. לבסוף, בכל ניסוי, ההתנהגות של בעלי חיים 10 פרטניים של כל קבוצת ניסוי נבחנה. במהירויות של 10 אנשים אלה הם ממוצעים לייצר מהירות מרוכבים עבור assay בודד, כל כך n = 1 משפט ש. מיצוע זה של התנהגותם של בעלי חיים רבים נוסף מקטין שונות במבחני התנהגות הרגישים אלה, ומגדיל עוד יותר את הרזולוציה כדי לזהות השפעות עדינות על התנהגויות תגובת אתנול.

ישנן מגבלות על השיטות שתוארו כאן, שחלקם חלים על ניתוחי התנהגות של כל בעלי חיים שעברו מוטציה. מגבלה משמעותית אחד לגישה זו היא כי תולעי מוטציה שצמצמו באופן משמעותי מאוד במהירויות בסיסיות, בשל חוסר קואורדינציה או בסמוך לשיתוק, עשויים להיות מזוהות ככוזבים חיובי להתנגדות להשפעות של אתנול בגלל המהירות שנמדדה מקטינה לערך הבהוא מתחת לסף גילוי מדויק להתקנת הדמיה מסוימת. כמו רוב תוכנות מעקב האובייקט להשתמש centroid (מרכז המסה) כעמדה שממנו ניתן למדוד מרחק שעבר בין מסגרות, תולעת נייחת שמזיזה את הראש שלה עדיין יכולה ליצור שינוי בעמדה של centroid והשינוי שיהיה מזוהה כתנועה. לכן תולעת צריכה להיות נעה מהר יותר מנגרם על ידי שינויים דקים בתנוחת גוף על מנת למדוד תנועה נכונה. תולעים נחשפו לאתנול אינם משותקים אבל הם מאוד לא מתואמים, כך עם תולעים שכבר יש לי גירעון בתנועה זה אפשרי כי חשיפת אתנול תקטן שיעוריהם של מהירות מתחת אפקט רצפה טכני זה. הגדלת הזמן בין מסגרות, כך ששינויים גדולים יותר בתנוחת גוף יהיו הפרדה ממשמרות עדינות בעמדת centroid אינו פותרים את הבעיה, אם את הזמן בין המסגרות מתארך הרבה יותר מאשר 1 שניות הוא הופך להיות קשה יותר עבור object תוכנת המעקב כדי להבטיח כי אותו התולעת תורמת למסלול ולא קפיצת מסלול בין תולעים קרובים, אבל לא נוגעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לאלכוהוליזם והתמכרות לאלכוהול: R01AA016837 (JCB) וP20AA017828 (AGD וJCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented Greiner Bio-One 628161 Other plate brands will suffice.
NGM agar Various NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps Various e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator Various For drying agar
Digital balance Various For determining plate weights and agar volume
Copper rings Plumbmaster STK#35583 (48 cap thread gasket) 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol Various
Parafilm M Bemis PM996
CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12 This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective Leica MZ6 Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source Schott A08923 3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software Media Cybernetics ImagePro-Plus v6.0-6.3 Newer versions of the software have tracking functions.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  2. Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
  3. Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
  4. Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
  5. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  6. Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
  7. Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
  8. Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
  9. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
  10. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
  11. Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
  12. Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
  13. Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
  14. Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
  15. Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
  16. Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
  17. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
  18. Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
  19. Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
  20. Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
  21. Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
  22. Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
  23. Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
  24. Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
  25. Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
  26. Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
  27. Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).

Tags

התנהגות גיליון 98 אתנול אלכוהול התנהגות רגישות סובלנות פונקציונלית חריפה, תולעת תנועה מעקב אחר מחשב assay
Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davies, A. G., Blackwell, G. G.,… More

Davies, A. G., Blackwell, G. G., Raabe, R. C., Bettinger, J. C. An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (98), e52681, doi:10.3791/52681 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter