की हरकत स्पीड पर इथेनॉल के प्रभाव को मापने के लिए एक परख Published: April 9, 2015 doi: 10.3791/52681

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Andrew G. Davies^1,2, GinaMari G. Blackwell^1,2, Richard C. Raabe¹, Jill C. Bettinger^1,2

¹Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, ²VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

Protocol

परख के पहले दिन पर प्रदर्शन करने के लिए 1. कदम

1. ताजा निमेटोड मध्यम विकास के लिए L4 मंच कीड़े उठाओ (एन जी एम) प्लेटें OP50 ई के एक लॉन के साथ वरीयता प्राप्त 20 सह / एन पर कोलाई, और संस्कृति उन्हें। प्रत्येक परख हालत 10 कीड़े की आवश्यकता है; कीड़े के हे / एन घटाने के लिए अनुमति देने के लिए कीड़े की एक अतिरिक्त उठाओ।
   1. प्रथम दिन वयस्क हैं कि केवल परख जानवरों; कई म्यूटेंट जंगली प्रकार की तुलना में धीमी गति से बढ़ता है। सभी परीक्षण जानवरों प्रथम दिन वयस्क हैं तो यह है कि विकास की देरी है कि उपभेदों के लिए उठा के समय को समायोजित।

2. कदम परख के दिन पर प्रदर्शन

1. परख के लिए तैयारी:
   1. मानक गैरवरीय 60 x 15 मिमी एन जी एम प्लेटों पर assays के प्रदर्शन। प्लेटों के सभी lids के साथ बंद, 2 घंटे के लिए 37 सी पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए सूखी। प्रत्येक प्रायोगिक परीक्षण के लिए, चार सूखे एन जी एम प्लेटों का उपयोग करें; इन 0 मिमी और 400 मिमी इथेनॉल परख प्लेटें और उनके साथ दशानुकूलन प्लेटों किया जाएगा।
      ध्यान दें:एन जी एम प्लेटों का उपयोग यहाँ महत्वपूर्ण है; प्लेटों की संरचना में मतभेद है, विशेष रूप से उनके परासारिता में जोरदार व्यवहार पर इथेनॉल की खुराक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, यह जानवरों ²⁰ से संचित इथेनॉल की राशि में परिवर्तन करने के लिए, कम से कम हिस्से में कारण है। एन जी एम अगर 160 mOsm है।
   2. सूखने के बाद, गैरवरीय एन जी एम प्लेटों के प्रत्येक परख में इस्तेमाल किया और वजन ध्यान दें होने के लिए वजन। एक खाली थाली के वजन के आधार पर प्लेटों में मीडिया की मात्रा निर्धारित करते हैं। मात्रा करने के लिए अगर के वजन का रूपांतरण करने के लिए लगभग, मीडिया पानी की एक समान मात्रा के रूप में एक ही वजन का होता है कि मान।
      नोट: हमारी सबसे अनुरूप परिणाम एक मूल 10 मिलीलीटर मात्रा 8.3-8.9 मिलीलीटर के बीच एक के बाद सुखाने की मात्रा है कि पर्याप्त निर्जलित है कि एन जी एम मीडिया के साथ पाया गया है। 2 घंटा शुष्क समय के लिए एक वैकल्पिक प्लेटें इन्क्यूबेटरों में मतभेद के लिए खाते में इस मात्रा सीमा तक सूखी है।
   3. चार तांबे के छल्ले (1 के भीतरी व्यास पिघला।6 सेमी) प्लेटों में से प्रत्येक की सतह लगभग 3 के लिए एक लौ में अलग जीनोटाइप या worms.Grasp प्रत्येक संदंश के साथ अंगूठी, और गर्मी के उपचार के समूहों के लिए बाड़े (एक लेम्प बर्नर से एक मजबूत लौ अच्छी तरह से काम करता है) के रूप में कार्य करने के लिए में सेकंड। अभी भी 'लंघन' से इसे रोकने के लिए संदंश के साथ अंगूठी धारण करते हुए तुरंत एक थाली पर अंगूठी जगह है।
      1. अंगूठी अंगूठी पर कई जगहों पर संदंश के साथ धीरे नीचे दबाकर अगर की सतह के खिलाफ फ्लैट टिकी हुई है कि सुनिश्चित करें। अंगूठी रखने, एक अतिरिक्त तीन छल्ले के लिए जगह छोड़ने के लिए सावधान रहना होगा।
      2. सभी चार कैमरे के दृश्य के क्षेत्र में हो जाएगा तो यह है कि करीब के रूप में एक साथ संभव के रूप में उन्हें जगह ख्याल रख रही है, थाली की सतह में तीन अतिरिक्त तांबे के छल्ले पिघला।
         नोट: अगर साथ एक अच्छा मुहर बनाने परख के दौरान छल्ले में कीड़े रखने के लिए आवश्यक है। थाली पर चारों ओर छोड़ अंगूठी है कि अगर साथ सही मुहर बनाने की संभावना नहीं कर रहे हैं औरकीड़े बिल के लिए अनुमति देता है और कीड़े visualizing के साथ हस्तक्षेप है, जो अगर, निशान हो सकता है।
      3. प्रत्येक परख थाली के लिए सूखे और गैरवरीय और कोई इथेनॉल प्राप्त होगा की जानी चाहिए जो एक साथ "दशानुकूलन" थाली, तैयार करते हैं। इन प्लेटों पर चार तांबे के छल्ले रखें।
   4. अंगूठी खुद के दृश्य के क्षेत्र में नहीं लिख देखभाल करने के लिए ले जा रहा है, अगले रिंग में इस्तेमाल किया जा कीड़ा तनाव के साथ एक अंगूठी के लिए प्लेटों के नीचे लेबल। उसके साथ दशानुकूलन थाली के साथ परख थाली पर लेबल से मेल खाते हैं।
   5. अंतिम एकाग्रता 0 मिमी या 400 मिमी इथेनॉल (मात्रा करने के लिए वजन) इतना है कि प्रत्येक परख थाली में जोड़ने के लिए 100% इथेनॉल की राशि की गणना। एक प्रयोग के लिए (एन = 1), एक 0 मिमी और एक 400 मिमी इथेनॉल थाली वहाँ होगा; दशानुकूलन प्लेटें इथेनॉल प्राप्त नहीं है। थाली की सतह के आसपास pipetting, इथेनॉल जोड़ें। थाली सील करने के लिए प्रयोगशाला फिल्म का प्रयोग करें और इसे दो घंटे के लिए बेंच शीर्ष पर संतुलित करने की अनुमति देते हैं।
   6. 1.5 घंटा बीत गया है, परख, 2.2 कदम की दशानुकूलन कदम शुरू करते हैं।
2. हरकत परख प्रदर्शन: परख प्लेटें
   1. ध्यान से दशानुकूलन थाली पर एक तांबे की अंगूठी के केंद्र के लिए प्रत्येक प्रायोगिक समूह के 10 कीड़े हस्तांतरण। कीड़ा लेने के साथ धीरे scraping द्वारा इस बिंदु पर अगर पर दिखाई दे रहा है कि किसी भी खाद्य निकालें। एक ही उपभेदों परीक्षणों भर में एक ही क्रम में प्लेटों पर नहीं डाल रहे हैं ताकि प्रयोगात्मक समूहों प्रायोगिक परीक्षण के पार प्लेटों पर डाल रहे हैं जिस क्रम में भिन्नता है।
      नोट: लक्ष्य दशानुकूलन थाली पर खाद्य परख थाली को सौंप दिया है अगर कीड़े भोजन और हरकत पर दवा का असर छिप कर दिया जाएगा चारों ओर एकत्र करेगा, क्योंकि भोजन की न्यूनतम मात्रा के साथ थाली करने के लिए जानवरों को स्थानांतरित करने के लिए है।
   2. इस कीड़े बिल के लिए अनुमति देगा और परख बाधित करेगा, के रूप में लेने के साथ अगर की सतह को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। 30 मिनट के लिए आरटी पर कीड़े सेते हैं।
   3. प्रत्येक थाली के initiations के बीच एक उपयुक्त अंतराल सुनिश्चित करते हैं कि। एक अनुभवी प्रयोगकर्ता 40 जानवरों में चार अंगूठियां <1.5 मिनट के लिए 10 / अंगूठी ले जा सकते हैं, लेकिन दो मिनट तक किसी भी अंतराल स्वीकार्य है। मानक परख 10-12 मिनट और 0 मिमी और 400 मिमी इथेनॉल दोनों के लिए जोखिम के 30-32 मिनट में रिकॉर्डिंग फिल्में है।
   4. 0 मिमी लोगों तक पहुंचाने के लिए दशानुकूलन प्लेट और लगभग 2 मिनट और 30 सेकंड के अलावा दूसरी फिल्म शुरू करना चाहिए इससे पहले पहली फिल्म फ़ाइल की बचत के लिए अनुमति देने के लिए 400 मिमी लोगों तक पहुंचाने के लिए दशानुकूलन थाली आरंभ करें।
   5. 30 मिनट दशानुकूलन अवधि के बाद, परख प्लेटों के लिए दशानुकूलन प्लेटों से कीड़े हस्तांतरण। वे एक थाली की पूर्तियों के बीच समय का ट्रैक रखने, दशानुकूलन थाली करने के लिए जोड़ा गया था कि उसी क्रम में परख प्लेटों के लिए कीड़े (0 मिमी या 400 मिमी इथेनॉल) स्थानांतरण। वाष्पीकरण के लिए इथेनॉल के नुकसान को कम करने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ थाली सील।
   6. यूचपटी लेने के शीर्ष पर कीड़े इकट्ठा करने के लिए एक पतली धार चपटे कृमि लेने के साथ एक scooping गति से। इसे लेने के लिए कीड़ा गोंद के लिए मदद करता है के रूप में आमतौर पर कीड़े के हस्तांतरण में प्रयोग किया जाता है, जो बैक्टीरिया, के उपयोग के बिना परख थाली करने के गैरवरीय दशानुकूलन थाली से कीड़े के हस्तांतरण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: थाली पर पहले कीड़े थाली में जोड़ा पिछले कीड़े की तुलना में अब इथेनॉल को उजागर किया जाएगा, क्योंकि जानवरों के इस कदम पर स्थानांतरित कर रहे हैं जिस गति से बहुत महत्वपूर्ण है, और इससे पहले समय बिंदुओं कुछ समय निर्भर प्रभाव दिखा सकते हैं। इस उपभेदों प्रयोगात्मक प्रतिकृति भर में पहली बार एक थाली पर रखा जाता है जो घूर्णन के लिए प्रमुख कारण है।
3. हरकत परख प्रदर्शन: फिल्माने
   1. इस तरह के एक 2048x2048 7.4 के साथ एक 0.5x खुर्दबीन उद्देश्य, 0.8x बढ़ाई और एक कैमरा के रूप में देखने के क्षेत्र (लगभग 42x42 मिमी ² वर्ग) में सभी चार छल्ले के साथ इमेजिंग के लिए अनुमति देता है कि एक माइक्रोस्कोप / कैमरा संयोजन का प्रयोग करें81, एम पिक्सेल सीसीडी।
   2. तीव्रता दहलीज कदम पर वस्तु मान्यता में एड्स जो देखने के क्षेत्र भर में रोशनी भी प्रयोग करें (देखें नीचे)। एक 3 "X3" backlight के अच्छी तरह से काम करता है।
   3. छवि प्रकाश स्रोत प्रेषित एक पारंपरिक खुर्दबीन के साथ तुलना में backlight के उपयोग करते समय खो दिया है कि इसके विपरीत जो उत्पन्न एक थाली में तैनात मीडिया साइड पर कीड़े (ढक्कन नीचे),।
   4. आगे बढ़ कीड़े के समय चूक फिल्मों पर कब्जा करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर तैयार करें। एक दो मिनट (120 फ्रेम) फिल्म के रूप में, 12-बिट ग्रे पैमाने छवियाँ हर एक सेकंड पर कब्जा करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें। अभी भी पर्याप्त छवि संकल्प को बनाए रखना है, जबकि उत्पादन में फ़ाइल के आकार को कम करने के लिए, 1024x1024 पिक्सेल छवियों पर कब्जा करने के लिए एक 2x2 binning मोड का उपयोग करें।
   5. फिल्मों का रिकॉर्ड। पिछले कीड़े के बाद 10 मिनट कि थाली पर रखा गया पहला प्लेट (0 मिमी इथेनॉल) की एक 120 फ्रेम फिल्म रिकॉर्डिंग शुरू। फिल्म फ़ाइल सहेजें।
   6. दूसरी प्लेट (400 मिमी इथेनॉल) रिकॉर्ड। के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएंपिछले कीड़े के बाद 30 मिनट के शुरुआत दोनों प्लेटों के प्रत्येक लोगों तक पहुंचाने के लिए 30-32 मिनट का समय अंक पर कब्जा करने के लिए पहली प्लेट (0 मिमी इथेनॉल) पर रखा गया था।
      नोट: विश्लेषण किया जा करने के लिए अगले थाली की रिकॉर्डिंग शुरू होने से पहले प्रत्येक कब्जा सत्र के बाद छवि फ़ाइलों को बचाने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें।
   7. संग्रहीत फिल्मों का भविष्य अशुद्धि जाँच के लिए और 8 बिट 256 ग्रे स्केल झगड़ा फाइल करने के लिए प्रत्येक फिल्म की एक प्रति कन्वर्ट, इन फिल्मों खोला और ऐसे ImageJ ²⁸ के रूप में अन्य सार्वजनिक डोमेन खुला स्रोत इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम, द्वारा विश्लेषण किया जा करने की अनुमति है।
      नोट: यहाँ वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक मालिकाना फ़ाइल स्वरूप का उपयोग करता है।
4. ImagePro सॉफ्टवेयर का उपयोग फिल्मों का विश्लेषण।
   1. पर कब्जा कर लिया एक बार, छवि प्रो सॉफ्टवेयर या इसके समकक्ष प्लस का उपयोग फिल्मों का विश्लेषण।
      नोट: अन्य वस्तु ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की एक किस्म को सफलतापूर्वक कई सी नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि उपलब्ध है एक समय ²⁹ और ऐसे में एलिगेंससॉफ्टवेयर यथोचित वस्तु पहचान चरणों इसी तरह के सिद्धांतों के आधार पर कर रहे हैं यहाँ के रूप में वर्णित है कि के लिए स्थानापन्न सकता है। वर्णित विधि मामूली अंतर हो सकता है छवि प्रो प्लस सॉफ्टवेयर संस्करणों 6.0-6.3 और 7.0, छवि प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के नए संस्करणों से संबंधित है।
   2. दो मिनट (120 फ्रेम) क्षेत्रों में फिल्मों का विश्लेषण करें। सबसे पहले, पृष्ठभूमि समतल और कीड़ा वस्तुओं के विपरीत बढ़ाने के लिए छवियों के लिए एक फिल्टर लागू होते हैं। इस प्रकार के रूप फिल्टर का चयन करें: मेनू> प्रक्रिया> फ़िल्टर> संवर्धन> समतल: पैरामीटर्स: पृष्ठभूमि = डार्क; चौड़ाई = 20 पिक्स शामिल हैं।
   3. छानने के कदम के बाद फिल्मों पुनः बचा है लेकिन हमेशा अपनी अनफ़िल्टर्ड रूप में मूल फिल्म बरकरार रहती है।
      1. रखा गया है और तांबे की अंगूठी के साथ ओवरलैप करने के लिए आकार है कि ब्याज (आरओआई) के एक परिपत्र क्षेत्र के साथ अलग से एक अंगूठी में जानवरों की हरकत का विश्लेषण करें। पहचानें और मेनू> उपाय के साथ कीड़े को ट्रैक> ट्रैक ... कमांड ऑब्जेक्ट; इस ट्रैकिंग डी लाता हैअता तालिका विंडो। ट्रैकिंग विकल्प बटन विशिष्ट पटरियों बाहर रखा जाना करने के लिए और किसी भी प्रयोगात्मक कलाकृतियों को सीमित करने की अनुमति देता है।
   4. ऑटो ट्रैकिंग टैब के अंतर्गत, निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: ट्रैक पैरामीटर: वेग सीमा (खोज त्रिज्या) = 400 माइक्रोन / फ्रेम, त्वरण सीमा = ऑटो, न्यूनतम कुल ट्रैक की लंबाई = 400 माइक्रोन, प्रमुख गति प्रकार = अराजक; पटरियों मापदंडों में वस्तुओं: आंशिक पटरियों = हाँ, न्यूनतम लंबाई = 21 फ्रेम, ट्रैकिंग भविष्यवाणी गहराई = 1 फ्रेम की अनुमति दें।
   5. ट्रैकिंग प्रक्रिया आरंभ करने के लिए, स्वचालित रूप से सभी पटरियों खोजने गणना / आकार विकल्प संवाद बॉक्स और ट्रैकिंग संवाद बॉक्स को लाने के लिए बटन समारोह क्लिक करें। विश्लेषण के लिए एक कीड़ा वस्तु को उजागर करने और लाइटर पृष्ठभूमि पिक्सल की अनदेखी करने कीड़ा पिक्सल के ग्रे पैमाने पर तीव्रता का उपयोग करता है कि महत्वपूर्ण दहलीज कदम प्रदान करता है जो गणना / आकार संवाद बॉक्स में तीव्रता सीमा चयन के लिए मैनुअल विकल्प चुनें।
      1. तीव्रता दहलीज SLI समायोजित करेंders सभी अंधेरे वस्तुओं पर प्रकाश डाला गया है कि एक समावेशी रेंज बनाने के लिए (एक निचली सीमा निर्धारित करने के लिए, एक ऊपरी सीमा निर्धारित करने के लिए)। 0-4,095 के पैमाने पर 0-1,500 की एक सीमा महीन ट्यूनिंग के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
      2. ऐसे तांबे की अंगूठी और प्लेटों पर किसी भी मलबे के रूप में एक कीड़ा वस्तु से बड़ा और छोटे होते हैं कि वस्तुओं, बाहर करने के लिए एक आकार फिल्टर लागू करें। उपाय के साथ आसन की एक किस्म में व्यक्तिगत कीड़े के लिए आकार को कवर किया है कि ऐसा करने के लिए दो आकार मानकों सेट> गणना / आकार विकल्प संवाद बॉक्स संबंधी प्रवर माप मेनू आइटम। (एरिया सीमा: 28,000-120,000 माइक्रोन ^दो और परिधि सीमा: 600-2,500 माइक्रोन)।
      3. एक उत्परिवर्ती तनाव विश्लेषण किया जा करने के लिए थाली पर काफी छोटे या अन्य जानवरों से भी बड़ा है, तो सेटिंग्स परिवर्तित करने की जरूरत नहीं है, इतना है कि पहले जानवरों पर नज़र रखने से पहले उपभेदों के विभिन्न आकारों को समायोजित करने के लिए वस्तु मान्यता के लिए फ़िल्टर सेटिंग्स की सीमा को विस्तृत मध्य-विश्लेषण।
      </ ली>
   6. ट्रैकिंग संवाद बॉक्स में जारी रखें पर क्लिक करके ट्रैकिंग प्रक्रिया को पूरा करें। दिखने में स्वचालित फिल्टर सेटिंग के आधार पर यह बाहर करने के लिए एक वैध कारण नहीं है जब तक कि हर कीड़ा प्रतिनिधित्व किया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्म में एक कीड़ा की प्रगति के साथ उत्पादन पटरियों की तुलना करें। मैन्युअल आकार फिल्टर मानदंड से मुलाकात की पुष्टि की है कि गैर-कीड़ा वस्तुओं की उपस्थिति द्वारा तैयार किए गए है कि पटरियों को हटा दें।
   7. प्रत्येक फ्रेम के बीच प्रत्येक कीड़ा के वेग की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (दूरी तख्तों के बीच एक प्रति सेकंड एक वस्तु के केन्द्रक के लिए कूच) और में कीड़े की आबादी के लिए सभी पटरियों भर में प्रत्येक ट्रैक के लिए औसत वेग और औसत वेग प्रदर्शित तांबे की अंगूठी। इस अंतिम औसत प्रयोगात्मक परीक्षण के मामले में एन = 1 पर विचार करें। सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा संग्रह करने के लिए एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा निर्यात।
   8. डेटा प्लेट पर पहले की अंगूठी के लिए दर्ज किया गया है, अगले अंगूठी करने के लिए लागत पर लाभ के लिए कदम औरमापदंडों के किसी भी बदलने के बिना, ट्रैकिंग प्रक्रिया को दोहराएँ।
   9. हरकत के माध्यम से की सापेक्ष गति की गणना:
   10. सापेक्ष गति (%) = इलाज किया अनुपचारित (400 मिमी) गति / (0 मिमी) गति एक्स 100।
       नोट: अलग आनुवंशिक जोड़तोड़ अक्सर जानवरों के बेसल हरकत दर बदल। जानवरों की हरकत गति पर इथेनॉल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए और अलग जीनोटाइप या शर्तों भर में इन प्रभावों को तुलना करने में सक्षम होने के लिए आदेश में, एक रिश्तेदार गति की गणना।

Representative Results

कई अलग जीनोटाइप और उनकी बनती नियंत्रण से प्रतिनिधि डेटा (चित्रा 1) ^8,24 प्रस्तुत कर रहे हैं; डेटा विशेष रूप से assayed पशुओं में उस पर प्रकाश डाला मतभेद चुने गए हैं। जोखिम के 10 मिनट पर प्रभाव की डिग्री चित्रा 1 बी-जी में छोड़ दिया कुल्हाड़ियों पर दिखाया गया है जो एक तनाव, की प्रारंभिक संवेदनशीलता माना जाता है। 10 मिनट पर नियंत्रण से भी बड़ा एक रिश्तेदार की गति के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों, इथेनॉल (चित्रा 1F, छ) प्रतिरोधी माना जाता है, जबकि (चित्रा -1 इथेनॉल के लिए अतिसंवेदनशील माना जाता है नियंत्रण की तुलना में कम है कि एक रिश्तेदार की गति के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों, ई)। चित्रा 1 में सही कुल्हाड़ियों 10- और 30 मिनट का समय अवधि के बीच गति की वसूली की डिग्री दिखाते हैं। इस तीव्र कार्यात्मक सहिष्णुता का विकास (पीछे) की दर का एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है और रिश्तेदार विशेष से घटाया 10 मिनट पर सापेक्ष गति के रूप में गणना की है30 मिनट में एड। बड़ा वसूली मूल्यों के साथ उपभेदों के लिए (चित्रा 1C नियंत्रण जानवरों पिछाड़ी के विकास की दर कम है माना जाता है की तुलना में कम वसूली मूल्यों के साथ नियंत्रण जानवरों (चित्रा -1, एफ) और दबाव के साथ तुलना में पीछे के विकास की एक और अधिक तीव्र दर है माना जाता है , ई)। Sbp1 के लिए मापा पिछाड़ी (ep79) (चित्रा 1G) (एन 2 वसूली के खिलाफ तुलना के लिए पी = 0.08) की वजह से बड़े विचरण करने के लिए एक नकारात्मक वसूली की ओर trending लेकिन जंगली प्रकार से सांख्यिकीय अलग नहीं था है कि ध्यान दें। टब -1 एक Tubby Homolog encodes ; बीबीएस-एक मानव BBS1 करने के लिए एक Homolog encodes, होंठ-7 एक triacylglycerol लाइपेस encodes, वसा-1 एक ओमेगा -3 फैटी एसाइल desaturase encodes, वसा -3 एक डेल्टा -6 फैटी एसिड desaturase encodes, एसबीपी-1 के लिए एक Homolog encodes प्रोटीन (SREBPs) बंधन मानव स्टेरोल नियामक तत्व।

के कई महत्वपूर्ण विशेषताएं हैंडेटा के लिए ध्यान दें: प्रथम, एन 2 (जंगली प्रकार) नियंत्रण डेटा प्रयोगों भर में अलग है; इस वजह से इस तरह की प्रयोगशाला में पूर्ण पानी की सामग्री या सूखे मीडिया के नमक एकाग्रता और तापमान के रूप में नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि पर्यावरणीय कारकों, के लिए होने की संभावना है। आमतौर पर, 400 मिमी बहिर्जात इथेनॉल अनुपचारित नियंत्रण का लगभग 30% करने के लिए एन 2 की गति depresses; हालांकि अवसाद के निरपेक्ष डिग्री प्रयोग करने के लिए प्रयोग से भिन्न होता है। एन 2 में 30 मिनट से अधिक हरकत गति का लगभग 12% वसूली आमतौर पर होने की उम्मीद है, जबकि इसके अलावा, यहां फिर से संख्या बदलती हैं। महत्वपूर्ण बात है, संवेदनशीलता और पीछे प्रदर्शनी दिन-प्रतिदिन की भिन्नता का पूर्ण स्तर, जीनोटाइप या शर्तों के बीच तुलना में आम तौर पर अलग नहीं करना है। यही कारण है, जंगली प्रकार और एक उत्परिवर्ती एक दूसरे के सापेक्ष समान प्रभाव हमेशा होगा; एक उत्परिवर्ती जंगली प्रकार के लिए पिछाड़ी सापेक्ष में कमी का कारण बनता है, तो उस कमी जंगली प्रकार के द्वारा प्रदर्शन किया पिछाड़ी की राशि के साथ पैमाने पर होगा। इस पर प्रकाश डाला गयाप्रदर्शन के महत्व की तुलना में किया जा रहा है कि उपभेदों या स्थितियों के लिए एक ही समय में एक ही प्लेटों पर नियंत्रण रखा।

दूसरा, प्रारंभिक संवेदनशीलता और पीछे की phenotypes के आनुवंशिक रूप से वियोज्य हैं। कि प्रारंभिक संवेदनशीलता और एक साथ या अलग से भिन्न हो सकते हैं तीव्र कार्यात्मक सहिष्णुता नोट; उदाहरण प्रारंभिक संवेदनशीलता और पीछे स्वतंत्र रूप से अलग है जिसमें phenotypes की एक किस्म का शामिल किया गया है। Phenotypes की एक में एक परिवर्तन अन्य फेनोटाइप में एक परिवर्तन की भविष्यवाणी नहीं है, न ही यह दूसरा फेनोटाइप के परिवर्तन की दिशा की भविष्यवाणी करता है (बढ़ा या इथेनॉल के जवाब में कमी आई है या तो)।

चित्रा 1. प्रारंभिक इथेनॉल संवेदनशीलता और तीव्र कार्यात्मक सहिष्णुता (पीछे) के विकास की दर वियोज्य व्यवहार प्रतिक्रियाओं हैं। के लिए (ए) सारांश तालिकाइथेनॉल और पीछे के विकास की दर को प्रारंभिक संवेदनशीलता के स्तर पर नाम जीन में परिवर्तन के प्रभाव की दिशा, दोनों (प्रत्येक मामले में एन 2) जंगली प्रकार के नियंत्रण के साथ तुलना में कर रहे हैं। (बी जी) एक्यूट हरकत की प्रतिक्रियाएं 400 मिमी बहिर्जात इथेनॉल 10-12 मिनट और सतत इथेनॉल जोखिम के 30-32 मिनट में मापा जाता है। सापेक्ष गति (अनुपचारित गति का%) छोड़ दिया कुल्हाड़ियों पर दिखाए जाते हैं। गति में वसूली की डिग्री सही कुल्हाड़ियों पर दिखाया और कहा कि 20 मिनट के अंतराल के दौरान पिछाड़ी की दर का एक उपाय का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। इस प्रकार के रूप तुलना परीक्षणों की संख्या है: बी, सी, ई: N = 6; जी: N = 7; डी: एन = 9; एफ: एन = 11. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण तुलना (बनती टी परीक्षण) दिखाए जाते हैं: *, पी <0.05; **, पी <0.01। ^8,24 से संशोधित कर रहे हैं इस आंकड़े में प्रस्तुत ^8,24 डेटा। पीपट्टा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

सी में उपलब्ध सरल तंत्रिका जीव विज्ञान और आनुवंशिक उपकरण एलिगेंस कीड़ा व्यवहार पर इथेनॉल के प्रभावों की आणविक अड्डों का अध्ययन करने में जो एक उत्कृष्ट मॉडल बनाते हैं। यहाँ, हम ^{8,10,20,24,25} इथेनॉल के लिए तीव्र व्यवहार प्रतिक्रिया के कई आणविक और पर्यावरण मध्यस्थों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक परख का वर्णन है। इस विधि है कि एक साथ स्तनधारियों में प्रतिक्रिया के स्तर के समग्र फेनोटाइप मॉडल, भेदभाव और दो अलग अलग इथेनॉल प्रतिक्रिया व्यवहार phenotypes, प्रारंभिक संवेदनशीलता और तीव्र कार्यात्मक सहिष्णुता के विकास के साथ-साथ परीक्षा की अनुमति देता है। एक ही परख आसानी जिससे अन्य दवाओं के व्यवहार प्रभाव के आकलन में कई उपभेदों के एक साथ परीक्षण का लाभ ले रही है, अन्य औषधीय एजेंटों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

10-12 मिनट के समय खिड़की एट करने के लिए एक तनाव की प्रारंभिक संवेदनशीलता को मापने के लिए एक उपयोगी समय बिंदु प्रदान करता हैhanol। लोगों तक पहुंचाने के पहले 10 मिनट भर में 400 मिमी इथेनॉल के प्रभाव का विश्लेषण, जोखिम के दूसरे मिनट लेकिन प्रभाव का एक स्थिर राज्य में शुरुआत गति प्रभाव इथेनॉल जोखिम ²⁰ के सातवें मिनट तक हासिल नहीं कर रहा है पता चलता है। कारण हरकत गति पर इस समय पर निर्भर प्रभाव के लिए, विशेष रूप से उपभेदों प्लेट पर रखा जाता है जिस क्रम में आठवें या नौवें मिनट करने से पहले किसी भी गति माप के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है (यह सोचते हैं कि यह कीड़े के सभी जगह कम से कम 2 मिनट लगते हैं इथेनॉल प्लेट पर)। ये पहले के समय बिंदुओं पर कुछ कीड़े वे प्लेट पर पहले रखा गया था, सिर्फ इसलिए कि इथेनॉल से अधिक प्रभावित हो जाएगा। इथेनॉल के एक स्थिर प्रारंभिक प्रभाव सातवें मिनट द्वारा हासिल की है, भले ही यह कारण इथेनॉल के इस समय पर निर्भर प्रभाव के लिए उपभेदों प्लेटों पर रखा जाता है जिस क्रम में उपभेदों भर में किसी भी व्यवस्थित प्रभाव को कम करने के लिए दोहराने के परीक्षण के पार अलग किया जा सिफारिश की है कि और बेनी को कीड़े को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक समयई।

विशिष्ट मानदंडों को बार-बार तांबे की अंगूठी के साथ या अन्य कीड़े के साथ टकराने कि कीड़े से पूर्वाग्रह को कम से कम करने के लिए वस्तु पर नज़र रखने के चरणों में चुने गए हैं। वस्तु आकार फिल्टर दो कदम छू कीड़े सहित एक भी कीड़ा से बड़ा है कि ट्रैकिंग से किसी भी वस्तु, को खत्म करना चाहिए। एक कीड़ा एक और कीड़ा या तांबे की अंगूठी को छूता है तो ट्रैक समाप्त होता है और यह संपर्क में रहता है, जबकि यह अब एक वैध वस्तु के रूप में मान्यता दी जानी चाहिए। कीड़ा अन्य वस्तु के साथ संपर्क खो देता है, यह एक नई वस्तु बन जाता है और एक नया ट्रैक शुरू की। एक कीड़ा द्वारा किए गए ट्रैक की लंबाई में कम से कम 20 सेकंड है, तो यह स्वचालित रूप से 21 तख्ते की एक न्यूनतम ट्रैक की लंबाई को परिभाषित करने से बाहर रखा गया है। इस फिल्टर एक कीड़ा का उदाहरण है, फिर उस वस्तु को छूने के लिए आगे जा रहा है, फिर एक और वस्तु (कीड़ा या अंगूठी) में आगे बढ़ने के पीछे और रोकता त्वरित बदलाव के रूप में कम मुकाबलों पूर्वाग्रह जानवरों की आबादी के समग्र औसत गति कर सकते हैं। इन सेटिंग्स का उपयोग करना, मैंटी संभव है और समग्र औसत लंबाई में अधिक से अधिक से अधिक 20 सेकंड (लेकिन कम से कम 99 सेकंड) है कि एक से अधिक ट्रैक योगदान करने के लिए एक एकल कृमि के लिए असामान्य नहीं है। प्रत्येक कीड़ा ही (120 सेकंड की कुल में से) न्यूनतम ट्रैक की लंबाई 61 सेकंड बनाकर एक ही ट्रैक योगदान देता है, ताकि सेटिंग्स बदल किया जा सकता है, लेकिन अनुभवजन्य अवलोकन इस पटरियों की एक महत्वपूर्ण संख्या का सफाया कर दिया है और यह धीमी पाया गया कि निर्धारित किया है कि अन्य कीड़े से टकरा कीड़े कि कम बार से अधिक प्रतिनिधित्व होगा। वैकल्पिक रूप से, नए पटरियों तो जल्दी दो मिनट की अवधि में विश्लेषण से हटा रहे हैं और उपयोगी डेटा खो जाएगा टकराने कीड़े कि फिल्म का पहला फ्रेम के बाद शुरू हो, लेकिन करने के लिए अस्वीकृत किया जा सकता है। अंत में, तांबे की अंगूठी 10 प्रतिशत कीड़े के उपयोग के एक औसत और भी कई कीड़ा टकराव की समस्या का योगदान कई प्रतिनिधि पटरियों होने के बीच एक अच्छा समझौता का प्रतिनिधित्व करता है।

इस व्यवहार परख महत्वपूर्ण कई गया हैकीड़े में इथेनॉल प्रतिक्रिया व्यवहार के अध्ययन के लिए लाभ। एक ही थाली पर कई जीनोटाइप का एक साथ परीक्षण "। बाड़े" तांबे के उपयोग के माध्यम से संभव है इस नवाचार कई अलग फायदे हैं। सबसे पहले, इस परख में, नियंत्रण हालत या तनाव हमेशा प्रयोगात्मक हालत या तनाव, और सीधे तुलना कर रहे हैं एक साथ परीक्षण किया ही जानवरों के रूप में एक ही समय में एक ही थाली पर परीक्षण किया जाता है। व्यवहार assays अक्सर वातावरण से प्रभावित हैं, और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में दिन-प्रतिदिन की भिन्नता परख में शोर बढ़ाने के लिए और संकेतों का पता लगाने के लिए की क्षमता कम कर सकते हैं क्योंकि यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। समान परिस्थितियों में प्रयोगात्मक समूहों के पक्ष द्वारा साइड तुलना में काफी इस दृष्टिकोण का एक बड़ा फायदा है जो दिन-प्रतिदिन पर्यावरण परिवर्तन, के प्रभाव कम हो जाती है। दूसरा, तांबा बाड़े का उपयोग हरकत assays के एक में प्रदर्शन करने की अनुमति देता है जो देखने के क्षेत्र में पशुओं के लिए होता हैभोजन की bsence। भोजन से वंचित करते हैं, कीड़े जल्दी से स्थानांतरित और बैक्टीरिया की खोज में फैलाने के लिए करते हैं; छल्ले के बिना, कीड़े परख के दौरान देखने के क्षेत्र छोड़ना होगा। इसके अलावा, कीड़े कल्पना करने के लिए उन्हें आसान बना रही है, तांबा द्वारा repelled और छल्ले के बीच के करीब रहने के लिए जाते रहे हैं। कीड़े इन परख की स्थिति में तेजी से कदम तथ्य यह है कि काफी हद तक इथेनॉल के अवसादग्रस्तता प्रभाव का पता लगाने के संकल्प बढ़ जाती है; कीड़े धीरे धीरे कदम है, जब गति पहले उन्हें पता लगाने की क्षमता की मंजिल तक पहुँचने। तांबे के कीड़े को विषैला होता है कि नोट; अंगूठियां, इस प्रोटोकॉल में assayed (कई घंटे से अधिक) के छल्ले में पशुओं के ऊष्मायन बढ़ाया इथेनॉल के लिए तीव्र प्रतिक्रियाएं प्रभावित करने के लिए नहीं दिखाई देते हैं, जबकि सिफारिश नहीं है। तीसरा, इस प्रायोगिक डिजाइन के साथ, एक ही परख करने के लिए चार अलग प्रयोगात्मक समूहों के व्यवहार प्रतिक्रियाओं का आकलन कर सकते हैं। इसलिए, समय सांख्यिकीय सार्थक डेटा की कमी हुई है जमा करने के लिए ले लिया। Additi मेंएक डिजिटल फिल्म बनाई है, के बाद से पर, इस प्राथमिक डेटा की लंबी अवधि के भंडारण के लिए स्मृति अंतरिक्ष आवश्यकताओं कम हो जाती है। अंत में, प्रत्येक प्रयोग में, प्रत्येक प्रायोगिक समूह के 10 अलग-अलग जानवरों के व्यवहार की जांच की है। उन 10 व्यक्तियों की गति एक एकल परख के लिए एक समग्र गति उत्पन्न करने के लिए औसतन, इसलिए कि एन = एक परीक्षण कर रहे हैं। कई जानवरों के व्यवहार का यह औसत के आगे इन संवेदनशील व्यवहार assays में परिवर्तनशीलता कम हो जाती है, और आगे इथेनॉल प्रतिक्रिया व्यवहार पर सूक्ष्म प्रभाव का पता लगाने के संकल्प बढ़ जाती है।

किसी भी उत्परिवर्ती पशुओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए लागू जिनमें से कुछ यहाँ वर्णित विधियों, के लिए सीमाएं हैं। इस दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा उनके मापा गति एक मूल्य वें करने के लिए कम हो जाती है, क्योंकि बहुत महत्वपूर्ण कारण incoordination करने के लिए या पक्षाघात के पास, बेसल की गति को कम कर दिया है कि उत्परिवर्ती कीड़े, इथेनॉल के प्रभावों के लिए प्रतिरोध के लिए झूठा सकारात्मक रूप में पहचाना जा सकता हैपर एक विशेष इमेजिंग स्थापना के लिए सही पता लगाने की सीमा से नीचे है। सबसे वस्तु ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम दूरी तख्तों के बीच कूच को मापने के लिए जो से स्थिति के रूप में एक केन्द्रक (द्रव्यमान का केंद्र) का उपयोग के रूप में, अपने सिर चलता है कि एक स्थिर कीड़ा अभी भी केन्द्रक की स्थिति में बदलाव उत्पन्न कर सकते हैं और उस पारी पता लगाया जाएगा आंदोलन के रूप में। इसलिए एक कीड़ा के रूप में सही हरकत को मापने के लिए आदेश में शरीर की मुद्रा में सूक्ष्म बदलाव के कारण होता है की तुलना में तेजी से आगे बढ़ जाना चाहिए। इथेनॉल के संपर्क में कीड़े रुक नहीं रहे हैं, लेकिन यह इथेनॉल लोगों तक पहुंचाने के इस तकनीकी मंजिल प्रभाव नीचे गति की अपनी दरों में कमी होगी संभव है कि पहले से ही हरकत में घाटा है कि कीड़े के साथ तो वे बहुत बेबुनियाद हैं। फ्रेम के बीच समय यह ओ के लिए और अधिक मुश्किल हो जाता है और अधिक सेकंड एक से lengthened है अगर फ्रेम के बीच समय बढ़ाने से शरीर की स्थिति में बड़ा परिवर्तन, इस समस्या का समाधान नहीं करता केन्द्रक स्थिति में सूक्ष्म पारियों से पृथक करने के लिए किया जाएगा तो यह है किbject ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर एक ही कीड़ा एक ट्रैक के बजाय करीब लेकिन छू नहीं कीड़े के बीच एक ट्रैक कूद करने के लिए योगदान दे रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.