Protocol
1. Passos para executar no dia anterior ao ensaio
- Escolha L4 vermes palco para meio de crescimento nematóide fresco (NGM) placas semeadas com um gramado de OP50 E. coli e cultura-los em 20 CO / N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de vermes para permitir O perda de vermes / N.
- Apenas animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescer a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para as estirpes que têm atrasos de desenvolvimento, de modo que todos os animais testados são adultos do primeiro dia.
2. Passos a executar no dia do ensaio
- Preparação para o ensaio:
- Realizar ensaios em unseeded 60 x 15 milímetros placas NGM padrão. Seque todas as placas para ser usado em 37 ° C durante 2 horas, com tampas de folga. Para cada ensaio experimental, use quatro placas NGM secas; estes serão a 0 mm e 400 mm placas de ensaio etanol e suas placas de aclimatação de acompanhamento.
NOTA:A utilização de placas NGM é importante aqui; diferenças na composição dos blocos, em particular, a sua osmolaridade, pode afectar fortemente a resposta à dose de etanol no comportamento, isto é devido, pelo menos em parte, a alterações na quantidade de etanol acumulada pelos animais 20. Agar NGM é de 160 mOsm. - Após a secagem, pesar cada uma das placas NGM unseeded para ser utilizado no ensaio e tomar nota do peso. Determinar o volume de meio em placas com base no peso de uma placa vazia. Para aproximar a conversão do peso do agar, para o volume, assumir que os meios de comunicação pesa o mesmo que um volume igual de água.
NOTA: Os resultados mais consistentes foram encontrados com media NGM que desidratadas suficientemente que um volume original de 10 ml tem um volume de pós-secagem entre 8,3-8,9 ml. Uma alternativa para o tempo de secagem é de 2 horas para secar até que as placas atingem esta gama de volume para explicar as diferenças em incubadoras. - Derreta 4 anéis de cobre (diâmetro interno de 1.6 cm) para a superfície de cada uma das placas de agir como currais para os diferentes genótipos ou grupos de tratamento de worms.Grasp cada anel com uma pinça, e o calor de uma chama (em um forte chama de um queimador de Bunsen funciona bem) para cerca de 3 seg. Colocar imediatamente o anel em uma placa enquanto ainda mantém o anel com a pinça para impedi-lo de "salto".
- Certifique-se de que o anel assenta plana contra a superfície do agar, pressionando suavemente com a pinça em vários pontos no anel. Ao colocar o anel, ter o cuidado de deixar espaço para mais três anéis.
- Derreter os três anéis adicionais de cobre na superfície da placa, tendo o cuidado de colocá-los o mais próximo possível um do outro, de modo que todos os quatro estarão no campo de visão da câmara.
NOTA: Fazendo uma boa vedação com o agar é essencial para manter os vermes nos anéis durante o ensaio. Anéis que pular na chapa não são susceptíveis de fazer a vedação correta com o agar epode scar o agar, que permite que os vermes de toca e interfere com a visualização dos vermes. - Para cada placa de ensaio preparar uma placa de acompanhamento "aclimatação", que deve ser seco e não inoculada e não receberá qualquer etanol. Coloque quatro anéis de cobre sobre estas placas.
- Rotular o fundo das placas ao lado de cada anel com a estirpe sem-fim para ser usado no anel, tendo o cuidado para não escrever no campo de visão do próprio anel. Combinar as etiquetas na placa de ensaio com a sua placa de aclimatação que o acompanha.
- Calcula-se a quantidade de etanol a 100% para adicionar a cada placa de ensaio de modo a que a concentração final é de 0 mM ou 400 mM de etanol (em peso por volume). Para cada experiência (n = 1), haverá um 0 mM e 400 uma placa de etanol mM; placas de aclimatação não receber etanol. Adicionar o etanol, pipetando-o em torno da superfície da placa. Use filme de laboratório para selar a placa e permitir que se equilibre no cimo da bancada durante 2 horas.
- Quando tiver decorrido 1,5 horas, começa a etapa de aclimatação de ensaio, passo 2.2.
- Realizar ensaios em unseeded 60 x 15 milímetros placas NGM padrão. Seque todas as placas para ser usado em 37 ° C durante 2 horas, com tampas de folga. Para cada ensaio experimental, use quatro placas NGM secas; estes serão a 0 mm e 400 mm placas de ensaio etanol e suas placas de aclimatação de acompanhamento.
- Realizar ensaio locomoção: As placas de ensaio
- Transferir cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre sobre a placa de aclimatação. Remova qualquer alimento que é visível no agar neste momento raspando suavemente com a pick worm. Variar a ordem em que os grupos experimentais são colocados sobre as placas através de ensaios experimentais de modo a que as mesmas estirpes não são colocados nas placas na mesma ordem em todos os ensaios.
NOTA: O objectivo é o de transferir os animais para a placa com quantidades mínimas de alimentos, porque se o alimento sobre a placa de aclimatação é transferido para a placa de ensaio os vermes vai agregar em redor dos alimentos e o efeito da droga sobre a locomoção vai ser obscurecida. - Tenha cuidado para não quebrar a superfície do agar com a escolha, pois isso permitirá que os vermes de toca e pode atrapalhar o ensaio. Incubar os vermes à TA durante 30 min.
- Certifique-se que há um intervalo adequado entre as iniciações de cada placa. Um experimentador experiente pode mover-se 40 animais, 10 / anel para 4 anéis em <1,5 min, mas qualquer intervalo de até 2 min é aceitável. O ensaio padrão tem gravar filmes em 10-12 min e 30-32 min de exposição tanto para 0 mM e 400 mM de etanol.
- Iniciado a placa de aclimatação para a exposição 0 mM e a placa de aclimatação para a exposição de 400 mM a cerca de 2 min e 30 seg para além de permitir a poupança do primeiro arquivo de filme antes do segundo filme deve começar.
- Após o período de aclimatação de 30 minutos, transferir os vermes das placas de aclimatação para as placas de ensaio. Transfira os vermes para as placas de ensaio (0 mm ou 400 mm) de etanol na mesma ordem em que foram adicionados à placa de aclimatação, mantendo o controle do tempo entre as conclusões de cada placa. Selar a placa com película de laboratório para minimizar a perda de etanol a vaporização.
- Usi, um movimento de escavar com uma picareta verme fina gumes achatada para coletar vermes em cima da pick achatada. Executar a transferência de vermes a partir da placa não inoculada aclimatação à placa de ensaio, sem a utilização de bactérias, o que é comumente utilizados na transferência de vermes, uma vez que ajuda a colar o sem-fim para a retirada.
NOTA: A velocidade em que os animais são transferidos para esta etapa é muito importante, porque as primeiras vermes sobre a placa será exposta a etanol mais tempo do que os últimos vermes adicionados à placa, e pontos de tempo anteriores podem apresentar alguns efeitos dependentes do tempo. Esta é a principal razão para a rotação que as estirpes são colocados sobre uma primeira placa através de experiências em replicado.
- Transferir cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre sobre a placa de aclimatação. Remova qualquer alimento que é visível no agar neste momento raspando suavemente com a pick worm. Variar a ordem em que os grupos experimentais são colocados sobre as placas através de ensaios experimentais de modo a que as mesmas estirpes não são colocados nas placas na mesma ordem em todos os ensaios.
- Execute Locomotion Ensaio: As filmagens
- Use uma combinação de microscópio / câmera que permite a gravação simultânea de todos os quatro anéis no campo de visão (aproximadamente 42x42 mm 2 quadrado), como um objetivo 0,5x microscópio, ampliação de 0,8x e uma câmera com um 2048x2048 7,481; m CCD pixel.
- Utilize uma iluminação uniforme em todo o campo de vista, que ajuda no reconhecimento de objecto no passo limiar de intensidade (ver abaixo). A "x3" backlight 3 funciona bem.
- Imagem os vermes em uma placa posicionada do lado media para cima (tampa para baixo), o que gera contraste que se perde quando se utiliza a luz de fundo em comparação com um microscópio tradicional transmitida fonte de luz.
- Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes lapso de tempo dos vermes em movimento. Defina o software para capturar 12 bits imagens em escala de cinza a cada 1 s, como um filme de 2 min (120 frame). Para reduzir o tamanho do ficheiro de saída, mantendo a resolução de imagem suficiente, utilizar um modo de bins de 2x2 para capturar imagens 1024x1024 pixels.
- Grave filmes. Começar a gravar um filme 120-frame da primeira placa (0 mM etanol) 10 min após o último vermes foram colocados nessa placa. Salve o arquivo de filme.
- Grave a segunda placa (400 mM de etanol). Repita esse processo paraambas as placas com início 30 minutos após a última vermes foram colocados sobre a primeira placa (0 mM de etanol) para capturar os pontos 30-32 min de tempo para cada exposição.
NOTA: Aguarde o tempo suficiente para salvar os arquivos de imagem depois de cada sessão de captura antes de começar a gravação do próximo prato a ser analisado. - Para futuro à prova de filmes arquivados e permitir que esses filmes sejam abertas e analisadas por outros programas de software de imagem de código aberto de domínio público, como ImageJ 28, converter uma cópia de cada filme para 8-bit 256 arquivos TIFF em escala de cinzento.
NOTA: O software de análise de imagem descrito aqui usa um formato de arquivo proprietário.
- Análise de filmes usando software ImagePro.
- Uma vez capturado, analisar os filmes usando Imagem-Pro Plus software ou seu equivalente.
NOTA: Uma variedade de outros softwares de seguimento de objectos está disponível que foi usado com sucesso para controlar múltiplos C. elegans de uma só vez 29 e talsoftware poderia razoavelmente substituir o descrito aqui como as etapas de identificação objeto são baseadas em princípios semelhantes. O método descrito refere-se a versões com software Image Pro Plus 6,0-6,3 e 7.0, as versões mais recentes de Imagem-Pro Plus software podem ter pequenas diferenças. - Analisar filmes nos segmentos 2-min (120 frame). Em primeiro lugar, aplica um filtro para as imagens para achatar o fundo e aumentar o contraste dos objectos de vermes. Selecione o filtro da seguinte forma: Menu> Processos> Filtros> Acessórios> Nivelar: Parâmetros: Fundo = escuro; Recurso Largura = 20 Pix.
- Re-salvar os filmes após a etapa de filtragem, mas sempre manter o filme original em sua forma não filtrada.
- Analisar a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse (ROI) que está colocado e dimensionado para se sobrepor com o anel de cobre. Identificar e acompanhar os vermes com o Menu> Medida> Track Objetos ... comando; Isso traz a Rastreamento Djanela Tabela ata. O botão Opções de controle permite faixas específicas a serem excluídos e limitar quaisquer artefatos experimentais.
- Sob a guia Auto Tracking, use os seguintes parâmetros: Pista Parâmetros: limite de velocidade (raio de busca) = 400 mm / frame, limite de Aceleração = Auto, comprimento total mínimo pista = 400 mm, tipo de movimento predominante = caótico; Objetos em parâmetros faixas: Permitir faixas parciais = yes, Min comprimento = 21 frames, Acompanhando profundidade previsão = 1 quadro.
- Para iniciar o processo de rastreamento, clique no Encontrar Todos os rastreia automaticamente o botão de função para abrir a caixa de diálogo de Contagem / opções de tamanho e a caixa de diálogo Rastreamento. Selecione a opção Manual para a Seleção faixa de intensidade na caixa de diálogo Contagem / Size, que fornece o passo importante limiar que usa a intensidade da escala de cinzentos do worm pixels para destacar um objeto verme para análise e ignorar os mais leves de fundo pixels.
- Ajuste o sli limiar de intensidadeders (um para definir o limite superior, um para definir o limite inferior) para criar um intervalo inclusivo que destaca todos os objetos escuros. A gama de 0-1,500 em uma escala de 0-4,095 é um bom ponto de partida para a sintonia fina.
- Aplicar um filtro de tamanho de excluir objectos que são maiores e menores do que um único objecto sem-fim, tal como o anel de cobre e quaisquer detritos nas placas. Definir dois parâmetros de tamanho para fazer isso que cobrir tamanhos para vermes individuais em uma variedade de posturas com a medida> Selecionar Medidas item de menu na caixa de diálogo Opções de Contagem / Tamanho. (Intervalo Área: 28,000-120,000 mm 2 e gama Perimeter: 600-2,500 mm).
- Se uma estirpe mutante é significativamente menor ou maior do que outros animais na chapa a ser analisado, ampliar a gama de configurações de filtro para reconhecimento de objetos para acomodar os diferentes tamanhos das cepas primeiro antes de rastreamento de animais, para que as configurações não precisam ser alteradas meados de análise.
- Concluir o processo de rastreamento clicando em Continuar na caixa de diálogo Rastreamento. Visualmente comparar as faixas de saída com o progresso de cada verme no filme para garantir que cada verme é representada a menos que haja uma razão válida para excluí-lo com base nas definições de filtros automáticos. Exclua manualmente faixas que foram produzidos pela presença de objetos não-worm confirmaram que atenderam aos critérios de filtro de tamanho.
- Use o software para calcular a velocidade de cada verme entre cada quadro (distância percorrida para o baricentro de um objeto por 1 segundo entre os quadros) e exibir a velocidade média para cada faixa e da velocidade média de todas as faixas para a população de vermes na anel de cobre. Considere esta média final para ser n = 1 em termos de ensaios experimentais. Exportar os dados para um programa de planilha para análises estatísticas e arquivamento de dados.
- Uma vez que os dados foram registrados para o primeiro toque na placa, mova o ROI para o próximo anel erepita o processo de rastreamento, sem alterar qualquer um dos parâmetros.
- Calcular a velocidade relativa de locomoção por meio de:
- Velocidade relativa (%) = tratada (400 mm) Velocidade / não tratada (0 mm) Velocidade x 100.
NOTA: Diferentes manipulações genéticas, muitas vezes altera a taxa de locomoção basal dos animais. A fim de determinar o efeito do etanol sobre a velocidade de locomoção dos animais e para ser capaz de comparar estes efeitos em diferentes genótipos ou condições, calcular uma velocidade relativa.
- Uma vez capturado, analisar os filmes usando Imagem-Pro Plus software ou seu equivalente.
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Representative Results
Os dados representativos (Figura 1) de vários genótipos diferentes e seus controles pareados são apresentados 8,24; dados foram escolhidos especificamente que as diferenças de destaque nos animais testados. O grau de efeito de 10 min de exposição é considerada a sensibilidade inicial de uma estirpe, que é mostrada nos eixos esquerda na Figura 1B-G. Estirpes mutantes com uma maior velocidade relativa do que o controlo em 10 minutos são considerados como sendo resistentes etanol (Figura 1F, L), enquanto que as estirpes mutantes com uma velocidade relativa que é menos do que o controlo são considerados como sendo hipersensíveis a etanol (Figura 1D, E). Os eixos direita na Figura 1 mostram o grau de recuperação de velocidade entre os períodos de tempo de 10 e 30 min. Isto representa uma medida da taxa de desenvolvimento de tolerância aguda funcional (AFT) e é calculada como a velocidade relativa, a 10 min subtraído do spe relativaed em 30 min. Amostras com valores de recuperação maiores são considerados como tendo uma taxa mais rápida de desenvolvimento de AFT em comparação com o grupo controle (Figura 1D, F) e as tensões com menores valores de recuperação do que os animais de controle são considerados de menor índice de desenvolvimento de AFT (Figura 1C , E). Note-se que o AFT medida para sbp1 (ep79) (Figura 1G) está tendendo para uma recuperação negativo, mas não foi estatisticamente diferente do tipo selvagem devido à grande variação (p = 0,08 para comparação com a recuperação N2). Banheira-1 codifica um homólogo TUBBY ; bbs-1 codifica um homólogo de BBS1 humana; lábios-7 codifica uma lipase triacylglycerol; fat-1 codifica uma dessaturase acil graxo ômega-3; fat-3 codifica uma dessaturase ácido graxo delta-6; PAS-1 codifica um homólogo de humano Sterol Elemento Regulador Encadernação proteínas (SREBPs).
Existem várias características importantes dodados a serem observados: Primeiro, a N2 (tipo selvagem) dados de controle difere entre experimentos; este é provável que seja devido a fatores ambientais que são difíceis de controlar, como conteúdo absoluta água ou concentração de sal da mídia secos e temperatura em laboratório. Tipicamente, 400 mM de etanol exógeno deprime a velocidade de N2 a cerca de 30% dos controlos não tratados; no entanto, o grau absoluto de depressão varia de experiência para experiência. Além disso, enquanto a recuperação de aproximadamente 12% da velocidade de locomoção ao longo de 30 min em atmosfera de N2 é normalmente esperado, aqui novamente os números variam. É importante notar que enquanto os níveis absolutos de sensibilidade e exibem AFT variação de dia-a-dia, as comparações entre os genótipos ou condições não diferem geralmente. Ou seja, de tipo selvagem e um mutante irá sempre ter efeitos semelhantes em relação à outra; se um mutante provoca uma diminuição da AFT relativamente ao tipo selvagem, que será dimensionado com diminuição da quantidade de AFT demonstrado por tipo selvagem. Isso destacaa importância de realização controles pareados sobre as mesmas placas, ao mesmo tempo para estirpes ou condições que estão a ser comparadas.
Em segundo lugar, os fenótipos de sensibilidade inicial e AFT são geneticamente separáveis. Note-se que a sensibilidade funcional inicial e tolerância aguda pode variar em conjunto ou em separado; exemplos foram incluídos de uma variedade de fenótipos em que a sensibilidade inicial e AFT diferem de forma independente. Uma alteração em um dos fenótipos não prediz uma mudança no fenótipo outro, nem prever a mudança de direcção do segundo fenótipo (quer aumento ou diminuição da resposta ao etanol).
Figura 1. sensibilidade etanol inicial ea taxa de desenvolvimento de tolerância funcional aguda (AFT) são respostas comportamentais separáveis. Mesa (A) Resumo para odirecção dos efeitos de mutações nos genes chamados sobre o nível de sensibilidade inicial de etanol e a taxa de desenvolvimento de AFT, ambos estão em comparação com os controlos do tipo selvagem (N2 em cada caso). (B-G), as respostas de locomoção agudos a 400 mm etanol exógeno são mensurados pelo 10-12 min e 30-32 min de exposição ao etanol contínua. Velocidades relativas (%) de velocidade não tratado estão indicadas nos eixos esquerda. Os graus de recuperação de velocidade são mostrados nos eixos direita e representam uma medida da taxa de AFT durante esse intervalo de 20 min. O número de ensaios, em comparação é como se segue: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. comparações estatisticamente significativa (teste t pareado) são mostrados: *, p <0,05; **, P <0,01. 8,24 Os dados apresentados nesta figura são modificados a partir de 8,24. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A neurobiologia simples e ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans fazer o sem-fim um excelente modelo para estudar as bases moleculares dos efeitos do etanol sobre o comportamento. Aqui, nós descrevemos um ensaio que foi utilizado para identificar vários mediadores moleculares e ambientais da resposta comportamental aguda para ethanol 8,10,20,24,25. Este método permite a diferenciação e análise simultânea de dois fenótipos diferentes comportamento de resposta etanol, sensibilidade inicial e o desenvolvimento de tolerância aguda funcional, que juntamente modelar o fenótipo composto de nível de resposta em mamíferos. O mesmo ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outros agentes farmacológicos, tirando assim partido do teste simultâneo de múltiplas estirpes na avaliação dos efeitos comportamentais das outras drogas.
A janela de tempo de 10-12 min fornece um ponto de tempo útil para medir a sensibilidade inicial de uma estirpe de ethanol. A análise dos efeitos de 400 mM de etanol entre os primeiros 10 min de exposição mostra efeitos de velocidade a partir do segundo minuto de exposição, mas um efeito de estado estacionário não é conseguido até ao sétimo minuto de exposição de etanol a 20. Devido a este efeito dependente do tempo em velocidade de locomoção, a ordem em que as estirpes particulares são colocados sobre a placa será importante para qualquer medição de velocidade antes da hora VIII ou IX (assumindo que leva menos de 2 minutos para colocar todos os vermes na placa de etanol). Nesses momentos anteriores alguns vermes será mais afetada pelo etanol, simplesmente porque eles foram colocados na placa antes. Embora um efeito estável inicial de etanol é conseguida pelo sétimo minuto, recomenda-se que a ordem na qual as estirpes são colocados em placas de ser variada entre os ensaios replicados para minimizar qualquer efeito sistemático entre estirpes devido a este efeito dependente do tempo de etanol e o tempo necessário para mover a vermes para plate.
Parâmetros específicos foram escolhidos nas etapas de rastreamento de objeto para minimizar o viés de vermes que colidem repetidamente com o anel de cobre ou com outros worms. O passo filtro tamanho do objeto deve eliminar qualquer objeto de rastreamento que é maior do que um único verme, incluindo dois vermes tocantes. Se um verme toca outro worm ou o anel de cobre, em seguida, a trilha termina e ele não deve mais ser reconhecido como um objeto válido enquanto ele permanece em contato. Quando o worm perde o contato com o outro objeto, torna-se um novo objeto e inicia uma nova pista. Se a faixa feita por um sem-fim é inferior a 20 seg em comprimento, em seguida, ele é automaticamente excluído definindo uma faixa de comprimento mínimo de 21 quadros. Este filtro impede que instâncias de um sem-fim de avançar em outro objeto (worm ou anel), invertendo e, em seguida, vai para a frente para tocar uma segunda vez, como ataques curtos de reversões rápidas pode influenciar a velocidade média geral da população de animais. Usando essas configurações, it é possível e não é incomum para um único sem-fim de contribuir mais do que uma faixa que é maior do que 20 segundos de comprimento (mas menos de 99 seg) com a média global. As configurações pode ser alterada de modo que cada verme contribui apenas uma única faixa, fazendo o comprimento mínimo da faixa 61 segundos (de um total de 120 segundos), mas a observação empírica determinou que este eliminado um número significativo de faixas e verificou-se que mais lento vermes que colidiram com outros vermes menos frequência seria sobre-representados. Como alternativa, novas faixas poderia ser anulado para começar após o primeiro quadro do filme, mas, em seguida, vermes que colidem no início do período de 2 min são removidos a partir da análise e dados úteis estaria perdido. Por fim, o uso de 10 vermes por anel de cobre representa um bom compromisso entre ter várias faixas representativas que contribuem para uma média e que o problema de muitas colisões vermes.
Este ensaio comportamental tem vários importantesvantagens para o estudo do comportamento de resposta em etanol vermes. O teste simultâneo de vários genótipos na mesma placa é possível através do uso de "currais de cobre." Esta inovação tem várias vantagens distintas. Em primeiro lugar, neste ensaio, a condição de controlo ou tensão é sempre testado na mesma placa, ao mesmo tempo que a condição experimental ou estirpe, e apenas os animais testados são simultaneamente comparados directamente. Isto é de particular importância porque ensaios comportamentais são frequentemente influenciada pelo ambiente, e variação de dia-a-dia em respostas comportamentais podem aumentar o ruído no ensaio e diminui a capacidade de detectar sinais. A comparação lado-a-lado dos grupos experimentais em condições idênticas, reduz substancialmente o impacto ambiental da variação do dia-a-dia, o que é uma vantagem importante desta abordagem. Em segundo lugar, o uso de currais de cobre contém animais no campo de visão, que permite que os ensaios de locomoção para ser realizado no umbsence de alimentos. Quando privados de alimentos, vermes se mover rapidamente e tendem a se dispersar em busca de bactérias; sem os anéis, vermes deixaria o campo de visão durante o curso do ensaio. Além disso, os vermes são repelidos pelo cobre e tendem a ficar mais perto do meio dos anéis, tornando-os fáceis de visualizar. O facto de que os vermes se mover rapidamente nestas condições de ensaio aumenta significativamente a resolução para detectar efeitos depressivos de etanol; vermes quando se movem lentamente, as velocidades de atingir o piso de a capacidade de detectar os mais cedo. Note-se que o cobre é tóxico para os vermes; enquanto os anéis não parece afetar as respostas agudas ao etanol ensaiadas neste protocolo, estendeu incubação de animais nos anéis (ao longo de várias horas) não é recomendada. Em terceiro lugar, com este delineamento experimental, um único ensaio pode avaliar as respostas comportamentais de até quatro grupos experimentais diferentes. Portanto, o tempo necessário para acumular dados estatisticamente significativa é diminuída. Em additino, uma vez que um único filme digital é feita, isto diminui os requisitos de espaço de memória para armazenamento de longo prazo de dados primários. Finalmente, em cada experiência, o comportamento de 10 animais de cada grupo experimental é examinada. As velocidades desses indivíduos são em média 10 para gerar uma velocidade para um único composto de ensaio, de modo que n = 1 experimental. Este cálculo da média do comportamento de muitos animais diminui ainda mais variabilidade nestes ensaios comportamentais sensíveis, e aumenta ainda mais a resolução para detectar efeitos subtis na comportamentos de resposta ao etanol.
Mas há limites para os métodos descritos aqui, alguns dos quais se aplicam a análises comportamentais de todos os animais mutantes. Uma limitação significante desta abordagem é que os vermes mutantes que reduziram muito significativamente as velocidades basais, devido à falta de coordenação ou perto paralisia, podem ser identificadas como falsamente positivo para a resistência aos efeitos do etanol porque a sua velocidade medida diminui para um valor thna é inferior ao limiar de detecção precisa para uma estrutura de imagem particular. Como a maioria dos programas de software de rastreamento de objeto usar um baricentro (centro de massa) como a posição de que para medir a distância percorrida entre os quadros, um verme estacionário que move sua cabeça ainda pode gerar uma mudança na posição do centróide e que a mudança seria detectado como movimento. Portanto, um verme precisa estar se movendo mais rápido do que é causada por mudanças sutis na postura corporal, a fim de medir como verdadeira locomoção. Worms expostos ao etanol não estão paralisados, mas eles são muito descoordenada, então com vermes que já têm um déficit na locomoção, é possível que a exposição ao etanol diminuirá suas taxas de velocidade abaixo deste efeito piso técnico. O aumento do tempo de modo que entre os quadros maiores alterações na posição do corpo seria separáveis deslocamentos subtis na posição centróide não resolve este problema, se o tempo entre os quadros é alongada em muito mais do que 1 segundo, torna-se mais difícil para object software de monitoramento para garantir que o mesmo verme está a contribuir para uma faixa em vez de um salto de faixa entre perto, mas não tocar worms.
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Acknowledgments
Estes estudos foram apoiados por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alcoolismo e Abuso de Álcool: R01AA016837 (JCB) e P20AA017828 (AGD e JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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