Protocol
1. Stappen om te presteren op de Dag voor de Assay
- Pick L4 stadium wormen in de frisse nematode groeimedium (NGM) platen gezaaid met een gazon van OP50 E. coli, en cultuur ze op 20 CO / N. Elke test conditie vereist 10 wormen; pick een overmaat van wormen om voor O / N verlies van wormen.
- Alleen assay dieren die de eerste dag volwassenen zijn; vele mutanten groeien in een langzamer tempo dan wild-type. Pas de timing van plukken voor stammen die ontwikkelingsstoornissen vertragingen hebben, zodat alle dieren getest zijn eerste dag volwassenen.
2. Stappen om te presteren op de Dag van de Assay
- Voorbereiding voor de test:
- Voeren tests op standaard ongeplaatste 60 x 15 mm NGM platen. Droog alle platen te gebruiken bij 37 ° C gedurende 2 uur, met deksels. Voor elke experimentele studie, gebruiken vier gedroogde NGM platen; zullen dit de 0 en 400 mm en ethanol assayplaten en hun begeleidende acclimatisatie platen.
OPMERKING:Het gebruik van NGM platen is hier belangrijk; verschillen in de samenstelling van de platen, met name de osmolariteit, sterk kan de dosering respons ethanol op gedrag, dit is te wijten, althans gedeeltelijk, van veranderingen in de hoeveelheid ethanol geaccumuleerd door de dieren 20. NGM agar is 160 mOsm. - Na drogen wegen elk van de unseeded NGM platen voor gebruik in de assay en noteer het gewicht. Bepaal het volume van media in de platen op basis van het gewicht van een lege plaat. Om de conversie van gewicht van de agar volume benaderen veronderstellen dat de media weegt hetzelfde als een gelijk volume water.
LET OP: Onze meest consistente resultaten gevonden met NGM media die voldoende is uitgedroogd dat een originele 10 ml volume heeft een post-drogende volume tussen 8,3-8,9 ml. Een alternatief voor de 2 uur droogtijd te drogen tot de bakplaten op dit volumebereik te verantwoorden verschillen in incubators. - Smelt 4 koperen ringen (inwendige diameter 1.6 cm) in het oppervlak van elk van de platen als kralen van de verschillende genotypen of behandelingsgroepen van worms.Grasp elke ring met een pincet en warmte in een vlam (een sterke vlam van een Bunsen brander werkt goed) ongeveer 3 seconde Onmiddellijk de ring op een plaat terwijl de ring met de tang houden om te voorkomen dat "overslaan".
- Zorg ervoor dat de ring rust plat tegen het oppervlak van de agar door te drukken naar beneden voorzichtig met de tang op verschillende punten op de ring. Bij het plaatsen van de ring, wees voorzichtig om ruimte te laten voor een extra drie ringen.
- Smelt de drie extra koperen ringen in het oppervlak van de plaat, zorg om ze zo dicht mogelijk bij elkaar te plaatsen zodat alle vier zullen in het gezichtsveld van de camera.
OPMERKING: Een goede afdichting met de agar is essentieel om de wormen in de ringen tijdens de assay te houden. Ringen die overslaan rond op de plaat zullen waarschijnlijk niet de juiste afdichting met de agar te maken enkan agar, waardoor wormen te graven en verstoort visualiseren wormen litteken. - Voor elke testplaat bereiden een begeleidende "acclimatisatie" plaat, die moeten worden gedroogd en ongeplaatste en zal geen ethanol ontvangen. Plaats vier koperen ringen op deze platen.
- Label de onderkant van de platen naast elke ring met de worm stam voor gebruik in de ring, waarbij zorg niet schrijven in het gezichtsveld van de ring zelf. Overeenkomen met de labels op de testplaat met de bijbehorende acclimatisering plaat.
- Bereken de hoeveelheid van 100% ethanol aan elke testplaat zodat de eindconcentratie 0 mM of 400 mM ethanol (gewicht tot volume). Voor elk experiment (n = 1), zal er een 0 mM en een 400 mM ethanol plaat; acclimatisatie platen niet ethanol ontvangen. Voeg de ethanol, pipetteren rond het oppervlak van de plaat. Gebruik laboratorium folie verzegeld, en laat equilibreren op het werkblad 2 uur.
- Wanneer 1,5 uur verstreken, begint de acclimatisering stap van de assay, stap 2.2.
- Voeren tests op standaard ongeplaatste 60 x 15 mm NGM platen. Droog alle platen te gebruiken bij 37 ° C gedurende 2 uur, met deksels. Voor elke experimentele studie, gebruiken vier gedroogde NGM platen; zullen dit de 0 en 400 mm en ethanol assayplaten en hun begeleidende acclimatisatie platen.
- Locomotie assay: assayplaten
- Zorgvuldig overdracht 10 wormen van elke experimentele groep het midden van een koperen ring op de acclimatisering plaat. Verwijder alle voedsel dat zichtbaar is op de agar op dit punt door schrapen zachtjes met de worm pick is. Variëren de volgorde waarin de experimentele groepen worden op de platen in experimentele studies zodat dezelfde stammen niet worden op de platen in dezelfde volgorde in de onderzoeken.
Opmerking: Het doel is om de dieren te dragen aan de plaat met minimale hoeveelheden voedsel, want als voedsel op de acclimatisering plaat overgebracht naar de testplaat de wormen aggregeren rond het eten en het effect van het geneesmiddel op voortbeweging worden verduisterd. - Wees voorzichtig niet om het oppervlak van de agar met de pick te breken, omdat dit zal toestaan dat de wormen te graven en zal de test verstoren. Incubeer de wormen bij RT gedurende 30 min.
- Zorg ervoor dat er een geschikt interval tussen de initiaties van elke plaat. Een ervaren experimentator kan 40 dieren, 10 / ring voor 4 ringen in <1,5 min te verplaatsen, maar elke interval tot 2 min aanvaardbaar is. De standaard test heeft films opnemen op 10-12 min en 30-32 min van de blootstelling voor zowel de 0 en 400 mm ethanol.
- Inleiding van de acclimatisatie plaat voor de 0 mm belichting en de acclimatisering plaat voor de 400 mm belichting ongeveer 2 min en 30 sec uit elkaar te zorgen voor besparing van de eerste film bestand voordat de tweede film moet beginnen.
- Nadat de 30-min acclimatiseringsperiode, overdracht van de wormen uit de acclimatisering platen om de assay platen. Breng de wormen de testplaten (0 mM of 400 mM ethanol) in dezelfde volgorde waarin ze werden toegevoegd aan de acclimatisering plaat, het bijhouden van de tijd tussen de aanvullingen van elke plaat. Sluit de plaat met laboratorium film verlies van ethanol verdamping te minimaliseren.
- Use een scheppende beweging met een dunne randen afgevlakt worm pick om wormen te verzamelen op de top van de afgeplatte pick. Voer de overdracht van wormen uit de unseeded acclimatisering plaat om de testplaat zonder het gebruik van bacteriën, die gewoonlijk wordt gebruikt bij het overbrengen van wormen als het helpt om de worm lijm aan de oogst.
OPMERKING: De snelheid waarmee dieren worden overgedragen in deze stap is belangrijk omdat de eerste wormen op de plaat wordt blootgesteld aan meer dan de laatste wormen toegevoegd aan de plaat ethanol en eerdere tijdstippen kan enige tijd-afhankelijke effecten vertonen. Dit is de belangrijkste reden voor het roteren van die stammen worden op een bord als eerste over experimentele replica geplaatst.
- Zorgvuldig overdracht 10 wormen van elke experimentele groep het midden van een koperen ring op de acclimatisering plaat. Verwijder alle voedsel dat zichtbaar is op de agar op dit punt door schrapen zachtjes met de worm pick is. Variëren de volgorde waarin de experimentele groepen worden op de platen in experimentele studies zodat dezelfde stammen niet worden op de platen in dezelfde volgorde in de onderzoeken.
- Voeren Locomotion Assay: Filmen
- Gebruik een microscoop / camera combinatie die zorgt voor gelijktijdige weergave van alle vier ringen in het gezichtsveld (circa 42x42 mm2 vierkant), zoals een microscoop objectief 0,5x, 0,8x vergroting en een camera met een 2048x2048 7.481; m pixel CCD.
- Gebruik een gelijkmatige verlichting van het gezichtsveld, wat helpt bij het herkennen van objecten op de intensiteit drempel stap (zie hieronder). Een 3 "x3" backlight werkt goed.
- Afbeelding van de wormen op een bord geplaatst media-kant naar boven (deksel dicht), die contrasteren die verloren gaat wanneer u de verlichting in vergelijking met een traditionele microscoop overgedragen lichtbron genereert.
- Bereid de beeldanalyse software om time-lapse filmpjes van de bewegende wormen vangen. Stel de software voor het vastleggen 12-bit grijswaarden beelden elke 1 sec, als een 2-min (120 kader) film. Om de grootte van de output bestand te verminderen, met behoud van voldoende beeldresolutie, gebruik dan een 2x2 binning mode tot 1024x1024 pixel beelden vast te leggen.
- Noteer de films. Beginnen met het opnemen van een 120-kader filmpje van de eerste plaat (0 mm ethanol) 10 min na de laatste wormen werden op die plaat geplaatst. Sla het filmbestand.
- Noteer de tweede plaat (400 mm ethanol). Herhaal dit proces voorbeide platen beginnend 30 minuten na de laatste wormen werden geplaatst op de eerste plaat (0 mM ethanol) om de 30-32 min tijdstippen voor elke opname vangen.
OPMERKING: Zorg voor voldoende tijd om de beeldbestanden op te slaan na elke opnamesessie voor het begin van de opname van de volgende plaat te analyseren. - Voor toekomstbestendigheid van gearchiveerde films en om deze films te worden geopend en door andere publieke domein open source imaging software programma's, zoals ImageJ 28 geanalyseerd, zetten een kopie van elke film tot 8-bit 256 grijswaarden TIFF-bestanden.
OPMERKING: De software voor beeldanalyse hier beschreven maakt gebruik van een eigen bestandsindeling.
- Analyse van films met behulp ImagePro software.
- Eenmaal gevangen, het analyseren van de films met behulp van Image-Pro Plus software of het equivalent daarvan.
OPMERKING: Een verscheidenheid van andere object tracking software beschikbaar is die is gebruikt om succesvol volgen meerdere C. elegans in een keer 29 en dergelijkesoftware redelijkerwijs kon de plaats van die hier beschreven als de object identificatie stappen zijn gebaseerd op dezelfde principes. De beschreven methode heeft betrekking op Image-Pro Plus softwareversies 6,0-6,3 en 7,0, nieuwere versies van Image-Pro Plus software kunnen kleine verschillen hebben. - Analyseer films in 2-min (120 kader) segmenten. Breng eerst een filter om de beelden naar de achtergrond plat en het contrast vergroten van de worm objecten. Selecteer het filter als volgt: Menu> Proces> Filters> Toebehoren> Eén: Parameters: Achtergrond = Dark; Feature Breedte = 20 Pix.
- Re-sla de films na de filtering stap, maar altijd aan de originele film in de ongefilterde vorm.
- Analyseer de voortbeweging van dieren in elke ring afzonderlijk een cirkelvormig gebied van belang (ROI) die geplaatst en bemeten om overlapping met de koperen ring. Identificeren en volgen de wormen met de Menu> Meten> Track Objects ... commando; Dit brengt voor de tracking-Data Tabel venster. De knop Tracking Opties kunt specifieke nummers uit te sluiten en om eventuele experimentele artefacten te beperken.
- Onder het tabblad Auto Tracking, gebruikt u de volgende parameters: Track Parameters: Velocity limiet (zoekradius) = 400 pm / frame, Versnelling limiet = Auto, Minimale totale spoor lengte = 400 pm, Overheersend soort beweging = chaotisch; Objecten in tracks parameters: Sta gedeeltelijke tracks = ja, Min lengte = 21 frames, Tracking voorspelling diepte = 1 frame.
- Om het volgen proces te starten, klikt u op het zoeken Alle nummers automatisch functioneren knop aan de graaf / Size opties dialoogvenster en het Volgen dialoogvenster te openen. Selecteer de handmatige optie voor de Intensity Range Selectie in het dialoogvenster Graaf / Maat doos, die de belangrijke drempel stap die de grijs-schaal intensiteit van de worm pixels gebruikt om een worm object voor analyse te benadrukken en om te negeren de lichtere achtergrond pixels biedt.
- Pas de intensiteit drempel sliders (een tot de bovengrens te stellen, een om de ondergrens te stellen) om een inclusieve reeks die alle donkere objecten hoogtepunten te creëren. Een reeks van 0-1,500 op een schaal van 0-4,095 is een goed uitgangspunt voor veel fijner afstellen.
- Breng een maat filter om objecten die groter en kleiner dan een worm voorwerp zoals de koperen ring eventueel vuil op de platen te sluiten. Stel twee grootte parameters aan toe dat maten voor individuele wormen te dekken in een verscheidenheid van houdingen met de Measure doen> Selecteer Metingen menu-item in het dialoogvenster Graaf / Size opties doos. (Ruimte range: 28,000-120,000 um 2 en Perimeter range: 600-2,500 pm).
- Als een mutante stam significant kleiner of groter dan andere dieren op de plaat te analyseren, verbreden het bereik van de filter instellingen voor objectherkenning de verschillende afmetingen van de stammen geschikt voordat dierenvolgsystemen zodat instellingen niet te worden gewijzigd mid-analyse.
- Voltooi het volgen proces door op Doorgaan in het dialoogvenster Volgen klikken. Visueel vergelijken de uitgang tracks met de voortgang van elke worm in de film om ervoor te zorgen dat elke worm is vertegenwoordigd, tenzij er een geldige reden om het uit te sluiten op basis van de automatische filter instellingen. Tracks die werden geproduceerd door de aanwezigheid van niet-bevestigde worm objecten die de omvang filter criteria voldaan handmatig verwijderen.
- Gebruik de software om de snelheid van elke worm tussen elk frame te berekenen (afgelegde afstand voor het zwaartepunt van een object per 1 sec tussen frames) en toont de gemiddelde snelheid voor elk spoor en de gemiddelde snelheid over alle tracks voor de bevolking van wormen in de koperen ring. Beschouw dit laatste gemiddelde tot n = 1 zijn in termen van experimentele studies. De gegevens te exporteren naar een spreadsheet programma voor statistische analyses en data-archivering.
- Zodra de gegevens zijn opgenomen voor de eerste ring op de plaat, verplaats de ROI naar de volgende ring enherhaal het volgen proces, zonder dat een van de parameters.
- Bereken relatieve snelheid van voortbeweging door:
- Relatieve snelheid (%) = behandeld (400 mm) snelheid / onbehandeld (0 mm) snelheid x 100.
OPMERKING: Verschillende genetische manipulaties veranderen vaak het basale motoriek tarief van dieren. Om het effect van ethanol op de voortbeweging snelheid dieren vast en kunnen deze effecten in verschillende genotypen of voorwaarden vergelijken, berekenen relatieve snelheid.
- Eenmaal gevangen, het analyseren van de films met behulp van Image-Pro Plus software of het equivalent daarvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve gegevens (figuur 1) van verschillende genotypen en hun gepaarde controles worden gepresenteerd 8,24; gegevens werden specifiek gekozen die highlight verschillen in de geteste dieren. De mate van het effect bij 10 minuten blootstelling wordt beschouwd als de oorspronkelijke gevoeligheid van een stam, die wordt weergegeven aan de linkerkant assen in Figuur 1B-G. Mutante stammen met een relatieve snelheid groter dan de controle 10 min worden geacht resistent ethanol (figuur 1F, G), terwijl mutante stammen met een relatieve snelheid die kleiner is dan de controle worden beschouwd overgevoelig ethanol (figuur 1D, E). De juiste assen in figuur 1 blijkt de mate van herstel van de snelheid tussen de 10- en 30-min perioden. Dit is een maat voor de snelheid van ontwikkeling van acute tolerantie functionele (AFT) en wordt berekend als de relatieve snelheid 10 min afgetrokken van de relatieve speed 30 min. Stammen met grotere recovery waarden worden beschouwd als een snellere tempo van de ontwikkeling van AFT in vergelijking met controle dieren (figuur 1D, F) en stammen met een lagere herstel waarden dan de controle dieren worden beschouwd als lagere tarieven van de ontwikkeling van AFT moeten hebben (figuur 1C , E). Merk op dat de gemeten AFT voor sbp1 (ep79) (figuur 1G) is trending in de richting van een negatieve herstel, maar was niet statistisch significant verschillend van wild-type als gevolg van grote variantie (p = 0,08 voor de vergelijking tegen N2 herstel). Bad-1 codeert voor een TUBBY homoloog , BBS-1 codeert voor een homoloog menselijk BBS1, lippen-7 codeert voor een triacylglycerol lipase, vet-1 codeert voor een omega-3 vetzuur acyl desaturase, vet-3 codeert voor een delta-6 vetzuurdesaturase, SBP-1 codeert voor een homoloog menselijk Sterol Regulatory Element Binding Proteins (SREBPs).
Er zijn een aantal belangrijke eigenschappen van degegevens op te merken: Ten eerste, de N2 (wild-type) controles verschilt per experimenten; Dit is waarschijnlijk te wijten aan factoren die moeilijk te controleren zijn, zoals absolute watergehalte of zoutconcentratie van het gedroogde media en in het laboratorium. Typisch, 400 mM exogene ethanol drukt de snelheid van N2 tot ongeveer 30% van de onbehandelde controles; Maar de absolute mate van depressie varieert van experiment om te experimenteren. Verder, terwijl ongeveer 12% terugwinning van beweging snelheid over 30 min in N2 gewoonlijk verwacht ook hier de getallen variëren. Belangrijk, terwijl de absolute gevoeligheid en AFT vertonen dag tot dag variatie vergelijkingen tussen genotypen of voorwaarden niet algemeen af. Dat wil zeggen, wildtype en mutant altijd een soortgelijk effect ten opzichte van elkaar; Als een mutant veroorzaakt een verlaging AFT opzichte van het wild-type, zal die afname schaal met de hoeveelheid AFT aangetoond wildtype. Deze hoogtepuntenhet belang uitvoeringswijze gepaarde controles op dezelfde platen tegelijkertijd voor stammen of condities die worden vergeleken.
Ten tweede, de fenotypes van de initiële gevoeligheid en AFT zijn genetisch te scheiden. Merk op dat de eerste gevoeligheid en acute functionele tolerantie kunnen samen of apart variëren; voorbeelden opgenomen van verschillende fenotypes waarbij initiële gevoeligheid en AFT verschillen onafhankelijk. Een verandering in één van de fenotypen niet voorspellen een verandering in de andere fenotype, noch voorspellen de richting van de verandering van de tweede fenotype (verhoogd of verlaagd respons op ethanol).
Figuur 1. Eerste gevoeligheid ethanol en het tempo van de ontwikkeling van acute functionele tolerantie (AFT) scheidbaar gedragsreacties. (A) Overzichtstabel voor derichting van de effecten van mutaties in de genoemde genen op het niveau van de oorspronkelijke gevoeligheid voor ethanol en de mate van ontwikkeling van AFT, beide in vergelijking met de wild-type controles (N2 telkens). (B-G) Acute voortbeweging reacties tot 400 mm exogene ethanol worden gemeten op 10-12 min en 30-32 min van voortdurende blootstelling aan ethanol. Relatieve snelheid (% van onbehandelde snelheid) getoond links assen. De mate van herstel toerental staan rechts assen en vormen een maat voor de snelheid van AFT gedurende die 20 minuten interval. Het aantal studies vergeleken is als volgt: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. statistisch significante vergelijkingen (gepaarde t-tests) getoond: *, p <0.05; ** P <0,01. 8,24 De in deze figuur worden gewijzigd vanaf 8,24 data. Pleasen klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eenvoudige neurobiologie en genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in C. elegans maken de worm een uitstekend model om de moleculaire basis van de effecten van ethanol op gedrag te bestuderen. Hier beschrijven we een test die is gebruikt om verschillende moleculaire en milieu mediatoren van acute gedragsreactie tot ethanol 8,10,20,24,25 identificeren. Deze methode maakt de differentiatie en gelijktijdig onderzoek van twee verschillende ethanol responsgedrag fenotypes, aanvankelijk gevoeligheid en de ontwikkeling van acute functionele tolerantie, die samen modelleren samengestelde fenotype niveau van respons in zoogdieren. Dezelfde test kan gemakkelijk worden aangepast aan andere farmacologische middelen te bestuderen, aldus profijt trekken van het gelijktijdig testen van verschillende stammen in de beoordeling van de gedragseffecten van andere geneesmiddelen.
Het tijdvenster 10-12 min biedt een nuttige tijdstip om de eerste gevoeligheid van een stam te et metenhanol. Analyse van de effecten van 400 mM ethanol in de eerste 10 min van blootstelling toont snelheidseffecten vanaf de tweede minuut van blootstelling, maar een stabiele toestand van geringe werking tot de zevende minuut ethanol blootstelling 20. Door deze tijdsafhankelijke effect van beweging snelheid, zal de volgorde waarin het bijzonder moeilijk de plaat geplaatst belangrijk voor snelheidsmetingen voor de achtste of negende minuut (veronderstellend dat het minder dan 2 minuten voor alle wormen plaatsen op de ethanol plaat). Op deze eerdere tijdstippen zullen sommige wormen worden meer getroffen door ethanol simpelweg omdat ze op de plaat eerder werden geplaatst. Ook al is een stabiele eerste effect van ethanol wordt bereikt door de zevende minuut, is het raadzaam dat de volgorde waarin de stammen op platen worden geplaatst worden varieerden repliceren proeven aan een systematische effect tegenover stammen minimaliseren als gevolg van deze tijdsafhankelijke effect van ethanol en de tijd die nodig wormen naar de plate.
Specifieke parameters werden gekozen in het object tracking stappen om vertekening van wormen die herhaaldelijk botsen met de koperen ring of met andere wormen te minimaliseren. De grootte van het object filter stap moet een object van tracking die groter is dan een enkele worm, waaronder twee ontroerende wormen te elimineren. Als een worm raakt een andere worm of de koperen ring dan de track eindigt en het moet niet langer worden erkend als een geldige object terwijl het in contact blijft. Wanneer de worm verliest contact met het andere object, wordt een nieuw object en initieert een nieuw nummer. Als het spoor door een worm minder dan 20 seconden lang, dan wordt automatisch uitgesloten definiëren van een minimum baanlengte van 21 frames. Dit filter voorkomt dat instanties van een worm vooruit naar een ander object (worm of ring), omkeren en dan gaan uit naar dat object aan te raken, zoals korte periodes van snelle omkeringen kan vertekening van de totale gemiddelde snelheid van de populatie van de dieren. Met behulp van deze instellingen, it is mogelijk niet ongewoon voor een enkele worm meer dan één nummer dat groter is dan 20 sec lang (maar minder dan 99 sec) om de totale gemiddelde dragen. De instellingen kunnen worden gewijzigd, zodat elke worm draagt slechts een enkel spoor door het maken van de minimale lengte van een track 61 sec (op een totaal van 120 sec), maar empirische waarneming vastgesteld dat dit geëlimineerd een groot aantal nummers en het bleek dat langzamer wormen die in botsing met andere wormen minder vaak zou zijn oververtegenwoordigd. Alternatief kunnen nieuwe nummers worden afgekeurd beginnen na het eerste frame van de film maar wormen die botsen vroeg in de 2-minuten periode verwijderd uit de analyse en nuttige gegevens verloren gaan. Tenslotte, het gebruik van 10 wormen per koperring een goed compromis tussen het hebben van meerdere representatieve sporen dragen tot een gemiddelde en het probleem van te veel worm botsingen.
Deze gedrags-test heeft een aantal belangrijkevoordelen voor de studie ethanol respons gedrag bij wormen. Gelijktijdig testen van verscheidene genotypes op dezelfde plaat is mogelijk door het gebruik van koper "kralen. 'Deze innovatie heeft een aantal duidelijke voordelen. Ten eerste, in deze test de controleconditie of stam altijd getest op dezelfde plaat op hetzelfde tijdstip als de experimentele conditie of stam Alleen dieren gelijktijdig getest worden direct vergeleken. Dit is van bijzonder belang, omdat gedrags- testen worden vaak beïnvloed door het milieu en van dag tot dag verschillen in gedragsreacties kan de ruis in de assay te verhogen en de mogelijkheid om signalen te detecteren verlagen. De side-by-side vergelijking van experimentele groepen in gelijke omstandigheden aanzienlijk vermindert het effect van dag tot dag omgevingsvariatie, hetgeen een belangrijk voordeel van deze aanpak. Ten tweede, het gebruik van koper kralen dieren aanwezig in het gezichtsveld, waardoor de locomotie assays in een uit te voerenbsence van voedsel. Toen beroofd van voedsel, wormen verplaatsen snel en hebben de neiging om zich te verspreiden, op zoek naar bacteriën; zonder de ringen zouden wormen het gezichtsveld verlaat tijdens de test. Bovendien worden de wormen afgestoten door koper en gewoonlijk dichter bij het midden van de ringen blijven, waardoor ze gemakkelijk te visualiseren. Het feit dat de wormen bewegen snel in deze assay omstandigheden aanzienlijk verhoogt de resolutie depressieve effecten van ethanol detecteren; wanneer wormen langzaam, de snelheden bereikt de bodem van de mogelijkheid om ze eerder detecteren. Merk op dat koper is giftig voor de wormen; terwijl de ringen geen effect te hebben op de acute respons tot ethanol getest in dit protocol, verlengde incubatie van dieren in de ringen (gedurende enkele uren) wordt afgeraden. Ten derde, met dit experimenteel ontwerp, één test kan de gedragsreacties van maximaal vier verschillende experimentele groepen beoordelen. Daarom is de tijd die accumuleren statistisch betekenisvolle data verlaagd. In additiop, aangezien een enkele digitale film gemaakt, vermindert dit geheugen vereisten voor langdurige opslag van primaire gegevens. Tenslotte, in elk experiment, het gedrag van 10 afzonderlijke dieren van elke experimentele groep onderzocht. De snelheid van deze 10 individuen worden gemiddeld om een samengestelde snelheid een enkele assay genereren, zodat n = 1 trial. Deze middeling van het gedrag van vele dieren verder afneemt variabiliteit in deze gevoelige gedrags assays, en verhoogt verder de resolutie subtiele effecten op ethanol reactie gedrag detecteren.
Er zijn grenzen aan de hier beschreven werkwijzen, die deels op gedragsanalyses van mutante dieren. Een belangrijke beperking van deze aanpak is dat mutante wormen die zeer aanzienlijk verminderde basale snelheden vanwege incoordination of nabij verlamming, kan worden geïdentificeerd als vals positief op resistentie tegen de effecten van ethanol omdat de gemeten snelheid afneemt tot een waarde thop onder de drempel van accurate detectie voor een bepaalde beeldvorming setup. Aangezien de meeste object tracking software programma's een zwaartepunt (massamiddelpunt) de positie van waaruit meten afstand tussen frames, kan een stationaire worm die zijn kop beweegt toch bestaat een verschuiving in de positie van het zwaartepunt en die verschuiving worden gedetecteerd als beweging. Daarom is een worm moet bewegen sneller wordt veroorzaakt door kleine verschuivingen in lichaamshouding om als echte voortbeweging meten. Wormen blootgesteld aan ethanol niet verlamd, maar ze zijn zeer ongecoördineerd, zodat wormen die al een tekort in beweging is het mogelijk dat blootstelling ethanol hun snelheden onder dit technisch bodemeffect afnemen. Het verhogen van de tijd tussen frames zodat grotere veranderingen in houding gescheiden van subtiele veranderingen in zwaartepunt positie zou niet dit probleem, als de tijd tussen frames verlengd meer dan 1 seconde wordt het moeilijker voor object tracking software om ervoor te zorgen dat dezelfde worm is bij te dragen aan een nummer in plaats van een track springen tussen dicht, maar niet aanraken van wormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studies werden ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Alcoholisme en alcoholmisbruik: R01AA016837 (JCB) en P20AA017828 (AGD en JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
