Protocol
1. procedura per eseguire il giorno prima del test
- Scegli L4 vermi stadio a fresco mezzo di crescita nematode (NGM) piastre seminate con un prato di OP50 E. coli, e la cultura a 20 CO / N. Ogni condizione test richiede 10 vermi; scegliere un eccesso di vermi per consentire O / N perdita di vermi.
- Animali solo test che sono gli adulti del primo giorno; molti mutanti crescono a una velocità più lenta di tipo selvaggio. Regolare i tempi di raccolta per i ceppi che hanno ritardi di sviluppo in modo che tutti gli animali testati sono adulti primo giorno.
2. procedura per eseguire il Giorno del saggio
- Preparazione per il saggio:
- Effettuare test su 60 x 15 millimetri piastre non teste di serie standard di NGM. Asciugare tutti piatti da utilizzare a 37 ° C per 2 ore, con coperchio off. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM secchi; questi saranno gli 0 e 400 mm piastre test etanolo e i loro piatti di acclimatazione di accompagnamento.
NOTE:L'uso di piastre NGM è importante; differenze nella composizione delle piastre, in particolare la loro osmolarità, possono influenzare fortemente la risposta dose di etanolo sul comportamento, ciò è dovuto, almeno in parte, ai cambiamenti nella quantità di etanolo accumulata dagli animali 20. NGM agar è di 160 mOsm. - Dopo l'essiccazione, pesano ciascuna delle piastre NGM non teste di serie da utilizzare nel dosaggio e nota il peso. Determinare il volume del supporto nelle piastre base al peso di un piatto vuoto. Per approssimare la conversione del peso del agar a volume, si supponga che il supporto pesa la stessa di un uguale volume di acqua.
NOTA: I nostri risultati più consistenti sono stati trovati con i media NGM che ha disidratati sufficientemente che un volume originale 10 ml ha un volume di post-essiccazione tra 8,3-8,9 ml. Un'alternativa al tempo secco 2 hr è asciugare le piastre fino a raggiungere questa gamma volume per tenere conto delle differenze in incubatrici. - Sciogliere 4 anelli di rame (diametro interno di 1.6 cm) nella superficie di ciascuna delle piastre di agire come recinti per i diversi genotipi o gruppi di trattamento di worms.Grasp ogni anello con una pinza, e calore in una fiamma (forte fiamma di un becco Bunsen funziona bene) per circa 3 sec. Porre immediatamente l'anello su un piatto, mentre ancora in mano l'anello con le pinze per evitare che 'saltare'.
- Assicurarsi che l'anello poggia piatta contro la superficie del agar premendo leggermente con la pinza in diversi punti sull'anello. Quando si posiziona l'anello, attenzione a lasciare spazio per altri tre anelli.
- Sciogliere i tre anelli di rame aggiuntivi nella superficie della piastra, avendo cura di posizionare il più vicino possibile tra loro in modo che tutti e quattro sarà nel campo visivo della telecamera.
NOTA: Fare una buona tenuta con l'agar è essenziale per mantenere i vermi negli anelli durante il dosaggio. Anelli che saltano intorno sul piatto è improbabile che rendere la tenuta corretta con l'agar epuò cicatrice l'agar, che permette vermi scavano e interferisce con la visualizzazione dei vermi. - Per ogni piatto saggio preparare un piatto di accompagnamento "acclimatazione", che dovrebbe essere essiccata e testa di serie e riceverà nessun etanolo. Mettere quattro anelli di rame su queste tavole.
- Etichettare il fondo delle piastre adiacenti anello con il ceppo vite senza fine per essere utilizzato nell'anello, avendo cura di non scrivere nel campo visivo dell'anello stesso. Far corrispondere le etichette sulla piastra test con la piastra di acclimatazione di accompagnamento.
- Calcolare la quantità di etanolo al 100% da aggiungere a ciascuna piastra di test in modo che la concentrazione finale è 0 mM o etanolo mM 400 (peso a volume). Per ogni esperimento (n = 1), ci sarà un 0 mM ed una piastra 400 mM etanolo; piastre acclimatazione non ricevono etanolo. Aggiungere l'etanolo, pipettando intorno alla superficie della piastra. Utilizzare pellicola di laboratorio per sigillare la piastra e lasciarlo equilibrare sul banco per 2 ore.
- Trascorso 1,5 ore, iniziare la fase di acclimatazione del dosaggio, passo 2.2.
- Effettuare test su 60 x 15 millimetri piastre non teste di serie standard di NGM. Asciugare tutti piatti da utilizzare a 37 ° C per 2 ore, con coperchio off. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM secchi; questi saranno gli 0 e 400 mm piastre test etanolo e i loro piatti di acclimatazione di accompagnamento.
- Eseguire test locomozione: lastre Assay
- Trasferire accuratamente 10 vermi di ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra acclimatazione. Rimuovere qualsiasi alimento che è visibile sull'agar a questo punto raschiando delicatamente con il pick verme. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali sono messi sulle piastre attraverso prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non vengono messi sulle piastre nello stesso ordine in tutti gli studi.
NOTA: L'obiettivo è quello di trasferire gli animali alla piastra con quantità minime di cibo, perché se cibo sul piatto acclimatazione viene trasferito alla piastra di dosaggio i vermi aggregare attorno al cibo e l'effetto del farmaco sulla locomozione sarà oscurata. - Fare attenzione a non rompere la superficie del agar con il plettro, in quanto questo permetterà ai vermi di tana e interromperà il dosaggio. Incubare i vermi a temperatura ambiente per 30 min.
- Assicurarsi che vi sia un intervallo adeguato tra le iniziazioni di ogni piatto. Uno sperimentatore esperto può muovere 40 animali, 10 / anello per 4 anelli in <1,5 min, ma qualunque intervallo fino a 2 minuti è accettabile. Il test standard è la registrazione di filmati a 10-12 min e 30-32 minuti di esposizione sia per 0 mm e 400 mm di etanolo.
- Avviare la piastra acclimatazione per l'esposizione 0 mm e la piastra di acclimatazione per l'esposizione 400 mm circa 2 min e 30 sec a parte per consentire il risparmio del primo filmato prima del secondo filmato deve iniziare.
- Dopo il periodo di acclimatazione di 30 min, trasferire i vermi dalle piastre acclimatazione alle piastre di saggio. Trasferire i vermi alle piastre di saggio (0 mM o etanolo 400 mM) nello stesso ordine in cui sono stati aggiunti alla piastra acclimatazione, tenere traccia del tempo tra i completamenti di ogni piastra. Sigillare la piastra con la pellicola di laboratorio per minimizzare la perdita di etanolo per evaporazione.
- USE un movimento scavare con un pick verme sottile taglio appiattito per raccogliere i vermi in cima alla scelta appiattito. Eseguire il trasferimento di vermi dalla piastra acclimatazione unseeded alla piastra dosaggio senza l'uso di batteri, che è comunemente usato nel trasferimento vermi quanto contribuisce a incollare il verme al ritiro.
NOTA: La velocità alla quale gli animali vengono trasferiti in questo passaggio è molto importante perché le prime vermi sulla piastra saranno esposti ad etanolo più lungo degli ultimi vermi aggiunti alla piastra, e precedenti punti di tempo può mostrare alcuni effetti dipendenti dal tempo. Questa è la ragione principale per la quale i ceppi rotazione sono posti su una piastra prima attraverso repliche sperimentali.
- Trasferire accuratamente 10 vermi di ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra acclimatazione. Rimuovere qualsiasi alimento che è visibile sull'agar a questo punto raschiando delicatamente con il pick verme. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali sono messi sulle piastre attraverso prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non vengono messi sulle piastre nello stesso ordine in tutti gli studi.
- Eseguire Locomotion Assay: riprese
- Utilizzare una combinazione microscopio / macchina che permette l'imaging simultaneo di tutti i quattro anelli nel campo visivo (42x42 mm 2 circa quadrata), ad esempio un obiettivo microscopio 0.5x, 0.8x ingrandimento e una fotocamera con 2048x2048 7.481; m CCD pixel.
- Utilizzare illuminazione uniforme in tutto il campo di vista, che aiuta a riconoscimento di oggetti nella fase soglia di intensità (vedi sotto). A 3 "x3" retroilluminazione funziona bene.
- Immagine i vermi su una piastra di supporto posizionata rivolta verso l'alto (coperchio verso il basso), che genera contrasto che si perde quando si usa la retroilluminazione rispetto ad un microscopio tradizionale trasmessa sorgente luminosa.
- Preparare il software di analisi di immagine per catturare filmati time-lapse dei vermi in movimento. Impostare il software per catturare le immagini in scala di grigi a 12 bit ogni 1 sec, come 2-min (120 frame) del filmato. Per ridurre la dimensione del file di output, pur mantenendo la risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzare una modalità binning 2x2 per catturare immagini 1024x1024 pixel.
- Registrare i film. Iniziare la registrazione di un filmato 120-frame della prima piastra (0 etanolo mM) 10 min dopo gli ultimi vermi sono stati posti su quel piatto. Salvare il file del filmato.
- Registrare il secondo piatto (etanolo 400 mm). Ripetere questo processo perentrambi i piatti iniziano 30 minuti dopo le ultime vermi sono stati collocati sul primo piatto (0 etanolo mm) per catturare i 30-32 punti min di tempo per ogni esposizione.
NOTA: Lasciare il tempo sufficiente per salvare i file di immagine dopo ogni sessione di acquisizione prima di iniziare la registrazione della targa accanto da analizzare. - Per il futuro-proofing di film archiviati e permettere questi film di essere aperti e analizzati da altri programmi software di imaging open source di dominio pubblico, come ImageJ 28, convertire una copia di ogni film a 8-bit 256 file TIFF in scala di grigi.
NOTA: Il software di analisi delle immagini qui descritto utilizza un formato di file proprietario.
- Analisi di filmati utilizzando software ImagePro.
- Una volta catturato, analizzare i filmati utilizzando Immagine-Pro Plus software o il suo equivalente.
NOTA: Una varietà di altri software di monitoraggio oggetto è disponibile che è stato utilizzato per monitorare con successo molteplici C. elegans contemporaneamente 29 e talesoftware potrebbe ragionevolmente sostituire quello descritto qui come le misure di identificazione degli oggetti si basano su principi simili. Il metodo descritto si riferisce alle versioni Immagine-Pro Plus software 6,0-6,3 e 7.0, le versioni più recenti di Immagine-Pro Plus software può avere piccole differenze. - Analizzare i film in 2-min (120 frame) segmenti. Innanzitutto, applicare un filtro alle immagini per appiattire lo sfondo e migliorare il contrasto degli oggetti vermi. Selezionare il filtro come segue: Menu> Processo> Filtri> Miglioramento> appiattire: Parametri: background = scuro; Caratteristica Width = 20 Pix.
- Re-salvare i filmati dopo la fase di filtraggio, ma mantenere sempre il film originale nella sua forma non filtrato.
- Analizzare la locomozione di animali in ciascun anello separatamente con una regione circolare di interesse (ROI) che è posto e dimensionata per sovrapporsi con l'anello di rame. Identificare e seguire i vermi con il Menu> Misura> Traccia oggetti ... di comando; questo porta il monitoraggio Dfinestra Tabella ata. Il pulsante Opzioni di monitoraggio permette brani specifici da escludere e per limitare eventuali artefatti sperimentali.
- Nella scheda Auto Tracking, utilizzare i seguenti parametri: parametri di traccia: il limite di velocità (il raggio di ricerca) = 400 micron / telaio, limite di accelerazione = Auto, Lunghezza minima traccia totale = 400 micron, predominante tipo di movimento = caotico; Oggetti in parametri tracce: Lasciare tracce parziali = yes, lunghezza minima = 21 fotogrammi, Carrellata profondità previsione = 1 fotogramma.
- Per avviare il processo di monitoraggio, fare clic sul Trova tutte le canzoni automaticamente tasto di funzione per aprire la finestra di dialogo Count / opzioni di formato e la finestra di dialogo di monitoraggio. Selezionare l'opzione manuale per la Selezione campo di intensità nella finestra di dialogo Conte / dimensione, che fornisce l'importante passo soglia che utilizza l'intensità in scala di grigi del worm pixel per evidenziare un oggetto verme di analisi e di ignorare i precedenti più leggeri pixel.
- Regolare la sli soglia intensitàders (uno per impostare il limite superiore, uno per impostare il limite inferiore) per creare un intervallo compreso che mette in evidenza tutti gli oggetti scuri. Una gamma di 0-1,500 su una scala da 0-4,095 è un buon punto di partenza per la sintonizzazione fine.
- Applicare un filtro per escludere dimensioni oggetti che sono più grandi e più piccolo di un singolo oggetto senza fine, come l'anello di rame e detriti sulle piastre. Impostare due parametri di dimensione per fare questo che riguardano le dimensioni dei singoli vermi in una varietà di posizioni con la misura> Select Misure voce di menu nella finestra di dialogo Opzioni Count / Taglia. (Range Area: 28,000-120,000 micron 2 e Fascia perimetrale: 600-2,500 micron).
- Se un ceppo mutante è significativamente più piccolo o più grande di altri animali sulla piastra da analizzare, ampliare la gamma delle impostazioni di filtro per il riconoscimento di oggetti per accogliere le diverse dimensioni dei ceppi prima di inseguimento animali così che le impostazioni non devono essere modificate mid-analisi.
- Completare il processo di monitoraggio facendo clic su Continua nella finestra di dialogo di monitoraggio. Confrontare visivamente le piste di uscita con il progresso di ogni verme nel film per assicurare che ogni worm è rappresentato meno che ci sia un motivo valido per escludere che in base alle impostazioni del filtro automatico. Eliminare manualmente brani che sono stati prodotti dalla presenza di oggetti confermati non vermi che hanno soddisfatto i criteri di filtro dimensioni.
- Utilizzare il software per calcolare la velocità di ogni verme tra ogni fotogramma (distanza percorsa per il baricentro di un oggetto per 1 sec tra i fotogrammi) e visualizza la velocità media per ogni traccia e la velocità media di tutte le tracce per la popolazione di vermi in anello di rame. Considerate questo media finale sia n = 1 in termini di prove sperimentali. Esportare i dati in un foglio di calcolo per analisi statistiche e l'archiviazione dei dati.
- Una volta che i dati sono stati registrati per il primo anello sulla piastra, spostare la ROI all'anello successivo eripetere il processo di monitoraggio, senza modificare alcun parametro.
- Calcola la velocità relativa di locomozione attraverso:
- Velocità relativa (%) = trattati (400 mm) Velocità / grezzo (0 mm) Velocità x 100.
NOTA: diverse manipolazioni genetiche spesso alterano il tasso di locomozione basale di animali. Al fine di determinare l'effetto di etanolo sulla velocità locomozione degli animali e per poter confrontare questi effetti attraverso diversi genotipi o condizioni, calcolare una velocità relativa.
- Una volta catturato, analizzare i filmati utilizzando Immagine-Pro Plus software o il suo equivalente.
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Representative Results
Dati rappresentativi (Figura 1) da diversi genotipi differenti ed i loro controlli appaiati vengono presentati 8,24; i dati sono stati appositamente scelti che le differenze evidenziano negli animali testati. Il grado di effetto a 10 minuti di esposizione è considerata la sensibilità iniziale di un ceppo, che è visualizzata sullo assi sinistra in Figura 1B-G. Ceppi mutanti con una velocità relativa più grande del controllo a 10 min sono considerati resistenti (Figura 1F, G) etanolo, mentre i ceppi mutanti con una velocità relativa che è inferiore rispetto al controllo sono considerati ipersensibile in etanolo (Figura 1D, E). Gli assi di destra in figura 1 mostrano il grado di recupero della velocità tra i periodi di tempo 10 e 30 min. Ciò rappresenta una misura della velocità di sviluppo di tolleranza acuta funzionale (AFT) e viene calcolata la velocità relativa a 10 min sottratto dal relativo speed a 30 min. Ceppi con valori di recupero più grandi sono considerati avere un ritmo più rapido di sviluppo di AFT rispetto agli animali di controllo (Figura 1D, F) e ceppi con valori di recupero inferiori rispetto agli animali di controllo sono considerati ad avere tassi più bassi di sviluppo di AFT (Figura 1C , E). Si noti che l'AFT misurato per SBP1 (ep79) (Figura 1G) è in trend verso un recupero negativo, ma non era statisticamente differente da tipo selvaggio a causa di grande varianza (p = 0,08 per il confronto con il recupero N2). Vasca-1 codifica per una omologo TUBBY ; bbs-1 codifica per una omologa a BBS1 umana, labbra-7 codifica una lipasi trigliceridi, i grassi-1 codifica per un desaturasi acile grassi omega-3, i grassi-3 codifica un acido grasso desaturasi delta-6; SBP-1 codifica per una omologa a umana Sterol elemento normativo vincolante Proteine (SREBPs).
Ci sono diverse caratteristiche importanti delDati da notare: In primo luogo, la N2 (wild-type) dati di controllo varia da esperimenti; questo è probabilmente dovuto a fattori ambientali che sono difficili da controllare, come il contenuto assoluta acqua o concentrazione salina del supporto essiccati e temperatura in laboratorio. Tipicamente, 400 mM etanolo esogena deprime la velocità di N2 a circa il 30% dei controlli non trattati; tuttavia il grado assoluto di depressione varia da esperimento a esperimento. Inoltre, mentre circa il 12% di recupero di velocità locomozione oltre 30 min in N2 è generalmente previsto, anche qui i numeri variano. È importante sottolineare che, mentre i livelli assoluti di sensibilità e mostra AFT variazione giorno per giorno, i confronti tra genotipi o condizioni in genere non differiscono. Cioè, wild-type e mutante avrà sempre effetti simili rispetto all'altro; se un mutante provoca una diminuzione AFT rispetto al wild-type, tale diminuzione si scala con la quantità di AFT dimostrata da wild type. Questo mette in evidenzal'importanza di effettuazione accoppiato controlli sulle stesse piastre contemporaneamente per i ceppi o condizioni che vengono confrontati.
In secondo luogo, i fenotipi di sensibilità e AFT iniziale sono geneticamente separabili. Si noti che sensibilità iniziale e tolleranza acuta funzionale può variare insieme o separatamente; esempi sono stati inclusi di una varietà di fenotipi in cui sensibilità e AFT iniziale differiscono in modo indipendente. Un'alterazione in uno dei fenotipi non predice un cambiamento nel fenotipo altro, né prevedere la direzione del cambiamento del secondo fenotipo (aumentato o diminuito risposta a etanolo).
Figura 1. sensibilità etanolo iniziale e il tasso di sviluppo di tolleranza funzionale acuta (AFT) sono le risposte comportamentali separabili. Tabella (A) Riepilogo per ladirezione di effetti di mutazioni nei geni denominati a livello di sensibilità iniziale in etanolo e la velocità di sviluppo di AFT, entrambi sono in confronto con i controlli wild-type (N2 in ciascun caso). (B-G) risposte acute locomozione a 400 mm di etanolo esogeno sono valutati a 10-12 min e 30-32 minuti di esposizione etanolo continua. Velocità relativa (% della velocità non trattato) sono riportati sugli assi sinistra. I gradi di recupero di velocità sono riportati sugli assi destra e rappresentano una misura del tasso di AFT durante tale intervallo di 20 min. Il numero di prove rispetto è la seguente: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11. confronti statisticamente significative (t-test appaiati) sono riportati: *, p <0.05; **, P <0,01. 8,24 I dati presentati in questa figura sono modificati da 8,24. Pleasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La semplice neurobiologia e strumenti genetici disponibili in C. elegans rendere il worm un ottimo modello in cui studiare le basi molecolari degli effetti di etanolo sul comportamento. Qui, descriviamo un metodo che è stato utilizzato per individuare alcuni mediatori molecolari ed ambientali della risposta comportamentale acuta etanolo 8,10,20,24,25. Questo metodo consente la differenziazione e l'esame simultaneo di due diversi fenotipi comportamento di risposta etanolo, sensibilità iniziale e lo sviluppo di tolleranza acuta funzionali, che insieme modellare il fenotipo composita di livello di risposta nei mammiferi. Lo stesso dosaggio può essere facilmente adattato per studiare altri agenti farmacologici, sfruttando così il test simultaneo di più ceppi nella valutazione degli effetti comportamentali di altri farmaci.
La finestra di tempo di 10-12 min fornisce un punto di tempo utile per misurare sensibilità iniziale di un ceppo di etHANOL. Analisi degli effetti di etanolo 400 mM di tutti i primi 10 minuti di esposizione mostra effetti di velocità a partire dal secondo minuti di esposizione, ma uno stato costante di effetto non si ottiene fino al settimo minuto di etanolo esposizione 20. A causa di questo effetto tempo-dipendente dalla velocità locomozione, l'ordine in cui i ceppi particolari sono collocati sulla piastra sarà importante per le misure di velocità precedenti al minuto ottavo o nono (supponendo che richiede meno di 2 min per posizionare tutti i vermi sulla piastra etanolo). In questi momenti precedenti alcuni vermi saranno più colpiti da etanolo semplicemente perché sono stati collocati sul piatto in precedenza. Anche se un effetto iniziale stabile di etanolo è raggiunto dalla settima minuti, si raccomanda che l'ordine in cui i ceppi sono posti su piastre essere variata attraverso prove ripetute per minimizzare qualsiasi effetto sistematico di tutti i ceppi causa di questo effetto dipendente dal tempo di etanolo e il tempo necessario per spostare vermi alla piattaformae.
Parametri specifici sono stati scelti nelle fasi di monitoraggio oggetto per minimizzare i bias da worm che si scontrano ripetutamente con l'anello di rame o con altri worm. Il passo del filtro formato oggetto dovrebbe eliminare qualsiasi oggetto da monitoraggio che è più grande di un singolo verme, tra cui due vermi toccanti. Se un worm tocca un altro verme o l'anello di rame poi la pista finisce e non dovrebbe più essere riconosciuto come un oggetto valido mentre rimane in contatto. Quando la vite senza fine perde il contatto con l'altro oggetto, diventa un nuovo oggetto e avvia una nuova traccia. Se la traccia fatta da una vite senza fine è inferiore a 20 sec di lunghezza, viene automaticamente escluso definendo una lunghezza minima traccia di 21 frame. Questo filtro impedisce le istanze di un verme andare avanti in un altro oggetto (verme o un anello), inversione e poi andare avanti per toccare di nuovo l'oggetto, come brevi attacchi di inversioni veloci possono influenzare la velocità media complessiva della popolazione di animali. Utilizzando queste impostazioni, it è possibile e non è raro che un singolo senza fine di contribuire più di una traccia che è maggiore di 20 sec di lunghezza (ma meno di 99 sec) alla media complessiva. Le impostazioni possono essere modificate in modo che ogni verme contribuisce solo una singola traccia rendendo la lunghezza minima traccia 61 sec (su un totale di 120 sec), ma osservazione empirica determinato che questo eliminato un numero significativo di tracce e si è constatato che lento worm che si scontrò con altri worm meno frequentemente sarebbero sovrarappresentate. In alternativa, nuove tracce potrebbero essere annullato per iniziare dopo il primo fotogramma del filmato, ma poi i vermi che si scontrano all'inizio del periodo di 2 minuti vengono rimossi dalla analisi e dati utili sarebbe perduto. Infine, l'uso di 10 vermi per anello di rame rappresenta un buon compromesso tra l'avere più tracce rappresentativi contribuiscono ad una media e il problema di troppi collisioni vermi.
Questo test comportamentale ha diverse importantivantaggi per lo studio dei comportamenti di risposta etanolo in vermi. Test simultaneo di diversi genotipi sulla stessa piastra è possibile attraverso l'uso di rame "recinti". Questa innovazione ha diversi vantaggi. Innanzitutto, in questo saggio, la condizione di controllo o ceppo è sempre testato sulla stessa piastra allo stesso tempo come condizione sperimentale o ceppo, e soltanto gli animali esaminati simultaneamente vengono confrontati direttamente. Questo è di particolare importanza perché saggi comportamentali sono spesso influenzate dall'ambiente e giorno per giorno variazione risposte comportamentali possono aumentare il rumore nel saggio e diminuire la capacità di rilevare segnali. Il confronto side-by-side dei gruppi sperimentali in condizioni identiche diminuisce sensibilmente l'impatto del giorno per giorno variazioni ambientali, che è un grande vantaggio di questo approccio. In secondo luogo, l'uso di recinti rame contiene animali nel campo visivo, che consente ai saggi locomozione da eseguire in unbsence di cibo. Quando privati di cibo, vermi si muovono velocemente e tendono a disperdersi in cerca di batteri; senza gli anelli, vermi lascerebbero il campo visivo nel corso del test. Inoltre, i vermi sono respinti da rame e tendono a rimanere più vicino al centro degli anelli, che li rende facile da visualizzare. Il fatto che i vermi muovono velocemente in queste condizioni di analisi aumenta notevolmente la risoluzione per rilevare effetti depressivi di etanolo; quando vermi muovono lentamente, le velocità raggiungono il pavimento della capacità di rilevare loro in precedenza. Si noti che il rame è tossico per i vermi; mentre gli anelli non sembrano influenzare le risposte acute di etanolo analizzati in questo protocollo, incubazione di animali negli anelli (più di alcune ore) esteso non è raccomandato. In terzo luogo, questo disegno sperimentale, un singolo test può valutare le risposte comportamentali fino a quattro diversi gruppi sperimentali. Pertanto, il tempo necessario per accumulare statisticamente dati significativi diminuisce. In additisu, dal momento che un singolo film digitale è fatto, questo riduce i requisiti di spazio di memoria per la conservazione a lungo termine dei dati primari. Infine, in ogni esperimento, il comportamento di 10 animali di ciascun gruppo sperimentale viene esaminato. Le velocità di quei 10 individui sono mediati per generare una velocità composito per un singolo test, così che n = 1 studio. Questa media del comportamento di molti animali diminuisce ulteriormente la variabilità in questi test comportamentali sensibili, e aumenta ulteriormente la risoluzione di rilevare effetti sottili sui comportamenti di risposta etanolo.
Ci sono limitazioni per i metodi qui descritti, alcuni dei quali si applicano alle analisi comportamentali di tutti gli animali mutanti. Un limite significativo di questo approccio è che i vermi mutanti che hanno ridotto significativamente molto velocità basali, causa incoordination zona paralisi, possono essere identificati come falsamente positive per la resistenza agli effetti di etanolo perché la loro velocità misurata diminuisce ad un valore tha è inferiore alla soglia di rilevamento accurato per una particolare configurazione di imaging. Poiché la maggior parte dei programmi software di monitoraggio oggetto utilizzano un centroide (centro di massa) come posizione da cui misurare la distanza percorsa tra fotogrammi, un verme stazionaria che muove la testa può comunque generare uno spostamento della posizione del baricentro e quello spostamento verrebbe rilevato il movimento. Pertanto un verme deve muoversi più velocemente che è causata da variazioni sottili postura del corpo al fine di misurare come vero locomozione. Worms esposti all'etanolo non sono paralizzati, ma sono molto scoordinato, in modo da vermi che hanno già un deficit di locomozione, è possibile che l'esposizione etanolo diminuirà i loro tassi di velocità sotto questo effetto tecnico piano. Aumentare il tempo tra i fotogrammi in modo che i cambiamenti più grandi nella posizione del corpo sarebbe separabile da cambiamenti sottili in posizione baricentro non risolve il problema, se il tempo tra i fotogrammi si allunga molto di più di 1 sec diventa più difficile per object software di monitoraggio per garantire che lo stesso verme sta contribuendo a una traccia piuttosto che un salto binario tra vicini, ma non toccare i vermi.
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Acknowledgments
Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni dal National Institutes of Health, Istituto Nazionale per l'alcolismo e abuso di alcool: R01AA016837 (JCB) e P20AA017828 (AGD e JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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