一种从凝结的骨髓样本中回收间充质干细胞的酶解方法

摘要

间充质干细胞通常来源于骨髓，需要进行扩增培养。当样本在处理前发生凝固时，可采用溶栓药物尿激酶（一种酶解性溶栓剂）处理，以降解血凝块，从而释放细胞并使其可用于扩增培养。该方案为重新采样提供了一种快速且经济的替代方法。

摘要

间充质干细胞（MSCs）通常来源于骨髓，常需要进行扩增培养。本方案采用临床级尿激酶降解骨髓中的血块，从而释放可用于后续实验的MSCs。该方法为骨髓重复取样提供了一种快速且经济的替代方案。骨髓是MSCs的主要来源，这类细胞在组织工程和自体干细胞治疗中具有重要研究价值。由于骨髓包含整个造血系统，抽取后可能发生凝血。形成的血块中也含有MSCs，这些细胞若不处理将无法用于扩增培养或直接干细胞治疗。我们发现，74%的犬骨髓样本存在凝血现象，其干细胞数量不足未凝血样本的一半。因此，我们建立了一种酶消化法处理这些血块，以避免耗时且昂贵的骨髓重复取样。尿激酶是一种临床批准且易于获得的溶栓药物，几乎可完全清除骨髓血块。经处理后，骨髓穿刺液中获得的MSCs数量与未凝血样本相当。此外，尿激酶处理后的细胞仍保持正常的代谢活性，并具备向软骨、成骨和脂肪细胞系分化的潜能。本方案可在不影响细胞质量的前提下，有效挽救已凝固的血液和骨髓样本，从而避免重复取样，显著降低采样成本，并使凝血样本仍可用于科研或治疗用途。

引言

间充质干细胞（MSCs）在再生医学和组织工程中发挥着重要作用。它们能够迁移、分化为多种细胞类型¹并定植，因此是自体治疗的理想候选细胞^2,3。近年来，已启动使用MSCs治疗骨与软骨修复、移植物抗宿主病或心脏病的临床试验⁴。这些MSCs可从脐带或脂肪组织中获取，但最具前景的结果主要来自骨髓来源的干细胞⁵。

髂嵴能够采集到较大量的骨髓，因此是骨髓穿刺的主要部位⁶。然而，随着抽取骨髓体积的增加，穿刺物的质量会下降。前5 mL骨髓穿刺液中含有高质量的间充质干细胞（MSCs），而抽取更大体积则会导致穿刺液被富含血管的骨组织中的外周血稀释⁷。由于骨髓穿刺液中存在巨核细胞和血小板，若不使用抗凝剂，穿刺液容易发生凝固。但即使使用抗凝剂，仍可能出现凝块。

在骨髓中，间充质干细胞仅占总细胞群体的一小部分 ⁸ 并且必须在培养中扩增，以用于大多数组织工程或治疗应用 ⁴这种培养物的质量在很大程度上取决于初始的细胞群体， 即多样性及较高的起始数量 ⁹供体间的个体差异可能部分解释了回收的MSC数量较少的现象。另一方面，低质量样本来源的MSC需要更长的培养时间和更多的传代次数才能达到所需的细胞数量。无论哪种情况，长期传代均可能导致细胞衰老，并....

方案

注意：人骨髓穿刺液取自髂嵴，由瑞士卢塞恩州伦理委员会批准，并在获得捐赠者知情同意后采集。犬骨髓穿刺液同样取自髂嵴，并在获得犬主知情同意后采集。人骨髓穿刺液（约 20 ml）和犬骨髓穿刺液（约 10 ml）在手术室采集后，立即加入 15 ml 3.8% 枸橼酸钠进行抗凝处理。样本于采集当日转移至实验室环境进行后续处理。

1. 尿激酶的制备（使用前）^st 使用

1. 根据制造商说明，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新溶解尿激酶：用10 ml注射器向带隔膜入口的瓶中加入10 ml PBS，通过轻轻旋转溶解干粉，得到每毫升含50,000注射单位（U）的溶液。
2. 将500 µl分装至无菌离心管中（每管含25,000 U）。分装后于-20 °C保存，可在至少6个月内随时取用。

2. 准备步骤（每次骨髓处理前）

1. 每个凝块化的骨髓穿刺液样品解冻一份尿激酶（25,000 U）（已成功使用单份25,000 U的尿激酶处理体积达25 ml的穿刺液）。
2. 将水浴箱或摇床培养箱预热至37 °C。

3. 血凝块的酶消化

1. 所有操作均须在层流生物安全柜中进行，以避免处理过程中骨髓样本受到微生物污染。当处理可能具有传染性的人体材料时，建议佩戴防护手套....

结果

74%的犬骨髓样本（n=54）在到达我们实验室时含有凝块（图1A），且这些样本的间充质干细胞（MSC）产量降低，这使我们认为有相当数量的MSC被截留在凝块中。事实上，对切片凝块组织进行简单的DAPI染色即可证实其中存在高密度的有核细胞（图1B）。这最终导致可用于扩增培养的MSC数量较少，从而促使我们开发了使用尿激酶的处理方案。通常情况下，应用本方案后凝块几乎完全消失。然而，在方法开发过程中，我们通过消化前后称重的方式系统地探讨了凝块消化的问题。实验结果显示，未消化残留物分别为初始凝块重量的15%（犬）或9%（人）（图2A）。

骨髓来源的MSCs的一个典型特征是能够贴附于细胞培养皿。研究人员利用这一特性来筛选MSCs。因此，集落形成实验能够以一种简单、定量且可靠的方式评估细胞群体的质量。在我们的实验室中，所述集落形成实验已常规应用于所有处理的骨髓样本（包括未凝固的样本），这使我们能够将该实验作为判断尿激酶消化效果的主要标准。为实现直接比较，来自凝块样本滤液的细胞（即.......

讨论

我们通常在患者接受手术时（在本研究中主要是脊柱手术）采集骨髓样本，其优势在于手术室人员只需额外进行少量操作。尽管样本在采集后会立即与枸橼酸钠混合，但许多样本在送达实验室进行处理时已出现部分凝固。在此阶段，若需重新采样以替换已凝固的样本，则属于一次额外的独立干预操作，需要再次实施局部或全身麻醉⁶。这不仅需要临床医护人员和供体的积极配合，还会消耗大量资源²¹。

在此，我们提供了一种利用重组人尿激酶处理凝固骨髓样本以分离多能间充质干细胞（MSCs）的实验方案。我们证实，尿激酶处理不会对细胞造成损伤，且细胞的分化潜能得以保留。该方案耗时较短，仅使样本处理时间延长约1小时。 ½ 与未凝固样本相比，该方法在获得相当的细胞群的同时，耗时更短。迄今为止，该方案已成功应用于不同个体及犬只的骨髓凝块，使用了多个批次的尿激酶，并表现出良好的稳健性和可重复性。此外，尿激酶通过激活样本内源性纤溶酶原间接发挥作用，这意味着尿激酶反应依赖于血浆环境。因此，不建议引入凝块冲洗或其他类似步骤 例如， PBS。这会稀释血清环境，导致酶促反应显著减.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基础培养基成分
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）	Gibco	15140122
人碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
含核苷酸和稳定型谷氨酰胺的MEM Alpha培养基	Amimed	1-23S50-I
热灭活胎牛血清	Amimed	2-01F36-I
两性霉素B	Applichem	A1907
成脂诱导培养基成分
DMEM-HAM F12培养基（含GlutaMAX）	Amimed	1-26F09-I
胰岛素	Sigma	I5500
兔血清	Gibco	16120099
地塞米松	Applichem	D4902
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma	I5879
生物素	Sigma	B4639
罗格列酮	Sigma	R2408
泛酸盐	Sigma	P5155
油红O	Sigma	O0625
成骨诱导培养基成分
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma	A8960
ß-甘油磷酸盐	Sigma	G9422
硝酸银（AgNO3）	Sigma	S6506
成软骨诱导培养基成分
Biopad - 海绵状医用装置	Euroresearch
L-脯氨酸	Sigma	P5607
胰岛素-转铁蛋白-硒X	Gibco	51500056
人转化生长因子-β1	Peprotech	100-21
阿利新蓝8GX	Sigma	A3157
核固红	Sigma	N8002
通用试剂
二水合柠檬酸三钠	Applichem	A3901
磷酸盐缓冲液（PBS）	Applichem	964.9100
尿激酶	Medac	1976826
0.5% 胰蛋白酶-EDTA溶液	Gibco	15400054
吉姆萨染液	Applichem	A0885
甲醛	Applichem	A0877
硫酸（H2SO4）	Applichem	A0655
二甲基亚砜（DMSO）	Applichem	A1584
氯化镁（MgCl2）	Applichem	A3618
盐酸胍	Applichem	A1499
耗材
50 ml 离心管	Axygen	SCT-50ML-25-S
10 ml 注射器	Braun	4606108V
斯特里坎针头（22G）	Braun	4657624
1.7 ml 微量离心管	Brunschwig	MCT-175-C
100 μm 细胞筛	Falcon	6.05935
无菌镊子	Bastos Viegas, SA	489-001
无菌手术刀	Braun	5518059
Primaria 细胞培养皿	Falcon	353803
C型改进型血球计数板（Neubauer Improved）	Bioswisstech	505050
细胞培养瓶 - T300培养瓶	TPP	90301
设备
II级微生物生物安全柜	Skan	82011500
水浴锅	Memmert	1305.0377
5ml 移液管（Serological Pipette）	Corning	4487-200ea
显微镜	Olympus	CKX41
带加湿功能的培养箱 Heracells 240	Thermo scientific	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R 离心机	Thermo scientific	75004331