Summary

Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

Published: April 12, 2015
doi:

Summary

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Introduction

Mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Ze kunnen migreren, differentiëren in verschillende celtypes 1 en inenten, waardoor ze de ideale kandidaten voor autologe therapieën 2,3 maakt. De laatste tijd, klinische studies met behulp van MSC's voor bot en kraakbeen reparatie, graft-versus-host ziekte of hart-en vaatziekten werden gelanceerd 4. Deze MSC's kunnen worden geoogst uit de navelstreng of vetweefsel maar veelbelovende resultaten werden verkregen uit beenmerg afgeleide stamcellen 5.

De iliac crest maakt een aanzienlijke hoeveelheid beenmerg verzamelen en dient derhalve hoofdplaats aspiratie 6. De kwaliteit van het aspiraat afneemt met toenemende hoeveelheid beenmerg ingetrokken. Terwijl de eerste 5 ml beenmergaspiraat bevatten MSC's van hoge kwaliteit, de intrekking van grotere volumes leidt tot verwatering van het aspireren met perifere bloed fROM De vaatrijke bot 7. Door de onderhavige megakaryocyten en bloedplaatjes, beenmerg aspiraten zijn verklonteren, tenzij anticoagulantia gebruikt. Maar zelfs met anticoagulantia, kunnen stolsels voordoen.

In beenmerg MSCs slechts een klein deel van het totale celpool 8 en moet in kweek geëxpandeerd meeste tissue engineering of therapeutische toepassingen 4. De kwaliteit van een dergelijke cultuur is grotendeels afhankelijk van de initiële cel zwembad, dwz., Diversiteit en een hoog startnummer 9. Lage aantallen MSC's uit de markt nemen kan gedeeltelijk verklaard worden door donor variabiliteit. Aan de andere kant, MSC's van lage kwaliteit monsters vereisen een langere tijd in cultuur en uitgebreid passage naar het gewenste aantal cellen te bereiken. In beide gevallen verlengd passages is een bron van celsenescentie en kan leiden tot verlies van differentiatie potentieel 10. Daarom geoptimaliseerde protocollen die cel y kunnen maximaliserenield en te voorkomen dat nadelige gevolgen moeten worden ontwikkeld 11,12.

Toen we begonnen te werken met honden MSC's, we waren verbaasd om te zien dat ongeveer drie op de vier honden beenmerg monsters bevatte stolsels, terwijl gelukkig clotted menselijke stalen (één op de tien) waren minder frequent. Aan de andere kant was het geen verrassing, dat zagen we veel lagere opbrengst van MSC's uit gestolde monsters. Om de steeds terugkerende probleem van de gestolde monsters op te lossen, het protocol ontwikkelden we met behulp van de trombolyticum urokinase in plaats van resampling.

Trombolytische therapie kan levensbedreigende situaties als afsluiting van de bloedvaten hartaanval, beroerte of embolieën door ongewenste stolling tegengaan. Zij werken door afbraak van de stolsels door enzymatische splitsing van fibrine door plasmine en enzymatische plasminogeen activatoren. Ondanks het ruime gebruik voor de behandeling van patiënten, slechts zeer weinig publicaties bestaan ​​die gebruikt trombolytische activiteitenvoor laboratorium toepassingen gestolde monsters redden, vooral gericht op lymfocyten. In 1987, Niku et al. de toepassing beschreven van streptokinase voor het oplossen van bloedstolsels resulteert in functionele lymfocyten 13 en vier jaar later, De Vis et al. uitgebreid gebruik van streptokinase leukemiecellen isoleren uit bloed en beenmerg flowcytometrische toepassingen 14. Een meer recente publicatie suggereert het gebruik van Alteplase voor de diagnostiek van kanker 15. Tijdens het gebruik van de dezelfde enzymatische benadering, ons protocol richt zich op de isolatie van multipotente MSC vorm beenmerg om een ​​hulpmiddel voor onderzoekers op het gebied van stamcellen bieden.

Protocol

OPMERKING: Human beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld van toestemming donoren met goedkeuring van de ethische commissie van het kanton Luzern. Canine beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld hond eigenaar consent.Human (ong. 20 ml) en honden (ong. 10 ml) beenmergaspiraten waren anti-gecoaguleerd door toevoeging van 15 ml 3,8% natriumcitraat onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor verwerking op dezelfde dag als ingetrokken. <p …

Representative Results

Het feit dat 74% van canine beenmerg monsters (n = 54) die stolsels bij hun aankomst in ons laboratorium (Figuur 1A) met verminderde MSC opbrengsten uit deze monsters, maakte ons geloven dat een aanzienlijk aantal MSC's werd gevangen in de stolsels . Inderdaad, een eenvoudige DAPI-kleuring van coupes stollen materiaal bevestigt de aanwezigheid van kernhoudende cellen in hoge dichtheid (Figuur 1B). Dit leidt uiteindelijk tot lage aantallen MSC's beschikbaar voor uitbreiding van d…

Discussion

Routinematig proeven we beenmerg terwijl de patiënt ondergaat een operatie (in ons geval vooral wervelkolom chirurgie), met het voordeel dat slechts weinig extra werk heeft verricht door het personeel in de operatiekamer te voeren. Hoewel de monsters onmiddellijk na verwijdering worden gemengd met natriumcitraat, vele monsters werden gedeeltelijk gestold bij hun aankomst in het laboratorium voor verwerking. In dit stadium zou resampling om clotted exemplaren te vervangen afzonderlijke extra ingreep weer noodzakelijk pl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

Materials

Basal Medium Components
PenStrep 100X Gibco 15140122
Human FGF-basic Peprotech 100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine Amimed 1-23S50-I
FBS Heat Inactivated Amimed 2-01F36-I
Amphotericin B Applichem A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX Amimed 1-26F09-I
Insulin  Sigma I5500
Rabbit serum  Gibco 16120099
Dexamethasone Applichem D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Biotin  Sigma B4639
Rosiglitazone  Sigma R2408
Pantothenate  Sigma P5155
Oil Red-O  Sigma O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
ß-glycerophosphate Sigma G9422
Silver nitrate (AgNO3) Sigma S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad – sponge shaped medical device  Euroresearch
L-proline  Sigma P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X Gibco 51500056
Human transforming growth factor-β1  Peprotech 100-21
Alcian Blue 8GX Sigma A3157
Nuclear fast red Sigma N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate Applichem A3901
PBS Applichem 964.9100
Urokinase Medac 1976826
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Giemsa stain Applichem A0885
Formaldehyde Applichem A0877
Sulfuric acid (H2SO4) Applichem A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A1584
Magnesium chloride (MgCl2) Applichem A3618
Guanidine hydrochloride Applichem A1499
Consumables
50 mL reaction tube Axygen SCT-50ML-25-S
10 mL syringe Braun 4606108V
Sterican needle (22G) Braun 4657624
1.7 mL Microtubes Brunschwig MCT-175-C
100 μm cell strainer Falcon 6.05935
sterile forceps Bastos Viegas, SA 489-001
sterile scalpel Braun 5518059
Primaria cell cuture dish Falcon 353803
C-Chip Neubauer Improved Bioswisstech 505050
cell culture flask – Flask T300 TPP 90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II Skan 82011500
water bath Memmert 1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml Corning 4487-200ea
microscope Olympus CKX41
humidified incubator Heracells 240 Thermo scientific 51026331
Heraeus Multifuge 1S-R Thermo scientific 75004331

References

  1. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  2. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  3. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
  4. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
  5. Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
  6. Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
  7. Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
  8. Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
  9. Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
  10. Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  11. Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
  12. Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
  13. Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
  14. De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
  15. St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
  16. Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
  17. Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
  18. Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
  19. Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
  20. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
  21. Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
  22. Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schlaefli, P., Bertolo, A., Malonzo, C., Poetzel, T., Baur, M., Steffen, F., Stoyanov, J. An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples. J. Vis. Exp. (98), e52694, doi:10.3791/52694 (2015).

View Video