Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Ze kunnen migreren, differentiëren in verschillende celtypes 1 en inenten, waardoor ze de ideale kandidaten voor autologe therapieën 2,3 maakt. De laatste tijd, klinische studies met behulp van MSC's voor bot en kraakbeen reparatie, graft-versus-host ziekte of hart-en vaatziekten werden gelanceerd 4. Deze MSC's kunnen worden geoogst uit de navelstreng of vetweefsel maar veelbelovende resultaten werden verkregen uit beenmerg afgeleide stamcellen 5.
De iliac crest maakt een aanzienlijke hoeveelheid beenmerg verzamelen en dient derhalve hoofdplaats aspiratie 6. De kwaliteit van het aspiraat afneemt met toenemende hoeveelheid beenmerg ingetrokken. Terwijl de eerste 5 ml beenmergaspiraat bevatten MSC's van hoge kwaliteit, de intrekking van grotere volumes leidt tot verwatering van het aspireren met perifere bloed fROM De vaatrijke bot 7. Door de onderhavige megakaryocyten en bloedplaatjes, beenmerg aspiraten zijn verklonteren, tenzij anticoagulantia gebruikt. Maar zelfs met anticoagulantia, kunnen stolsels voordoen.
In beenmerg MSCs slechts een klein deel van het totale celpool 8 en moet in kweek geëxpandeerd meeste tissue engineering of therapeutische toepassingen 4. De kwaliteit van een dergelijke cultuur is grotendeels afhankelijk van de initiële cel zwembad, dwz., Diversiteit en een hoog startnummer 9. Lage aantallen MSC's uit de markt nemen kan gedeeltelijk verklaard worden door donor variabiliteit. Aan de andere kant, MSC's van lage kwaliteit monsters vereisen een langere tijd in cultuur en uitgebreid passage naar het gewenste aantal cellen te bereiken. In beide gevallen verlengd passages is een bron van celsenescentie en kan leiden tot verlies van differentiatie potentieel 10. Daarom geoptimaliseerde protocollen die cel y kunnen maximaliserenield en te voorkomen dat nadelige gevolgen moeten worden ontwikkeld 11,12.
Toen we begonnen te werken met honden MSC's, we waren verbaasd om te zien dat ongeveer drie op de vier honden beenmerg monsters bevatte stolsels, terwijl gelukkig clotted menselijke stalen (één op de tien) waren minder frequent. Aan de andere kant was het geen verrassing, dat zagen we veel lagere opbrengst van MSC's uit gestolde monsters. Om de steeds terugkerende probleem van de gestolde monsters op te lossen, het protocol ontwikkelden we met behulp van de trombolyticum urokinase in plaats van resampling.
Trombolytische therapie kan levensbedreigende situaties als afsluiting van de bloedvaten hartaanval, beroerte of embolieën door ongewenste stolling tegengaan. Zij werken door afbraak van de stolsels door enzymatische splitsing van fibrine door plasmine en enzymatische plasminogeen activatoren. Ondanks het ruime gebruik voor de behandeling van patiënten, slechts zeer weinig publicaties bestaan die gebruikt trombolytische activiteitenvoor laboratorium toepassingen gestolde monsters redden, vooral gericht op lymfocyten. In 1987, Niku et al. de toepassing beschreven van streptokinase voor het oplossen van bloedstolsels resulteert in functionele lymfocyten 13 en vier jaar later, De Vis et al. uitgebreid gebruik van streptokinase leukemiecellen isoleren uit bloed en beenmerg flowcytometrische toepassingen 14. Een meer recente publicatie suggereert het gebruik van Alteplase voor de diagnostiek van kanker 15. Tijdens het gebruik van de dezelfde enzymatische benadering, ons protocol richt zich op de isolatie van multipotente MSC vorm beenmerg om een hulpmiddel voor onderzoekers op het gebied van stamcellen bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Human beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld van toestemming donoren met goedkeuring van de ethische commissie van het kanton Luzern. Canine beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld hond eigenaar consent.Human (ong. 20 ml) en honden (ong. 10 ml) beenmergaspiraten waren anti-gecoaguleerd door toevoeging van 15 ml 3,8% natriumcitraat onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor verwerking op dezelfde dag als ingetrokken.
1. Bereiding van Urokinase (Vóór 1 st gebruik)
- Reconstitueren urokinase met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de instructies van de fabrikant: Voeg 10 ml PBS aan het septum inlaat kolf met een injectiespuit 10 ml. Los de droge stof door werveling tot 50.000 injectie units (U) per ml te verkrijgen.
- Bereid 500 ul porties (25.000 U elk) in sterile buizen. WINKEL aliquots -20 ° C en gebruiken wanneer vereist voor ten minste 6 maanden.
2. Preparatief Stappen (Voorafgaand aan iedere Bone Marrow Treatment)
- Ontdooi een aliquot van urokinase (25,000 U) per geklonterd beenmergaspiraat (weggezogen volumes tot 25 ml met succes behandeld met een hoeveelheid van 25.000 U).
- Verwarm een waterbad of schudincubator tot 37 ° C.
3. Enzymatische Digest van het Clot
- Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming bioveiligheid kast om microbiële besmetting van het beenmerg monsters tijdens de verwerking te voorkomen. Bij het werken met potentieel besmettelijk menselijk materiaal, is het gebruik van beschermende handschoenen en een zorgvuldige behandeling geadviseerd.
- Plaats een 100 urn zeef cel op een steriele buis van 50 ml. Giet de beenmergaspiraat door de cel zeef, het kantelen van de zeef of bewegen rond het stolsel materiaal. Gebruik een steriele pipet tip voorbetere doorstroming door het filtergaas.
OPMERKING: Vermijd elke verdunning van het stolsel, bijvoorbeeld door het wassen van het stolsel met PBS. Urokinase werkt indirect vereist componenten van het serum (bijv., Plasminogeen) van de biopsie doeltreffende digest. Terwijl de voortzetting van de procedure het stolsel materiaal, kan het filtraat bij kamertemperatuur bewaard tot gebruik in stap 3.6. - Transfer het beenmerg stolsel materiaal in een lege cel cultuur schotel met behulp van een steriel pincet. Snijd het vuil in kleine stukjes van ongeveer 2 mm 3 met een steriele scalpel.
- Breng de kleine deeltjes van het stolsel in een 50 ml reageerbuis met de steriele pincet. Zorg ervoor dat het gehakt stolsel heeft een natte verschijning. Indien droog lijkt, gebruik van sommige van het filtraat uit stap 3.1 te bevochtigen.
- Vermaal het stolsel door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml microtiter- pipet. Voeg 1 portie van urokinase aan het monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C ofwel in een waterbad ofeen schudden (zachtjes) incubator.
- Vermaal door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml pipet. Voer deze stap in een bioveiligheid kast. Incubeer nog eens 30 minuten bij 37 ° C. Na de incubatie, vermaal nogmaals 5 keer met een 5 ml pipet. Pass over een verse 100 micrometer cel zeef te bundelen met het filtraat uit stap 3.2.
- Centrifugeer de celsuspensie bij omgevingstemperatuur gedurende 10 min bij 500 x g. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in media zoals hieronder beschreven of volgens de standaardprocedure van laboratorium MSC expansie cultuur.
4. Zaaien voor uitbreiding van de Cel Cultuur en CFU Platen
- Resuspendeer de cellen (bestaande uit erythrocyten en mononucleaire cellen) in 50 ml basismedium: alfa-MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2,5 mg / ml amfotericine B . Tel de cellen 1:10 verdund in trypaanblauw oplossing met behulp van een Neubauer chamber.
- Plaat de cellen in celkweek kolven bij de dichtheid van 5 x 10 7 cellen / cm2 en geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. Indien beschikbaar, gebruik hypoxische (5% zuurstof) voorwaarden. Voor de CFU assay controle plaat 10 9 cellen in een celkweek schaal van 10 cm diameter.
- Na 3 dagen kweken worden mesenchymale stamcellen aan de celkweek schotel bevestigd terwijl andere cellen in suspensie blijven. Verander het medium met basaal medium aangevuld met 5 ng / ml basische fibroblast groeifactor (bFGF). Voor de CFU-test controle, behandel de celkweekschaaltje evenzo.
- Verder celkweek voor een totaal van 2 weken uitwisseling media drie keer per week. Als cellen meer dan 80% samenvloeiing, gesplitst door behandeling met trypsine. Voor de CFU assay controle wisselen de media eveneens, maar de cellen niet opgesplitst tijdens de twee weken.
5. Giemsa Stain voor CFU Assay
- Bereid 10 ml van Giemsa-oplossing per gerecht: dilute de stockoplossing (7,6 g / l Giemsa in glycerol: methanol) 1:10 in steriel water (altijd voor te bereiden een frisse werkende verdunning).
- Verwijder de media uit de cel cultuur schotel en was de cellen met PBS. Wees zeer voorzorg bij de toepassing van vloeistof aan de petrischaal en te voorkomen dat het wassen uit de cellen.
- Fix cellen in pure methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de Methanol. Voeg de Giemsa-oplossing en incubeer gedurende 60 min in een bevochtigde incubator bij 37 ° C.
- Was tweemaal met PBS. Lucht droog de plaat hoofd eerst op een stuk keukenpapier. Tel de kolonies handmatig. Dit wordt het best bereikt door een markeerstift op de achterkant van de plaat.
6. MSC Differentiatie
- Canine MSC differentiatie
OPMERKING: Canine MSC's werden in chondrogene en osteogene adipogenic lineages gedifferentieerd door stimulatie met de juiste media voor vier weken. - Voor Adipogenic differentiatie, cultuur MSC's in monolaag op 4 x 10 5 ceLLS / cm2 afwisselend twee verschillende kweekomstandigheden als volgt;
- Cultuur in adipogenese onderhoudsmedium DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B en 170 mM insuline.
- Cultuur in vetcel- inducerende media met het onderhoud medium aangevuld met 3% FBS, 5% konijnenserum, 1 uM dexamethason, 500uM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 33 uM biotine, 5 uM rosiglitazon en 17 uM pantothenaat 16.
- Revel de vetdruppels door kleuring met Oil Red-O. In het kort, fix cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlekken met 0,35% Olie rode O in isopropanol.
- Voor osteogene differentiatie cultuur MSCs in monolaag 7 x 10 3 cellen / cm2 en stimuleren het volgende:
- Geavanceerde DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 501, M L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 10 mM ß-glycerofosfaat en 100 nM dexamethason.
- Identificeer de mineralisatie deposito's van Von Kossa vlek (5% AgNO 3). Kort vast de cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlek met 5% AgNO3 in gedestilleerd water.
- Chondrogene differentiatie
- Cut blokjes (3 mm per zijde) van een spons gevormde medische inrichting, gevormd uit gevriesdroogde collageen type I, en als dragermateriaal voor cel 17 te ondersteunen.
- Zaad MSCs op de bovenkant van de kubussen bij een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml (~ 70.000 cellen / cube).
- Vóór de toevoeging van media, zodat de cellen hechten aan de kubussen voor 30 min.
- Handhaaf MSC-collageen constructen chondrogene media bestaande uit DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 40 ng / ml dexamethason, 50 ug / ml ascorbinezuur -2-fosfaat,50 ug / ml L-proline, 1x insuline-transferrine-Seleen X, en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1.
- Gebruik alcianblauwkleuring om ophoping van proteoglycanen visualiseren in constructies secties. In het kort, vlekken de secties O / N met 0,4% alcianblauw opgelost in 0,01% H 2 SO 4 en 0,5 M guanidinehydrochloride. Vervolgens werden was de secties gedurende 30 min gewassen in 40% DMSO en 0,05 M MgCl2. Cellen werden tegengekleurd met nucleaire snel rood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het feit dat 74% van canine beenmerg monsters (n = 54) die stolsels bij hun aankomst in ons laboratorium (Figuur 1A) met verminderde MSC opbrengsten uit deze monsters, maakte ons geloven dat een aanzienlijk aantal MSC's werd gevangen in de stolsels . Inderdaad, een eenvoudige DAPI-kleuring van coupes stollen materiaal bevestigt de aanwezigheid van kernhoudende cellen in hoge dichtheid (Figuur 1B). Dit leidt uiteindelijk tot lage aantallen MSC's beschikbaar voor uitbreiding van de cultuur, die ons aanleiding om het protocol op urokinase ontwikkelen. Typisch stolt verdwijnen bijna volledig bij de toepassing van ons protocol. Echter, tijdens de methode ontwikkeling die we in op de vraag van stolsel verteren systematisch door weging vóór en na digest. Deze experimenten onthulden dat het onverteerde resten waren 15% (hond) of 9% (humaan) van het eerste stolsel gewicht (Figuur 2A).
Een typisch kenmerk van beenmerg afgeleide MSC's is het eenlijkheid om zich te houden aan celcultuur gerechten. De onderzoekers maken gebruik van deze eigenschap om te kiezen voor MSC. Bijgevolg kolonie vormende assay maakt de kwaliteit van het celpool evalueren eenvoudige kwantitatieve en betrouwbare manier. In ons laboratorium, werd de kolonie vormende assay hierin beschreven routinematig toegepast op alle beenmerg monsters verwerkt (ook niet geklopte zijn). Dit liet ons toe om de assay als belangrijkste criterium gebruikt voor het bepalen van de werkzaamheid van het urokinase digest. Als directe vergelijking, cellen van gecoaguleerd monster filtraten toestaan (bijvoorbeeld als gestolde monsters slechts werden gefiltreerd doch niet enzymatisch behandeld) en geknipt stolsels werden gezaaid op afzonderlijke schalen van 10 cm, gevolgd door incubatie gedurende twee weken. Wanneer visualiseren kolonievormende eenheden (CFU) met Giemsa-kleuring (zie figuur 2B), observeerden we 3,8 keer meer CFU van het urokinase reacties van canine monsters dan van overeenkomstige oorspronkelijke filtraat (figuur 2C). Althdoorgedreven minder prominent, de menselijke monsters volgde een vergelijkbare trend met 1,6 maal meer CFU van behandelde monsters, ter bevestiging van de geschiktheid van het protocol. Inderdaad, de platen van gedigereerde stolsel geïllustreerd in de juiste rij in Figuur 2B corresponderen met het typische resultaat gezien voor een samengevoegd monster. Kan echter donor variaties gemakkelijk tot CFU aantallen van helft verdubbelen van het afgebeelde.
Van kolonie grootte als indicator van celverzameling kwaliteit, meer medium (2-5 mm) en grote (> 5 mm) kolonies op de platen gezaaid van stolsels ten opzichte van de CFU van filtraten (figuur 2C). Dit duidt er meestal op dat MSC's groeien normaal na urokinase behandeling. Ook als geheel de vergelijking van canine gedigereerde monsters (n = 21) monsters zonder stollen (n = 7) leverde vergelijkbare aantallen totale MSCs voor behandelde monsters, hoewel een grote inter-sample variatie werd waargenomen als gevolg van de heterogene donorpopulatie (Figuur2D).
Als laatste functionele test van geschiktheid, we geïnduceerde differentiatie van MSC's afkomstig van verteerd beenmergmonsters. Toepassingen in de autologe stamceltherapie zijn gebaseerd op de MSC differentiatie in kraakbeen, bot of vetweefsel of MSC paracrienen 18. Cellen kunnen de richting van het gewenste pad van differentiatie laten leiden door het kiezen van de juiste kweekomstandigheden voor adipogenic differentiatie 19, osteogene differentiatie 20 of chondrogeen lijn 17. Daarom vergeleken wij MSCs uit beenmerg stolsel MSCs afgeleid van unclotted beenmergmonster. Na vier weken in kweek, was het mogelijk om MSC differentiëren in alle drie genoemde lijnen. Dit werd histologisch getest met Von Kossa (voor osteogene lineage), Oil Red O (adipogenic) en alcianblauw (chondrogene) kleuringen, met geen verschillen in de graad van onderscheid tussen de groepen ( 
Figuur 1. Beenmerg stolsels. Percentage van honden en menselijk beenmerg monsters gedeeltelijk gestolde toestand bij aankomst (A). Bovendien vonden we dat MSC opbrengst van gestolde monsters sterk werden gereduceerd door een groot aantal cellen gevangen in de stolsels. Een groot aantal cellen met kernen aanwezig in de stolsels zoals aangetoond door DAPI-kleuring van een cryosectie van een hond beenmerg klonter (B). Schaal balk vertegenwoordigt 200 micrometer. 
Figuur 2. Isolatie van MSCs uit beenmerg stolsels gedigereerd met urokinase. (A) Typisch, beenmerg stolsels verdwijnt bijna helemaal op urokinase digest.Bij methode ontwikkeling, onderzochten we klonter gewichten voor honden (n = 5, gemiddelde ± SD, ** p ≤0.01) en humane monsters (n = 3, gemiddelde ± SD, ns = niet significant p = 0,10) dat werd sterk verminderd bij urokinase digest. (B) Een eenvoudige CFU test kan dienen als een informatief instrument voor de beoordeling van de kwaliteit van een MSC voorbereiding. Om de effectiviteit van de digest beoordelen, werd de CFU assay uitgevoerd filtraten en verteerde stolsels beenmergaspiraten afzonderlijk. Na twee weken in kweek werden 10 cm controle platen gekleurd met Giemsa en CFU werden geteld. De test bevestigde dat hoge aantal CFU kunnen worden vrijgesteld van het stolsel door urokinase verteren en functioneel blijven. Dit wordt ook bevestigd door de hoge frequentie van grote kolonies (klasse-indeling:.> 5 mm in zwart, 2-5 mm in donkergrijs en <2 mm in lichtgrijs Foutbalken vertegenwoordigen SD van de totale CFU (n = 5 voor hond , n = 3 voor menselijke, ** p ≤0.01, ns = niet significant, p = 0,17). (C) Afbeeldings van Giemsa-gekleurde platen bevestigen resultaten. De getoonde voor verteerde stolsel platen overeenkomen met een typisch resultaat voor een verteerd beenmergmonster - kan echter nummers grotendeels te wijten aan donor variabiliteit variëren. (D) In de som, het toepassen van de urokinase verteren protocol (n = 21) resulteert in vergelijkbare totale MSC rendementen na expansie cultuur om op natuurlijke stolsel gratis monsters (n = 7, gemiddelde ± SD). Statistische analyse voor de gehele figuur 2 werd uitgevoerd met Student's t-test. 
Figuur 3. Vergelijking van differentiatie potentieel van verteerd versus native unclotted monsters. Canine MSC's geïsoleerd van geronnen beenmerg behandeld met urokinase (bovenste rij) en unclotted beenmerg (onderste rij) werden onderscheiden in osteogenic fenotype en gekleurd door Von Kossa (bar =200 pm) werd adipogenic fenotype gekleurd door Oil Red O (bar = 100 pm; in het inlegwerk grotere vergroting van vet vacuolen), terwijl chondrogenese werd onthuld door alcianblauwkleuring (bar = 100 micrometer; tegenkleuring nucleaire snel rood). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Routinematig proeven we beenmerg terwijl de patiënt ondergaat een operatie (in ons geval vooral wervelkolom chirurgie), met het voordeel dat slechts weinig extra werk heeft verricht door het personeel in de operatiekamer te voeren. Hoewel de monsters onmiddellijk na verwijdering worden gemengd met natriumcitraat, vele monsters werden gedeeltelijk gestold bij hun aankomst in het laboratorium voor verwerking. In dit stadium zou resampling om clotted exemplaren te vervangen afzonderlijke extra ingreep weer noodzakelijk plaatselijke of algehele verdoving 6. Dit vereist de bereidheid van zowel de klinische personeel en de donor bij te dragen en verbruikt heel wat middelen 21.
Hier bieden we een protocol dat recombinant humaan urokinase gebruikt op clotted beenmergmonsters om multipotente MSC's te isoleren. Wij konden aantonen dat de urokinase behandeling niet schadelijk voor de cellen en de differentiatie potentieel behouden. Het protocolis kort, omdat het verlengt monster verwerking slechts met ongeveer 1 ½ uur in vergelijking met unclotted monsters terwijl die vergelijkbare cel zwembaden. Tot op heden is dit protocol met succes toegepast op beenmerg stolsels van verschillende individuen en honden op urokinase van verschillende percelen en heeft aangetoond robuuste en reproduceerbare succes. Afgezien van dit, urokinase fungeert indirect via de activering van het monster-intrinsieke plasminogeen. Dit betekent dat de urokinase reactie vereist de plasma-omgeving. Het is daarom af te raden om te stappen van stolsel spoel- of gelijk introduceren met bv, PBS. Dit zou het serum milieu verdund en tot een aanzienlijke vertraging van de enzymatische reactie.
De beslissing om urokinase gebruiken voor onze methode en niet een ander trombolyticum was triviaal: we ontwikkelden het protocol op basis van de trombolyticum direct beschikbaar in onze ziekenhuisapotheek. Voor andere onderzoeksgroepen kan het daarom makkelijker om een tissue-typ gebruikene plasminogeen activator (bijv., een ander geneesmiddel zoals alteplase, reteplase of tenecteplase) of urokinase niet beschikbaar. Echter, mogelijk belangrijke verschillen tussen de geneesmiddelen bestaan: tegenstelling weefsel plasminogeen activatoren, kan urokinase celactivering en proliferatie triggeren wanneer gebonden aan het urokinase-type plasminogeen activator receptor (uPAR) 22. Na binding, worden intracellulaire signaleringswegen geactiveerd die leiden tot cel migratie en proliferatie. In een fysiologische situatie dit verder ondersteund door de secretie van matrix metalloproteïnasen door geactiveerde cellen. In ons systeem, urokinase wordt verdund en geleidelijk verdwijnen bij expansie cultuur zonder dat nadelige effecten. Nog steeds met betrekking tot het beoogde gebruik van geïsoleerde MSC's, de geschiktheid van de trombolytische geneesmiddelen moet individueel bepaald.
In het algemeen, hoge doseringen voor een snelle en volledige stolsel digest wordt aangeraden om minimaliseren ongewenste selectie tijdens stolsel verwerking. Opmerkelijk, veel eerdere studies gebruikt bacteriële streptokinase voor het verteren van bloed en beenmerg stolsels 13,14. Dit kan echter drug ongewenste activering en reactie van het immuunsysteem, wat een groot nadeel bijzonder kan wanneer bij toepassing van cellen aan patiënten bestemd veroorzaken.
Wij geloven dan ook dat ons protocol niet alleen helpen onderzoekers en medische professionals om tijd en kosten te besparen. Op urokinase - een goedgekeurd enzymatische drug zonder bekende antigene - misschien zelfs een waardevol instrument voor vele translationeel onderzoek laboratoria gericht op het therapeutisch gebruik van MSC voorbereidingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
