Introduction
As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células 1 e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos 2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados 4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais 5.
A crista ilíaca permite recolher uma quantidade considerável de medula óssea e, portanto, serve como local principal de aspiração 6. No entanto, a qualidade do aspirado diminui com o aumento de volume de medula óssea retirada. Enquanto os primeiros 5 ml de aspirado de medula óssea conter MSCs de alta qualidade, a retirada de volumes maiores leva a diluição do aspirado com sangue periférico fesde o osso altamente vascularizado 7. Devido às actuais megacariócitos e plaquetas, aspirados de medula óssea são propensas a coagulação, a menos que sejam utilizados anticoagulantes. Mas, mesmo com anticoagulantes, pode ocorrer a formação de coágulos.
Na medula óssea, as MSCs constituem apenas uma pequena proporção do conjunto total de 8 células e têm de ser expandidas em cultura para engenharia de tecidos ou mais aplicações terapêuticas 4. A qualidade de uma tal cultura depende em grande parte do conjunto de células inicial, isto é., A diversidade e um elevado número de partida 9. Baixo número de MSCs de levantamentos pode ser parcialmente explicado pela variabilidade dos doadores. Por outro lado, as MSCs a partir de amostras de baixa qualidade requerem mais tempo em cultura e passagem em estendida para atingir o número desejado de células. Em ambos os casos, passaging estendido é uma fonte de senescência celular e pode levar à perda de potencial de diferenciação 10. Portanto, os protocolos que podem maximizar celular y otimizadoield e prevenir contra os efeitos prejudiciais têm de ser desenvolvidas 11,12.
Quando começamos a trabalhar com MSCs caninos, ficamos surpresos ao ver que cerca de três em cada quatro amostras de medula óssea de cães contido coágulos, enquanto amostras humanas felizmente coagulado (uma em cada dez) foram menos freqüentes. Por outro lado não foi nenhuma surpresa, observou-se que os rendimentos muito mais baixos de MSCs a partir de amostras coaguladas. Para resolver o problema recorrente de amostras coaguladas, que desenvolveu o protocolo usando o urokinase droga trombolítica em vez de reamostragem.
Terapias trombolíticos pode neutralizar situações que ameaçam a vida, como a oclusão de vasos sanguíneos, provocando um ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou embolia devido a coagulação indesejada. Eles trabalham por degradação dos coágulos através da clivagem enzimática da fibrina pela plasmina e enzimática do plasminogênio ativadores. Apesar da ampla utilização para o tratamento de pacientes, apenas muito poucas publicações que existem atividades trombolíticos utilizadopara aplicações de laboratório para resgatar amostras coaguladas, focando principalmente nos linfócitos. Em 1987, Niku et al. descreveram o uso de estreptoquinase para dissolver coágulos de sangue, resultando em linfócitos funcionais 13 e quatro anos mais tarde, De Vis et al. estendeu o uso de estreptoquinase para isolar as células de leucemia de sangue e medula óssea para aplicações de citometria de fluxo 14. A publicação mais recente sugere o uso de Alteplase para diagnóstico de câncer 15. Enquanto estiver usando a mesma abordagem enzimática, nosso protocolo incide sobre o isolamento de multipotentes da medula óssea MSCs forma a fornecer uma ferramenta para os pesquisadores da área de células-tronco.
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Protocol
NOTA: aspirados de medula óssea Humanos da crista ilíaca foram coletados de doadores consentindo com a aprovação do comitê de ética do cantão de Lucerna. Aspirados de medula óssea a partir de canino da crista ilíaca foram recolhidas com consent.Human do proprietário do cão (aprox. 20 ml) e canina (aprox. 10 ml), aspirados de medula óssea eram anti-coagulados por adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente depois da retirada no teatro operação. As amostras foram transferidas para o ambiente de laboratório para o processamento do mesmo dia como retirado.
1. Preparação de Urokinase (Antes de 1º Use)
- Reconstituir uroquinase utilizando solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) de acordo com as instruções do fabricante: Adicionam-se 10 ml de PBS para o frasco septo-entrada utilizando uma seringa de 10 ml. Dissolver a substância seca por agitação para obter 50.000 unidades de injeção (U) por ml.
- Preparar alíquotas de 500 ul (25.000 U) em cada stubos terile. Alíquotas da loja -20 ° C e usá-lo quando necessário para pelo menos 6 meses.
2. Preparativos Passos (antes de cada Medula Óssea Treatment)
- Descongelar uma alíquota de urokinase (25.000 U) per aspirado de medula óssea coagulado (volumes aspirado até 25 ml foram tratados com sucesso utilizando uma alíquota única de 25.000 U).
- Pré-aqueça um banho-maria ou incubadora com agitação a 37 ° C.
3. digestão enzimática do Clot
- Realizar todos os trabalhos em uma cabine de segurança biológica fluxo laminar para evitar contaminação microbiana das amostras de medula óssea durante o processamento. Quando se trabalha com material humano potencialmente infeccioso, o uso de luvas de protecção, bem como a manipulação cuidadosa é aconselhável.
- Coloque uma peneira de 100 um de células no topo de um tubo estéril de 50 ml. Com cuidado, despeje o aspirado de medula óssea através do filtro de células, inclinando a peneira ou em movimento em torno do material do coágulo. Use a ponta da pipeta estéril paramelhor fluxo através do filtro de rede.
Nota: Evite qualquer diluição do coágulo, por exemplo, lavando o coágulo com PBS. Urokinase atua indiretamente e requer componentes do soro (ie., Plasminogênio) a partir da biópsia para efetiva digerir. Enquanto continua o procedimento com o material de coágulo, o filtrado pode ser mantido à temperatura ambiente até à sua utilização no passo 3.6. - Transferir o material coágulo de medula óssea em uma placa de cultura de célula vazia usando uma pinça estéril. Cortar os detritos em pedaços pequenos de cerca de 2 mm 3, utilizando um bisturi esterilizado.
- Transferir os pequenos pedaços do coágulo dentro de um tubo de reacção de 50 ml utilizando o fórceps estéreis. Verifique se o coágulo picada tem uma aparência molhada. Se ele parece ser seca, use parte do filtrado do passo 3.1 para umedecer.
- Tritura-se o coágulo, pipetando para cima e para baixo para 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml de microtitulação. Adicionar uma parte alíquota de urocinase para a amostra. Incubar durante 30 min a 37 ° C, quer num banho de água ou ema (gentilmente) incubadora de agitação.
- Triturar por pipetagem cima e para baixo por 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml. Execute esta etapa em um gabinete de biossegurança. Incubar durante mais 30 min a 37 ° C. Após a incubação, tritura-se novamente 5 vezes usando uma pipeta de 5 mL. Passe longo de um 100 um novo filtro de células de reunir com o filtrado do passo 3.2.
- Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Descartar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de células em meio, tal como descrito abaixo, ou de acordo com o procedimento padrão de laboratório para o MSC expansão da cultura.
4. Sementeira para Cultura de Células de Expansão e placas CFU
- Ressuspender as células (que consiste em eritrócitos e células mononucleares) em 50 ml de meio basal Alpha-MEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina e 2,5 mg / mL de anfotericina B . Contar as células diluída 1:10 em solução de Azul de Tripano usando um chambe Neubauerr.
- Placa as células em frascos de cultura de célula a uma densidade de 5 x 10 7 células / cm2, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C. Se possível, use hipóxia (5% de oxigênio) condições. Para o controlo do ensaio de CFU, placa 10 9 células em uma placa de cultura celular de 10 cm de diâmetro.
- Após 3 dias de cultura, as células estaminais mesenquimais estão ligados à placa de cultura celular, enquanto outras células permanecem em suspensão. Mudar os meios com meio basal suplementado com factor de 5 ng / mL de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Para o controle ensaio CFU, tratar o prato de cultura de células da mesma forma.
- Continue a cultura de células para um total de 2 semanas, a troca de meios três vezes por semana. Se as células superior a 80% de confluência, dividido por tripsinização. Para o controlo do ensaio de CFU, trocar a mídia da mesma forma, mas não se dividem as células para o curso de duas semanas.
5. Giemsa para ensaio CFU
- Preparar 10 ml de solução-Giemsa por prato: dilute a solução estoque (7,6 g / l Giemsa em glicerol: metanol) 1:10 em água estéril (sempre preparar uma diluição de trabalho de fresco).
- Remova o material da placa de cultura de células e lavar as células com PBS. Seja muito precautious ao aplicar líquido para a placa de petri e evitar lavagem fora das células.
- Fix células em metanol puro durante 5 min à TA. Descarte o metanol. Adicionar a solução-Giemsa e incubar durante 60 min, num incubador humidificado a 37 ° C.
- Lavar duas vezes com PBS. Air secar a cabeça placa pela primeira vez em uma toalha de papel. Contar as colónias manualmente. Este é melhor conseguido utilizando uma caneta marcador na parte de trás da placa.
6. MSC Diferenciação
- MSCs caninos diferenciação
NOTA: MSCs caninos foram diferenciadas em condrogênica, osteogênica e linhagens adipog�icas por estimulação com a mídia apropriada por quatro semanas. - Para Diferenciação adipogênica, MSCs cultura em monocamada em 4 x 10 5 cells / cm 2 alternando dois diferentes condições de cultura como se segue;
- Cultura em meio de manutenção contendo adipogénese GlutaMAX DMEM +, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / mL de anfotericina B e 170 mM de insulina.
- Cultura em meio de indução de adipogénese com meio de manutenção suplementado com 3% de FBS, 5% de soro de coelho, 1 uM de dexametasona, 500 uM de 3-isobutil-1-metilxantina, 33 uM de biotina, 5 uM e 17 uM rosiglitazona pantotenato 16.
- Revel as gotículas lipídicas por coloração com óleo Vermelho-O. Resumidamente, corrigir as células com 10% de formaldeído, lavar com PBS e manchar com óleo 0,35% O vermelho em isopropanol.
- Para diferenciação osteogénica cultura em monocamada em MSCs de 7 x 10 3 células / cm2 e estimulam a seguir:
- Avançada DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona.
- Identificar os depósitos de mineralização por Von Kossa (5% AgNO 3). Resumidamente, fixar as células com formaldeído a 10%, lava-se com PBS e mancha com 5% de AgNO 3 em água destilada.
- Diferenciação condrogênica
- Corte cubos (3 mm de cada lado) de uma esponja em forma de dispositivos médicos, constituída a partir de liofilizado colágeno tipo I, e utilizado como material de andaime para apoiar células 17.
- MSCs das sementes no topo dos cubos, na concentração de 4 x 10 6 células / ml (~ 70.000 células / cubo).
- Antes da adição de meios, para permitir que as células aderem aos cubos durante 30 min.
- Manter construções MSC-colagénio em meio condrogénica consistindo de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 ug / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 ug / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-X Selénio, e 10 ng / ml de factor de crescimento transformante-β1.
- Use coloração azul alcian visualizar acúmulo de proteoglicanos nas seções construções. Resumidamente, corar as secções O / N com 0,4% de azul de alcian dissolvido em 0,01% de H 2 SO 4 e 0,5 M de cloridrato de guanidina. Em seguida, lavam as secções foram lavadas durante 30 minutos em 40% de DMSO e 0,05 M de MgCl2. As células foram contrastadas com vermelho rápido nuclear.
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Representative Results
Os fatos que 74% das amostras de medula óssea de cães (n = 54) contidos coágulos quando chegaram em nosso laboratório (Figura 1A), juntamente com a diminuição da produtividade MSC partir dessas amostras, nos fez acreditar que um número considerável de MSCs foi preso dentro dos coágulos . Com efeito, uma simples DAPI-mancha de material de coágulo seccionado confirma a presença de células nucleadas em alta densidade (Figura 1B). E isso leva a baixos números de MSCs disponíveis para expansão da cultura, o que nos acionados para desenvolver o protocolo usando urokinase. Normalmente coagula desaparecer quase completamente ao aplicar nosso protocolo. No entanto, durante o desenvolvimento do método que abordou a questão do coágulo digerir sistematicamente por pesagem antes e depois de digerir. Estas experiências revelaram que os restos não digeridas foram de 15% (cão) ou 9% (humana) do peso do coágulo inicial (Figura 2A).
Uma característica típica do MSC derivadas da medula óssea é o umbilidade de aderir às placas de cultura de células. Os pesquisadores fazem uso dessa característica para selecionar para MSCs. Como consequência, um ensaio de formação de colónias permite avaliar a qualidade do conjunto de células de uma maneira simples, fiável e quantitativo. No nosso laboratório, o ensaio de formação de colónias aqui descrito foi aplicado rotineiramente para todas as amostras de medula óssea transformadas (também as não coagulado). Isso nos permitiu usar o ensaio como principal critério para determinar a eficácia do urokinase digerir. Para permitir a comparação directa, a partir de células de amostra filtrados coagulado (isto é, como se amostras coaguladas foram apenas filtrada mas não tratada enzimaticamente) e digerido coágulos foram semeadas em placas de 10 cm separadas, seguido de incubação durante duas semanas. Ao visualizar unidades formadoras de colónias (CFU) com Giemsa (tal como mostrado na Figura 2B), observou-se 3,8 vezes mais CFU das reacções de uroquinase de amostras canino do que a partir dos filtrados iniciais correspondentes (Figura 2C). Although menos proeminente, amostras humanas seguiu uma tendência semelhante com 1,6 vezes mais CFU de amostras tratadas, confirmando a adequação do protocolo. Com efeito, as placas de coágulo digerido ilustrados na linha da direita na Figura 2B correspondem ao resultado típico observado para uma amostra composta. No entanto, a variação dador pode facilmente resultar em número de UFC de metade para o dobro do que é descrito.
Tomando o tamanho da colónia como indicador da qualidade do conjunto de células, mais médio (2-5 mm) e grandes (> 5 mm) aparecerem colónias nas placas semeadas a partir de coágulos em comparação com a UFC de filtrados (Figura 2C). Isto indica geralmente que as MSCs crescer normalmente após o tratamento uroquinase. Além disso, no conjunto, a comparação das amostras digeridas canino (n = 21) para as amostras sem coágulo (n = 7), produziu um número comparável de MSCs totais para as amostras tratadas, embora uma grande variação inter-amostra foi observada devido à população heterogénea doador (Figura2D).
Como último teste funcional de aptidão, que induziu a diferenciação de CTMs derivadas de amostras de medula óssea digeridos. Aplicações em terapias com células estaminais autólogas são baseados na diferenciação MSC em cartilagem, osso ou tecido adiposo ou MSC paracrine sinalização 18. As células podem ser orientadas para o caminho desejado de diferenciação, escolhendo as condições de cultura adequados para a diferenciação adipogênica 19, diferenciação osteogênica 20 ou linhagem condrogênica 17. Por isso, comparamos MSCs de coágulo de medula óssea para MSCs derivados de amostra de medula óssea não coagulado. Depois de quatro semanas em cultura, foi possível diferenciar as MSCs em todas as três linhagens acima mencionados. Este foi testado histologicamente com Von Kossa (para linhagem osteogica), Oil Red O (adipogênica) e Alcian Blue (condrogênicos) colorações, não mostrando diferenças no grau de diferenciação entre os grupos ( 
Figura 1. coágulos de medula do osso. A porcentagem de amostras de cães e de medula óssea humana em estado parcialmente coagulado no momento da chegada (A). Além disso, verificou-se que os rendimentos de CME de amostras coaguladas foram fortemente reduzida devido a um elevado número de células presas dentro dos coágulos. Um elevado número de células nucleadas estão presentes dentro dos coágulos, tal como demonstrado por coloração com DAPI-de um criocorte de um coágulo de medula óssea canino (B). A barra de escala representa 200 fim. 
Figura 2. Isolamento de MSCs a partir de coágulos de medula óssea digeridos com uroquinase. (A) Em geral, a formação de coágulos de medula óssea desaparecer quase completamente em cima urokinase digerir.Após o desenvolvimento do método, avaliou pesos coágulo para canino (n = 5, a média ± SD, ** p ≤0.01) e amostras humanas (n = 3, a média ± SD, ns = não significativo p = 0,10), que foram fortemente reduzidas em cima urokinase digerir. (B) Um ensaio CFU simples pode servir como um instrumento informativo para avaliar a qualidade de uma preparação MSC. Para avaliar a eficácia da digestão, o ensaio de CFU foi realizada para filtrados e digeridos coágulos de aspirados de medula óssea separadamente. Depois de duas semanas em cultura, 10 placas de controlo cm foram coradas com Giemsa e CFU foram contados. O ensaio confirmou que o elevado número de CFU pode ser libertado a partir do coágulo pela uroquinase digerir e permanecer funcional. Isso também é confirmado pela alta freqüência de grandes colônias (classe-divisão:.> 5 mm de preto, 2-5 mm em cinza escuro e <2 mm de cinza claro barras de erro representam SD de CFU total (n = 5 para o cão , n = 3 para o ser humano, ** p ≤0.01, ns = não significativo, p = 0,17). (C) Imagems a partir de placas coradas com Giemsa confirmar os resultados apresentados. As placas mostrados para coágulo digerido correspondem a um resultado típico para uma amostra de medula óssea digerido - no entanto, os números podem variar, em grande parte devido à variabilidade dador. (D) Em suma, a aplicação do urokinase digerir protocolo (n = 21) resulta em rendimentos totais MSC comparáveis após a cultura de expansão para naturalmente coágulo amostras grátis (n = 7, a média ± SD). A análise estatística para a totalidade da Figura 2 foi realizada usando teste t de Student. 
Figura 3. Comparação de potencial de diferenciação das digerido contra amostras nativamente não coagulado. MSCs caninos isoladas de medula óssea coagulado tratado com Urokinase (top de linha) e da medula óssea não coagulado (linha de fundo) foram diferenciadas em fenótipo osteogênico e corados por Von Kossa (bar =200 um), fenótipo adipogênica foi corado por Oil Red O (bar = 100 mm; nas inserções de maior ampliação de vacúolos de gordura), enquanto chondrogenesis foi revelado pela coloração azul Alcian (bar = 100 mm; contracoloração vermelho rápido nuclear). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
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Discussion
Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma intervenção adicional separada necessitando novamente anestesia local ou geral 6. Isso requer a vontade de ambos do corpo clínico e o doador de contribuir e consome uma grande quantidade de recursos 21.
Aqui nós fornecemos um protocolo que utiliza urokinase humana recombinante em amostras de medula óssea coagulado para isolar MSCs multipotentes. Foi possível demonstrar que o tratamento uroquinase não prejudicar as células e o potencial de diferenciação é retida. O protocoloé curto, uma vez que o processamento da amostra só prolonga por cerca de 1 ½ horas, em comparação com amostras não coagulado enquanto produzindo agrupamentos de células comparáveis. Até o momento, este protocolo tem sido aplicado com sucesso em coágulos de medula óssea de diferentes indivíduos e cães usando urokinase partir de vários lotes e tem mostrado sucesso robusta e reproduzível. Para além disto, a uroquinase actua indirectamente através da activação de plasminogénio amostra-intrínseca. Isto implica que a reacção requer a uroquinase-ambiente de plasma. Por isso, é desaconselhável a introduzir passos de lavagem de coágulos ou parecidos com, por exemplo, PBS. Isto iria diluir o ambiente soro e conduzir a um abrandamento significativo da reacção enzimática.
A decisão de usar urokinase para o nosso método e não uma outra droga trombolítica foi trivial: desenvolvemos o protocolo baseado no droga trombolítica prontamente disponíveis em nossa farmácia hospitalar. Para outros grupos de pesquisa pode, portanto, ser mais fácil de utilizar um tecido-tipe ativador de plasminogênio (ie., um medicamento diferente, como alteplase, reteplase ou tenecteplase) se urokinase não está disponível. No entanto, as diferenças potencialmente importantes entre as drogas existem: ao contrário do tipo activadores do plasminogénio tecidual, uroquinase pode desencadear a activação e proliferação de células, quando ligado ao receptor do activador de plasminogénio de tipo uroquinase (uPAR) 22. Após a ligação, cascatas de sinalização intracelular são ativadas que levam à migração e proliferação celular. Em uma situação fisiológica este é ainda apoiada pela secreção de metaloproteinases da matriz por células activadas. No entanto, em nosso sistema, urokinase é diluída e gradualmente retirados em cima da cultura expansão sem mostrar efeitos prejudiciais. Ainda assim, no que diz respeito ao uso pretendido das MSCs isoladas, a adequabilidade de qualquer um dos trombolíticos tem de ser determinado individualmente.
Geralmente, doses elevadas de coágulo rápida e completa digest são recomendados para mimizar a selecção indesejada durante o processamento do coágulo. , Muitos estudos anteriores Notáveis usado estreptoquinase bacteriana para a digestão de sangue e de medula óssea coágulos 13,14. No entanto, este fármaco pode provocar uma activação indesejada e a resposta do sistema imunitário, o que pode ser uma grande desvantagem, especialmente quando a aplicação de células de pacientes se destina.
Portanto, acreditamos que nosso protocolo, não só ajudar os investigadores e profissionais da área médica para poupar tempo e reduzir custos. Usando urokinase - uma droga enzimática aprovado sem antigenicidade conhecida - pode ainda fornecer uma ferramenta valiosa para muitos laboratórios de translação de investigação que visam o uso terapêutico das preparações MSC.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
