Introduction
중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 재생 의학 및 조직 공학에 중요한 역할을합니다. 그들은 그들에게자가 치료 2,3를위한 이상적인 후보자를 표현하는 다양한 세포 유형 1로 분화와 접목, 마이그레이션 할 수 있습니다. 최근, 뼈와 연골 수리를 위해 중간 엽 줄기 세포를 이용하여 임상 시험은, 호스트 질환이나 심장 질환 이식편 대 4를 출시했다. 이러한 중간 엽 줄기 세포는 제대혈이나 지방 조직에서 수확 할 수 있지만 가장 유망한 결과는 골수 유래 줄기 세포 5 얻었다.
장골 골수 상당한 양의를 수집 할 수 있으므로 흡인 6의 메인 사이트의 역할을한다. 그러나 대기음의 품질 인출 골수 부피가 증가함에 따라 감소한다. 골수 흡 인물의 제 5 ㎖ 고품질의 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 반면, 많은 양의 취하 말초 혈액 F와 흡 인물의 희석에 이르게높은 혈관 뼈 7 롬. 항응고제를 사용하지 않고서 본 거핵 혈소판, 골수 흡 인물은 응고되기 쉽다. 그러나 심지어 항응고제, 혈전이 발생할 수 있습니다.
골수에서 중간 엽 줄기 세포는 전체 풀 (8)의 단지 작은 부분을 나타내고, 대부분의 조직 공학 또는 치료 응용 4 배양에서 확장해야한다. 이러한 문화의 품질은 크게 초기 셀 풀, 즉에 따라 달라집니다., 다양성과 높은 기동 번호 9. 인출에서 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자는 부분적으로 기증자의 변화에 의해 설명 될 수있다. 한편, 낮은 품질의 샘플들로부터 중간 엽 줄기 세포의 수를 달성하기 위해 더 긴 시간 배양 및 계대 확장을 필요로한다. 어느 경우에도, 연장 계대는 세포 노화의 소스이고 10 분화 잠재력의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 셀 (Y)을 극대화 할 수있는 프로토콜을 최적화과의 ield 11,12 악영향이 개발 될 필요가 방지.
우리가 개 중간 엽 줄기 세포와 함께 작업을 시작했을 때 다행히 응고 인간의 샘플 (열에서 하나) 덜 자주있는 동안, 우리는 3 ~ 4 개에서 골수 샘플 혈전 포함 된 것을보고 깜짝 놀랐다. 반면에 우리가 응고 샘플에서 중간 엽 줄기 세포의 훨씬 낮은 수익률을 관찰하는 것이, 놀랍지 않습니다. 응고 된 샘플의 반복 문제를 해결하기 위해, 우리는 리샘플링 대신 혈전 용해 약물 유로 키나아제를 사용하는 프로토콜을 개발했다.
혈전 용해 요법은 심장 마비, 뇌졸중 또는 때문에 원치 않는 응고의 색전증을 일으키는 혈관의 폐색과 같은 생명을 위협하는 상황에 대처 할 수 있습니다. 그들은 플라스 민과 효소 플라스 미노 겐 활성제에 의한 섬유소의 효소 분해를 통해 혈전의 분해에 의해 작동합니다. 환자의 치료에 널리 사용에도 불구하고, 매우 소수의 서적은 활용도가 혈전 활동하는 것이 존재실험실 응용 프로그램이 응고 샘플을 구출하기 위해, 대부분의 림프구에 초점을 맞추고. 1987 년, 니쿠 등. (13)와 4 년 뒤 기능 림프구의 결과로 혈전을 용해 스트렙토의 사용을 설명, 드 비스 등. 유세포 애플리케이션 (14)에 대한 혈액 및 골수에서 백혈병 세포를 분리 스트렙토의 사용을 확장. 최근 간행물은 암 진단 15 Alteplase의 사용을 제안한다. 동일한 효소 적 방법을 사용하는 동안, 우리는 프로토콜 줄기 세포 연구 분야를위한 툴을 제공하는 MSC의 분화능 양식 골수의 분리에 초점을 맞춘다.
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Protocol
참고 : 장골에서 인간의 골수 흡인는 루체른의 광저우의 윤리위원회의 승인을 기증자를 동의에서 수집되었다. 장골에서 송곳니 골수 흡 인물은 (약. 20 ㎖) 개 오너 consent.Human으로 수집 하였다 송곳니 (약. 10 ㎖) 골수 흡인했다 항 응고 즉시 철수 후 3.8 %의 구연산 나트륨 15ml를 첨가하여 조작 극장에서. 샘플로서 인출 당일 처리 실험실 환경에 옮겼다.
유로키나제 1. 준비 (이전에 1 차 사용에)
- 제조업체의 지시에 따라 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 재구성 유로키나제 : 10 ㎖ 주사기를 사용하여 격막-입구 플라스크에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 1 mL 당 50,000 사출 유닛 (U)을 얻었다 소용돌이에 의해 건조 물질을 녹이고.
- 의에 500 ㎕를 분주 (25,000 U 각)를 준비terile 튜브. 스토어 씩 -20 ° C 및 6 개월 이상 필요할 때 사용.
2. 제조 단계 (이전에 모든 골수 치료에)
- 유로키나제 중 하나 나누어지는 응고 골수 흡인 당 (25,000 U)를 (25 ml의에 흡인 볼륨이 성공적으로 25,000 U의 단일 나누어지는을 사용하여 처리 된) 해동.
- 37 ° C의 물 목욕이나 진탕 배양기를 예열한다.
응고 3. 효소 다이제스트
- 처리 중 골수 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 층류 바이오 안전성 캐비닛의 모든 작업을 수행합니다. 감염 가능성이 인간의 물질로 작업 할 때, 보호 장갑뿐만 아니라 취급에주의의 사용을 권장합니다.
- 멸균 50 ML 튜브의 상단에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 조심스럽게 스트레이너를 기울 또는 응고 물질 주위를 이동, 셀 스트레이너를 통해 골수 흡인 액을 붓는다. 대한 멸균 피펫 팁을 사용하여필터 망을 통해 더 나은 흐름.
참고 : PBS와 혈전을 세척하여, 예를 들면, 혈전의 희석을 피하십시오. 유로 키나아제는 간접적으로 작용하고 혈청의 구성 요소 (예 :., 플라스 미노 겐) 효과 다이제스트에 대한 생검이 필요합니다. 응고 물질과 절차를 계속하면서, 여액을 단계 3.6에 더 사용할 때까지 실온에서 유지 될 수있다. - 무균 핀셋을 사용하여 빈 세포 배양 접시에 골수 응고 재료를 전송합니다. 약 2mm 3 멸균 메스를 사용하여 작은 조각으로 파편을 잘라.
- 무균 핀셋을 사용하여 50 ㎖ 반응 관에 혈병의 작은 조각을 전송. 다진 응고 젖은 모습을 가지고 있는지 확인하십시오. 이 마른 것 같으면, 축축 3.1 단계에서 여과 액의 일부를 사용합니다.
- 로 pipetting 아래 5 ml의 마이크로 타이 피펫을 사용하여 5 회에 의해 혈전을 씹다. 샘플 유로키나제의 1 나누어지는을 추가합니다. 37 ° C에서 어느 수욕 또는 30 분 동안 인큐베이션진탕 (부드럽게) 인큐베이터.
- 로 pipetting 아래 5 ML의 피펫을 사용하여 5 회에 의해 씹다. 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다. 37 ° C에서 또 다른 30 분 동안 품어. 배양 후, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 다시 5 회 연화. 단계 3.2에서 여과와 풀에 신선한 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다.
- 원심 분리기 (500)의 X g에서 10 분 동안 주위 온도에서 세포 현탁액. 상층 액을 제거한다. 설명 또는 MSC 확장 문화에 대한 실험실의 표준 절차에 따라 같은 매체에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
확장 세포 배양 및 CFU 플레이트 4. 시드
- 알파 MEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2.5 ㎎ / ㎖의 암포 테리 신 B로 보충 : 기초 배지 50 ㎖ 중의 (적혈구 및 단핵 세포로 구성됨) 세포를 재현 탁 . 세포에게 노이 바 우어 chambe를 사용하여 트리 판 블루 용액 희석 1:10 카운트R.
- 5 × 107 세포 / ㎠의 밀도로 세포 배양 플라스크에서 세포를 플레이트 및 37 ° C에서 가습 배양기에서 배양한다. 가능하면, 저산소 (5 % 산소) 조건을 사용합니다. CFU 분석 제어시 10cm 직경의 세포 배양 접시에 세포를 10 9 접시.
- 다른 세포 현탁액에 남아있는 동안 배양 3 일 후, 중간 엽 줄기 세포는 세포 배양 접시에 부착된다. 5 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)이 보충 된 기본 배지로 미디어를 변경한다. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 세포 배양 접시를 치료.
- 미디어 일주일에 세 번 교환, 이주의 총 세포 배양을 계속합니다. 세포가 80 % 컨 플루 언시를 초과하면, 트립신 처리에 의해 분리. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 미디어를 교환하지만, 2 주 코스의 세포를 분할하지 않는다.
CFU 분석 5. 김사 얼룩
- 접시 당 김사-용액 10 ml의 준비 : DIL을UTE 원액 (글리세롤 7.6 g / L 김사 : 메탄올) 1시 10분 멸균 물 (항상 신선한 작업 희석을 준비).
- 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 씻어. 페트리 접시에 액체를 적용 할 때 매우 precautious하고 세포를 세척을하지 마십시오.
- RT에서 5 분 동안 순수한 메탄올에 세포를 고정. 메탄올을 폐기하십시오. 김사-솔루션을 추가하고 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 60 분 동안 품어.
- PBS로 2 회 세척 할 것. 공기는 종이 타월에 먼저 판 머리를 건조. 수동으로 식민지를 계산합니다. 이것은 최상의 플레이트의 후방에 마커 펜을 사용하여 달성된다.
6. MSC 차별화
- 개 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고 : 개 중간 엽 줄기 세포는 4 주 동안 해당 매체를 자극하여 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포 계통으로 분화되었다. - 용 지방 세포 분화, 4 × 10 5 CE에서 단일 층의 문화 엽 줄기 세포다음 LLS / cm 2 개의 상이한 배양 조건 교번;
- DMEM + 루타, 3 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 170 mM의 인슐린을 함유하는 지방 형성 유지 배지에서 배양.
- 3 % FBS, 5 % 토끼 혈청, 1 μM 덱사메타손으로 보충 유지 배지 지방 형성 유도 배지에서 배양, 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 33 μM 바이오틴, 5 μM 로시글리타존 16 17 μM 판토텐산.
- 오일 레드 O로 염색하여 지질 방울을 르벨. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 해결 PBS로 세척 및 이소프로판올 0.35 % 오일 레드 O로 염색.
- 7 × 103 세포 / cm (2)와 다음의 자극 단층에서의 조골 세포 분화 중간 엽 줄기 세포 배양의 경우 :
- 고급 DMEM (GIBCO) 루타 + 5 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 501; M L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 10mM의 글리세의 ß-100 nm의 덱사메타손.
- 폰 코사 염색 (5 % AGNO 3)에 의한 광물 예금을 확인합니다. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 고정 5 % 증류수에 AGNO 3 PBS와 얼룩 씻는다.
- 연골 세포의 분화
- 스폰지 형 의료 장치로부터 절단 조각 (면당 3mm)는, 동결 건조 된 콜라겐 형 I로부터 구성되고 셀 (17)을지지하는 지지체 재료로서 사용된다.
- 4 × 106 세포 / ml (~ 70,000 세포 / 큐브)의 농도로 큐브의 위에 시드 엽 줄기.
- 매체의 첨가에 앞서, 세포를 30 분 동안 큐브에 부착 할 수있다.
- DMEM / F12 + 루타, 2.5 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2.5 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 40 NG / ㎖ 덱사메타손 (dexamethasone), 50 ㎍ / ㎖의 아스 코르 빈산으로 구성된 연골 미디어 MSC-콜라겐 구조를 유지 산 -2- 포스페이트,50 ㎍ / ㎖의 L 프롤린, 1X 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 X 및 성장 인자 β1 변형 10 ng / ml이되게 준비 하였다.
- 구조 섹션에 프로테오글리칸의 축적을 시각화하는 알 시안 블루 염색을 사용합니다. 간단히, 0.01 %의 H 2 SO 4 및 0.5M 구아니딘 하이드로 클로라이드에 용해하고 0.4 % 알 시안 블루 섹션 O / N 얼룩. 다음, 세척 섹션은 40 % DMSO와 0.05 M의 MgCl 2에서 30 분 동안 세척 하였다. 세포 핵 빠른 빨간색으로 대조되었다.
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Representative Results
함께 그들은 우리의 실험실 (그림 1A)에 도착했을 때 개 골수 샘플의 74 % (N = 54) 혈전을 포함한다는 사실은 우리가 중간 엽 줄기 세포의 상당수가 혈전 내에 갇혀 있다고 생각했고, 이러한 샘플에서 MSC 수율을 감소 . 실제로, 단면 응고 재의 간단한 DAPI 얼룩은 고밀도 (도 1B)에 유핵 세포의 존재를 확인한다. 이것은 궁극적 유로키나제를 사용하여 프로토콜을 개발하기 위해 우리를 트리거 확장 문화에 사용할 수 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자로 이어집니다. 일반적으로 우리의 프로토콜을 적용 할 때 거의 완전히 사라지는 혈전. 그러나, 방법의 개발 과정에서 우리는 혈전의 문제 이전에 무게에 의해 소화 한 후 체계적으로 소화 해결. 이러한 실험은 소화되지 않은 나머지 15 % (개) 또는 초기 응고 중량 (그림 2A)의 9 % (인간) 것으로 확인된다.
중간 엽 줄기 세포 유래 골수의 전형적인 특징은이다부 합성 세포 배양 접시에 부착합니다. 연구진은 중간 엽 줄기 세포에 대한 선택하려면이 특성을 사용한다. 결과적으로, 분석을 형성하는 콜로니를, 간단하고 신뢰할 수있는 정량적 인 방법으로 세포 풀의 품질을 평가할 수있다. 실험실에서, 본원에 기재된 콜로니 형성 분석은 모든 처리 된 골수 샘플 (또한 비 응고 한 것)에 일상적으로 적용되어왔다. 이것은 우리가 다이제스트 유로키나제의 효능을 결정하기위한 주 기준으로서 사용하여 분석을 할 수 있었다. 직접 비교, 응고 샘플 여과 액에서 세포를 허용하려면 (즉, 응고 된 샘플은 필터링하지만, 효소 처리하지 않은 것처럼)과 혈전이 2 주 동안 배양 한 다음 별도의 10cm 접시에 씨앗을 품고 있었다 소화. (그림 (b)에 도시 한 바와 같이) 김사 얼룩 콜로니 형성 단위 (CFU)을 시각화 할 때, 우리는 해당 초기 여과 액 (그림 2C)에서보다 개 샘플의 유로 키나아제 반응에서 3.8 배 CFU를 관찰했다. Alth깨닫지 못하고 있거나 남의 덜 두드러진 인간 샘플 프로토콜의 적합성을 확인하는 처리 샘플에서 1.6 배 더 CFU와 유사한 경향을 따랐다. 사실, 그림 2B에서 오른쪽 행에 도시 소화 응고의 판은 풀링 된 샘플에 대해 볼 수있는 전형적인 결과에 해당합니다. 그러나 기증자의 변화는 쉽게 묘사된다 무엇 두 배 반에서 CFU 번호의 원인이 될 수 있습니다.
판 여과 액에서 CFU (그림 2C)에 비해 혈전에서 시드 셀 풀의 품질 표시, 더 매체 (2~5mm) 및 대형으로 식민지 크기 촬영 (> 5mm) 식민지 나타났다. 이것은 일반적으로 중간 엽 줄기 세포는 유로키나제 치료 후 정상적으로 성장을 나타냅니다. 또한 응고없이 샘플로 집계, 소화 개 표본의 비교 (N = 21)에서 (N = 7) 큰 간 샘플 변화는 이기종 기증자 인구로 인해 관찰되었지만, 처리 샘플에 대한 총 중간 엽 줄기 세포의 비교 숫자를 산출 (그림2D).
적합성의 마지막 기능 테스트를 위해 소화 골수 샘플로부터 유래 중간 엽 줄기 세포의 분화를 유도. 자가 줄기 세포 치료의 응용 프로그램은 연골, 뼈 또는 지방 조직 또는 18 신호 MSC의 분비에 MSC 차별화를 기준으로합니다. 세포는 지방 세포 분화 19 일 골 세포 분화 또는 연골 세포 계보 20 17 대한 적절한 배양 조건을 선택하여 원하는 분화 경로쪽으로 안내 될 수있다. 따라서, 우리는 골수 응고에서 unclotted 골수 샘플로부터 유래 중간 엽 줄기 세포에 중간 엽 줄기 세포를 비교했다. 4 주 배양 한 결과, 위에서 언급 한 세 개의 중간 엽 계통으로 분화 할 수 있었다. 이 조직 학적으로, 폰 코사 (골 형성 리니지) 테스트되었습니다 그룹 간 차별화의 등급에 차이를 보여주는 오일 레드 O (지방 세포)와 알 시안 블루 (연골)의 염색, ( 
그림 1. 골수 혈전. 도착 (A)에 따라 부분적으로 응고 상태의 송곳니와 인간의 골수 샘플의 백분율. 또한, 우리는 응고 샘플에서 MSC 수익률이 강하게 인해 혈전 내에 갇혀 세포의 높은 숫자로 감소 된 것으로 나타났다. 유핵 세포의 높은 번호는 개과의 골수 응고 (B)에서 동결 절단 (Cryosections)의 DAPI - 염색에 의해 입증 된 바와 같이 혈전 내에 존재한다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 
유로키나제으로 분해 골수 혈전에서 중간 엽 줄기 세포의 분리 2. 그림. (A)는 전형적으로, 골수 괴는 유로키나제 다이제스트에 거의 완전히 사라진다.방법 개발에, 우리는 (N = 5, ≤0.01 ** P는, 평균 ± SD)과 인간의 샘플 개에 대한 응고 가중치를 평가 (N = 3, 평균 ± SD, NS = 중요하지 P = 0.10)이 강하게에 감소되었다 그 유로키나제 다이제스트. (B) 간단한 CFU 분석은 MSC 제제의 품질을 평가하기위한 도구 유익한 역할을 할 수있다. 다이제스트의 효능을 평가하기 위하여, CFU 분석은 별도로 골수 흡 인물로부터의 여액과 소화 혈전을 행 하였다. 배양 2 주 후에, 10cm 제어 플레이트는, 지엠 사 (Giemsa)로 염색하고, CFU를 계수 하였다. 분석은 CFU의 높은 수를 소화하고 기능을 유지 유로 키나아제에 의해 응고에서 해제 될 수 있음을 확인. 이것은 또한 큰 식민지 (클래스 부문의 높은 주파수에 의해 확인된다. 블랙> 5mm, 어두운 회색 2-5 mm이고 밝은 회색에서 <2mm 오차 막대는 개에 대한 N = 5 (총 CFU의 SD를 나타냅니다 N = 인간의 3, ** P는 ≤0.01, NS = 중요하지, P = 0.17). (C) 사진김사 염색 판에서의이 같은 결과를 확인합니다. 소화 응고에 대해 표시된 판은 소화 골수 샘플에 대한 전형적인 결과에 해당하는 - 그러나, 숫자 기증자 변동성에 크게 따라 다를 수 있습니다. 합에 (D), 유로키나제 자연스럽게 응고 무료 샘플 (N = 7, 평균 ± SD)에 확장 문화 후 비교 총 MSC 수익률 (N = 21) 결과를 프로토콜을 소화 적용. 전체 그림 2에 대한 통계 분석은 학생의 t의 -test를 사용하여 수행 하였다. 
기본적으로 unclotted 샘플에 비해 소화의 분화 가능성 그림 3. 비교. 유로키나제 (맨 윗줄)과 unclotted 골수 (아랫 줄)로 처리 응고 골수에서 분리 한 개 중간 엽 줄기 세포는 골 형성 표현형 차별화 및 폰 코사 (바 =으로 염색 하였다200 μm의), 지방 세포 표현형에 의해 염색 오일 레드 O (바 = 100 ㎛; 세트 지방 공포의 더 큰 배율), 연골이 알 시안 블루 염색에 의해 밝혀졌다 동안 (바 = 100 ㎛; 핵 빠른 빨간색을 대조 염색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
환자가 약간의 추가 작업 만이 동작 극장 요원에 의해 수행되어야하는 이점, (우리의 경우 주로 척추 수술) 수술을하는 동안 일상적으로 우리는 골수 샘플. 샘플은 즉시 인출 후 구연산 나트륨과 혼합 되더라도 그들이 처리 실험실에 도착했을 때, 많은 샘플이 부분적으로 응고했다. 이 단계에서, 응고 표본을 대체 할 리샘플링은 별도의 추가 작업이 다시 로컬 또는 전신 마취 6 필요로 할 것이다. 이 기여할 수있는 임상 직원과 기증자 모두의 의지를 필요로하며, 자원 (21)를 많이 사용합니다.
여기에 우리가 능성의 중간 엽 줄기 세포를 분리 응고 골수 샘플에 재조합 인간 유로키나제를 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 유로 키나아제 처리가 세포를 손상시키지 않고 분화 잠재력이 유지되고 있음을 입증 할 수있다. 프로토콜비교 셀 풀을 산출하면서 unclotted 샘플에 비해에만 약 1 ½의 시간에 의해 샘플 처리를 연장하기 때문에 짧다. 지금까지,이 프로토콜은 성공적으로 여러 가지를 많이에서 유로키나제를 사용하여 다른 개인과 개에서 골수 혈전에 적용하고 강력하고 재현 성공을 보여 주었다. 이 외에도에서, 유로 키나아제는 샘플 고유 플라스 미노 겐 활성화를 통해 간접적으로 역할을합니다. 이는 유로 키나아제 반응은 플라즈마 환경을 필요로한다는 것을 의미한다. 그것은 예를 들어, PBS로 응고 세정 또는 모두의 단계를 도입하는 것이 바람직하지 않다입니다. 이는 환경 혈청을 희석하고 효소 반응의 상당한 감속을 초래할 것이다.
결정은 우리의 방법을 유로키나제를 사용하지 다른 혈전 용해 약물은 단순했다 : 우리는 우리의 병원 약국에서 쉽게 사용할 수있는 혈전 용해 약물을 기반으로 프로토콜을 개발했다. 다른 연구 그룹은 따라서 조직 일반를 사용하는 것이보다 쉬울 수 있습니다전자 플라스 미노 겐 활성제 (예., alteplase, reteplase 또는 tenecteplase 같은 다른 의약품) 유로 키나아제는 사용할 수없는 경우. 그러나 약물과 잠재적으로 중요한 차이가 존재한다 : 유로키나제 형 플라스 미노 겐 활성제 수용체 (uPAR) (22)에 결합 할 때의 조직 형 플라스 미노 겐 활성화 제와 달리, 유로 키나아제는 세포 활성화 및 증식을 트리거 할 수있다. 결합하면, 세포 내 신호 폭포는 세포의 이동과 증식에 납을 활성화됩니다. 생리 학적 상황에서이 더욱 활성화 세포에 의한 매트릭스 메탈로의 분비에 의해 지원된다. 그러나, 우리의 시스템에서, 유로 키나아제는 희석되고, 점차적으로 해로운 효과를 표시하지 않고 확장 문화에 제거. 또, 절연 엽 줄기 세포의 용도에 대해, 혈전 용해 약물의 임의의 적합성을 개별적으로 결정되어야한다.
일반적으로, 신속하고 완전한 응고 다이제스트 높은 투여 량은 미하는 것이 좋습니다응고 처리 중 원치 않는 선택을 nimize. 주목할만한, 이전의 많은 연구는 혈액과 골수 혈전 13,14 소화를 위해 박테리아 스트렙토을 사용했다. 그러나이 약물은 원치 않는 활성화 및 환자에게 세포의 응용 프로그램이하고자하는 경우 특히 큰 단점이 될 수있는 면역 체계의 반응을 유발 할 수 있습니다.
따라서 우리는 우리의 프로토콜은 시간을 절약하고 비용을 절감하기 위해 연구자 및 의료 전문가 도움이되지 않습니다 믿습니다. 유로키나제 사용 - 승인 된 효소 약물 알려진 항원없이 - 심지어 MSC 제제의 치료 적 사용을 목표로 많은 중개 연구 실험실을위한 유용한 도구를 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
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