Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) spielen eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Sie können Migration, Differenzierung in verschiedene Zelltypen 1 und einprägen, die ihnen die idealen Kandidaten für autologe Therapien 2,3 macht. In letzter Zeit, klinischen Studien mit MSCs für Knochen- und Knorpelreparatur, Graft-versus-Host-Erkrankung oder Herzerkrankung wurden eingeführt 4. Diese MSCs aus der Nabelschnur oder Fettgewebe gewonnen werden, sondern die vielversprechendsten Ergebnisse wurden aus dem Knochenmark stammenden Stammzellen 5 erhalten.
Der Beckenkamm ermöglicht, eine beträchtliche Menge von Knochenmark gesammelt und dient daher als Hauptstelle der Aspiration 6. Die Qualität des Aspirat nimmt jedoch mit zunehmendem Volumen von Knochenmark entnommen. Während die ersten 5 ml Knochenmarkaspirat enthält MSCs von hoher Qualität, Entzug von größeren Mengen führt zu einer Verwässerung des absaugen mit peripheren Blut fROM Die gefäßKnochen 7. Aufgrund der gegenwärtigen Megakaryozyten-Plättchen sind Knochenmarkaspiraten anfällig für die Blutgerinnung, es sei denn, Antikoagulanzien eingesetzt werden. Aber auch mit Antikoagulantien kann Blutgerinnsel auftreten.
Im Knochenmark-MSCs stellen nur einen kleinen Anteil der Gesamtzellpool 8 und haben in Kultur für die meisten Gewebezüchtung oder therapeutische Anwendungen 4 erweitert werden. Die Qualität einer solchen Kultur hängt weitgehend von der ursprünglichen Zellpool, dh., Vielfalt und eine hohe Startnummer 9. Niedrige Werte von MSCs aus Entnahmen kann teilweise durch Spendervariabilität erklärt werden. Auf der anderen Seite, MSCs von niedriger Qualität Proben erfordern längere Zeit in der Kultur und erweitert Passage, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erreichen. In jedem Fall ist verlängert Passagierung eine Quelle von Zellalterung und kann zum Verlust der Differenzierungspotential 10 führen. Daher optimierte Protokolle, Zell y maximieren könnenield und verhindert nachteilige Effekte entwickelt 11,12 werden müssen.
Als wir begannen, mit Hunde-MSCs zu arbeiten, waren wir erstaunt zu sehen, dass etwa drei von vier Hundeknochenmarkproben enthalten Blutgerinnsel, während glücklicherweise geronnen Humanproben (jede zehnte) wurden weniger häufig. Auf der anderen Seite war es keine Überraschung, dass wir viel niedrigeren Renditen von MSCs aus geronnenen Proben beobachtet. Um die wiederkehrende Frage der geronnenen Proben zu lösen, haben wir das Protokoll entwickelt, mit dem Thrombolytikum Urokinase anstelle von Resampling.
Thrombolytische Therapien lebensbedrohlichen Situationen wie Verschluss von Blutgefäßen verursacht Herzinfarkt, Schlaganfall oder Embolien aufgrund unerwünschter Blutgerinnung entgegenwirken. Sie wirken, indem sie den Abbau der Thromben durch enzymatische Spaltung von Fibrin durch Plasmin und Enzym Plasminogenaktivatoren. Trotz der breiten Verwendung zur Behandlung von Patienten, existieren nur sehr wenige Veröffentlichungen, die verwendet thrombolytischen Aktivitätenfür Laboranwendungen bis geronnenen Proben zu retten, vor allem mit Schwerpunkt auf Lymphozyten. 1987 Nikus et al. beschrieben die Verwendung von Streptokinase zur Auflösung von Blutgerinnseln, was zu Funktions Lymphozyten 13 und vier Jahre später, De Vis et al. erweitert die Verwendung von Streptokinase Leukämiezellen aus Blut und Knochenmark für die Durchflusszytometrie-Anwendungen 14 zu isolieren. Eine neuere Veröffentlichung schlägt die Verwendung von Alteplase für die Krebsdiagnostik 15. Während der Verwendung des gleichen Enzym Ansatz konzentriert sich unser Protokoll für die Isolierung von multi MSCs Form Knochenmark, um ein Werkzeug für Forscher in der Stammzell-Bereich bieten.
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Protocol
HINWEIS: Human Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden vom mündigen Spender mit Zustimmung der Ethikkommission des Kantons Luzern gesammelt. Canine Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden mit Hundebesitzers consent.Human gesammelt (ca. 20 ml) und Hunde (ca. 10 ml) Knochenmarkaspiraten waren antikoaguliert durch Zugabe von 15 ml 3,8% Natriumcitrat unmittelbar nach dem Rückzug im Operationssaal. Die Proben wurden auf die Laborumgebung zum Verarbeiten der gleiche Tag wie zurückführt.
1. Herstellung von Urokinase (Vor dem 1. Verwenden)
- Rekonstituieren Urokinase mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) nach den Anweisungen des Herstellers: 10 ml PBS zu dem Septum-Einlaß Kolben unter Verwendung einer 10 ml Spritze. Lösen Sie die Trockensubstanz durch Verwirbelung zu 50.000 Einspritzeinheiten (U) pro ml zu erhalten.
- Bereiten Sie 500 ul Aliquots (jeweils 25.000 U) in sterile Rohre. Speicher Aliquots -20 ° C und verwenden es, wenn sie für mindestens 6 Monate benötigt.
2. Präparative Schritte (Vor jeder Knochenmarkbehandlung)
- Auftauen ein Aliquot von Urokinase (25.000 U) pro geronnen Knochenmarkaspirat (Aspirate Volumina bis zu 25 ml wurden erfolgreich unter Verwendung eines einzigen Aliquot 25.000 U behandelt wurde).
- Heizen Sie ein Wasserbad oder Schüttelinkubator bis 37 ° C.
3. Enzymatische Digest des Clot
- Alle Arbeiten in einer laminaren Strömung Biosicherheitswerkbank, um eine mikrobielle Kontamination der Knochenmarkproben während der Verarbeitung zu vermeiden. Bei der Arbeit mit potenziell infektiöses humanes Material ist die Verwendung von Schutzhandschuhen sowie sorgfältige Umgang beraten.
- Legen Sie eine 100 um Zellsieb auf einem sterilen 50 ml-Tube. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat durch die Zelle Sieb, Kippen des Schmutzfänger oder bewegen das Gerinnungsmaterial. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze fürbessere Durchströmung des Filtergitter.
Hinweis: Vermeiden Sie jede Verdünnung des Gerinnsels, beispielsweise durch Waschen der Gerinnsel mit PBS. Urokinase wirkt indirekt und erfordert Komponenten des Serums (dh., Plasminogen) von der Biopsie zur wirksamen verdauen. Während der Fortsetzung des Verfahrens mit dem Gerinnungsmaterial, kann das Filtrat bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung in Schritt 3.6 gehalten werden. - Übertragen Sie die Knochenmark Blutgerinnsel Material in einen leeren Zellkulturschale mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie den Schmutz in kleine Stücke von etwa 2 mm 3 mit einem sterilen Skalpell.
- Übertragen der kleinen Stücke des Gerinnsels in einen 50 ml Reaktionsgefäß unter Verwendung der sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das Hackfleisch Gerinnsel hat eine Wet-Optik. Wenn es trocken zu sein scheint, verwenden Sie etwas von dem Filtrat aus Schritt 3.1 zu befeuchten.
- Man reibt das Gerinnsel durch Auf- und Abpipettieren für 5-mal mit einer 5 ml Pipette Mikrotiterplatten. 1 Aliquot von Urokinase an der Probe. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C entweder in einem Wasserbad oder inein Schütteln (sanft) Inkubator.
- Verreiben durch Auf- und Abpipettieren für 5 mal mit einer 5-ml-Pipette. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C. Nach der Inkubation verreiben wieder 5-mal mit einer 5 ml Pipette. Fahren Sie über eine neue 100 um Zellsieb mit dem Filtrat aus Schritt 3.2 zu bündeln.
- Zentrifuge die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 500 x g. Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in Medien wie unten oder nach dem Standardverfahren Ihres Labors für MSC Expansion Kultur beschrieben.
4. Seeding für Expansion Zellkultur und CFU-Platten
- Resuspendieren der Zellen (die aus Erythrozyten und mononukleäre Zellen) in 50 ml Basalmedium: Alpha-MEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2,5 mg / ml Amphotericin B supplementiert . Zählen Sie die Zellen 1:10 in Trypanblau Lösung unter Verwendung einer Neubauer chamber.
- Platte, die Zellen in Zellkulturflaschen in einer Dichte von 5 × 10 7 Zellen / cm 2 und Inkubation in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Falls vorhanden, hypoxische (5% Sauerstoff) Bedingungen. Für den CFU-Assay Steuerung Platte 10 9 Zellen in einer Zellkulturschale von 10 cm Durchmesser.
- Nach 3 Tagen Kultur werden die mesenchymalen Stammzellen an der Zellkulturschale befestigt ist, während andere Zellen in Suspension verbleiben. Ändern der Medien mit Basalmedium mit 5 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ergänzt. Für die CFU-Test Kontrolle, Behandlung der Zellkulturschale ebenfalls.
- Weiterhin Zellkultur für insgesamt 2 Wochen Austausch von Medien dreimal wöchentlich. Wenn die Zellen 80% Konfluenz überschreiten, durch Trypsinierung aufgeteilt. Für den CFU-Assay Steuerung, tauschen die Medien ebenfalls, doch spalten nicht die Zellen im Verlauf der zwei Wochen.
5. Giemsa Stain für CFU-Assay
- Bereiten Sie 10 ml Giemsa-Lösung pro Schale: dilute die Stammlösung (7,6 g / l Giemsa in Glycerin: Methanol) 1:10 in sterilem Wasser (immer eine neue Arbeitsverdünnung).
- Druckmaterial aus der Zellkulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Seien Sie sehr vorsichtiger bei der Anwendung von Flüssigkeit auf die Petrischale und vermeiden Abwaschen der Zellen.
- Fix Zellen in reinem Methanol für 5 min bei RT. Entsorgen Sie die Methanol. Hinzufügen die Giemsa-Lösung und Inkubation für 60 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C.
- Zweimal mit PBS waschen. Air zuerst trocknen Sie die Platte Kopf auf einem Papiertuch. Die Kolonien manuell. Dies wird am besten mit einem Filzstift auf der Rückseite der Platte erreicht.
6. MSC Differenzierung
- Canine MSCs Differenzierung
HINWEIS: Canine MSCs wurden in chondrogene, knochenbildende und adipogene Linien durch Stimulation mit den entsprechenden Medien über vier Wochen differenziert. - Für Adipogene Differenzierung, Kultur MSCs in Monolayer bei 4 x 10 5 cells / cm 2 abwechselnd zwei unterschiedliche Kulturbedingungen wie folgt;
- Kultur in Adipogenese Erhaltungsmedium, das DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B und 170 mM Insulin.
- Kultur in Adipogenese Induktionsmedium mit Erhaltungsmedium mit 3% FBS, 5% Kaninchenserum, 1 uM Dexamethason ergänzt, 500 uM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin, 33 uM Biotin, 5 uM Rosiglitazon und 17 uM Pantothenat 16.
- Schwelgen Sie die Lipidtröpfchen durch Färbung mit Oil Red-O. Kurz gesagt, reparieren Zellen mit 10% Formaldehyd, mit PBS waschen und färben mit 0,35% Oil red O in Isopropanol.
- Für osteogene Differenzierung Kultur MSCs in Monoschicht auf 7 x 10 3 Zellen / cm 2 und in der folgenden zu stimulieren:
- Erweiterte DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 501; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 10 mM ß-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason.
- Identifizieren Sie die Mineralisierung Einlagen von Von Kossa-Färbung (5% AgNO 3). Kurz gesagt, fixieren Sie die Zellen mit 10% Formaldehyd, Waschen mit PBS und Fleck mit 5% AgNO 3 in destilliertem Wasser.
- Chondrogene Differenzierung
- Cut Würfel (3 mm je Seite) von einem Schwamm geformt Medizinprodukt, gebildet aus lyophilisierten Kollagen Typ I, und als Gerüstmaterial verwendet, um Zellen 17 zu unterstützen.
- Seed MSCs auf der Oberseite der Würfel in einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml (~ 70.000 Zellen / Cube).
- Vor der Zugabe der Medien, um die Zellen, die den Würfel 30 Minuten einzuhalten.
- Pflegen MSC-Kollagenstrukturen in chondrogenem Medium aus DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 40 ng / ml Dexamethason, 50 ug / ml Ascorbinsäure -2-phosphat,50 ug / ml L-Prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selen-X, und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-β1.
- Verwenden Alcianblau Färbung, um die Ansammlung von Proteoglykanen in Konstrukte Abschnitte zu visualisieren. Kurz gesagt, färben die Abschnitte O / N mit 0,4% Alcianblau in 0,01% H 2 SO 4 und 0,5 M Guanidinhydrochlorid. Anschließend wurden die Schnitte waschen für 30 min in 40% DMSO und 0,05 M MgCl 2 gewaschen. Die Zellen wurden mit Kernechtrot gegengefärbt.
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Representative Results
Die Tatsache, dass 74% der Hundeknochenmarkproben (n = 54) enthalten sind Blutgerinnsel, wenn sie in unserem Labor (1A) kam zusammen mit verringerter MSC Erträge aus diesen Proben, hat uns davon überzeugt, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs wurde innerhalb der Blutgerinnsel gefangen . Tatsächlich ist ein einfaches DAPI-Färbung des geschnittenen Nungsmaterial bestätigt die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte (1B). Dies führt letztlich zu geringe Zahl von MSCs für die Expansion Kultur zur Verfügung, die uns ausgelöst, um das Protokoll mit Urokinase zu entwickeln. Typischerweise gerinnt verschwinden fast vollständig bei der Anwendung unserer Protokoll. Doch während der Methodenentwicklung wir der Frage nach, Gerinnsel systematisch zu verdauen durch Wiegen vor und nach verdauen. Diese Experimente zeigten, dass die unverdaute Rückstände waren 15% (Hund) bzw. 9% (human) von dem Anfangsgerinnselgewicht (2A).
Typisch für Knochenmark-MSCs ist einkeit auf Zellkulturschalen haften. Die Forscher nutzen diese Eigenschaften, um die für MSCs aus. Als Folge davon kann ein Koloniebildungstest, um die Qualität des Zellpools in einem einfachen, quantitativ und zuverlässig zu beurteilen. In unserem Labor sind die hierin beschriebenen Koloniebildungstest wurde routinemßig für alle verarbeiteten Knochenmarkproben (ebenfalls nicht geronnen sind) aufgebracht. Dies erlaubt uns, den Assay als Hauptkriterium für die Bestimmung der Wirksamkeit des Urokinase-Digest zu verwenden. Um den direkten Vergleich, Zellen von geronnen Probe Filtrate ermöglichen (dh, als ob geronnenen Proben wurden nur gefiltert, aber nicht enzymatisch behandelt) und verdaut Gerinnsel wurden auf separaten 10 cm Gerichte gefolgt von einer Inkubation für zwei Wochen geimpft. Bei der Visualisierung koloniebildenden Einheiten (CFU) mit Giemsa-Färbung (wie in 2B gezeigt), beobachteten wir, 3,8-mal mehr CFU vom Urokinase Reaktionen der Hunde-Proben als von den entsprechenden Anfangs Filtrate (2C). Although weniger prominent, gefolgt menschlichen Proben eine ähnliche Tendenz bei 1,6-fach mehr CFU von behandelten Proben bestätigt die Eignung des Protokolls. Tatsächlich sind die Platten der verdauten Gerinnsels in der rechten Reihe in 2B dargestellt entsprechen dem typisches Ergebnis für eine vereinigte Probe gesehen. Jedoch können Spender Variante leicht in CFU Zahlen ergeben sich aus der Hälfte um des Dargestellten zu verdoppeln.
Unter der Koloniegröße als Indikator der Zellpool Qualität, Medium (2-5 mm) und große (> 5 mm) Kolonien erschienen auf den Platten ausgesät von Gerinnseln im Vergleich zu der CFU von Filtraten (2C). Dies zeigt an, in der Regel, dass MSCs normal wachsen nach Urokinase Behandlung. Auch in dem Aggregat, der Vergleich verdaut canine Proben (n = 21) Proben ohne Gerinnsel (n = 7) ergab vergleichbare Zahlen von insgesamt MSCs für behandelte Proben, obwohl eine große interProbenVariation wurde aufgrund der heterogenen Spenderpopulation beobachtet (Fig2D).
Als letzten Funktionsprüfung der Eignung, induzierte wir Differenzierung von MSCs aus verdauten Knochenmarkproben abgeleitet. Anwendungen in autologen Stammzelltherapie auf die MSC-Differenzierung in Knorpel, Knochen oder Fettgewebe oder MSC parakrine Signal 18 basiert. Zellen können auf den gewünschten Weg der Differenzierung durch Auswahl der geeigneten Kultivierungsbedingungen für adipogene Differenzierung 19, osteogene Differenzierung 20 oder chondrogenen Linie 17 geführt werden. Daher verglichen wir MSCs aus dem Knochenmark Gerinnsel zu MSCs aus unclotted Knochenmarksprobe abgeleitet. Nach vier Wochen in Kultur, war es möglich, MSCs in allen drei oben genannten Linien zu unterscheiden. Dies wurde histologisch mit Von Kossa (für osteogenen Linie) getestet, Oil Red O (adipogene) und Alcianblau (chondrogene) Färbungen, zeigen keine Unterschiede in dem Grad der Differenzierung zwischen den Gruppen ( 
Abbildung 1. Die Knochenmark Blutgerinnsel. Prozentsatz der Hunde und der menschlichen Knochenmarkproben in teilweise geronnenen Zustand bei der Ankunft (A). Außerdem fanden wir, dass MSC Ausbeuten aus geronnenen Proben wurden stark aufgrund einer hohen Anzahl von Zellen innerhalb der Gerinnsel eingeschlossen reduziert. Wenn eine große Anzahl von kernhaltigen Zellen in den Gerinnseln durch DAPI-Färbung einer Kryoschnitt von einem Eckzahn Knochenmark Gerinnsels (B) gezeigt, vorhanden sind. Maßstabsbalken entspricht 200 um. 
Abbildung 2. Isolierung von MSC aus dem Knochenmark Blutgerinnsel mit Urokinase verdaut. (A) In der Regel verschwinden Knochenmark Gerinnsel fast vollständig auf Urokinase verdauen.Bei der Methodenentwicklung, untersuchten wir Gerinnselgewichte für Hunde (n = 5, Mittelwert ± SD, ** p ≤0.01) und Humanproben (n = 3, Mittelwert ± SD, ns = nicht signifikant p = 0,10), die stark von verringert wurden Urokinase verdauen. (B) Eine einfache CFU-Assay kann als informatives Instrument zur Bewertung der Qualität eines MSC Vorbereitung dienen. Um die Wirksamkeit des Verdaus zu beurteilen, wurde der CFU-Assay für Filtrate und verdauten Gerinnsel Knochenmarkabsaugungen separat durchgeführt. Nach zwei Wochen in Kultur wurden 10 cm Steuerplatten mit Giemsa angefärbt und CFU wurden gezählt. Der Test bestätigt, dass hohe Anzahl von CFU aus dem Gerinnsel durch Urokinase veröffentlicht verdauen und funktionsfähig bleiben werden. Dies wird auch durch die hohe Frequenz der großen Kolonien (Klasse-Abteilung bestätigt:.> 5 mm in schwarz, 5.2 mm in dunkelgrau und <2 mm in lichtgrau Fehlerbalken stellen SD des Gesamt CFU (n = 5 für Hunde , n = 3 für die humane, ** p ≤0.01, NS = nicht signifikant, p = 0.17). (C) Bilds von Giemsa-gefärbten Platten bestätigen die Ergebnisse angezeigt. Die Faul Gerinnsel gezeigt Platten entsprechen einem typischen Ergebnis für eine verdaut Knochenmarksprobe - jedoch Zahlen im Wesentlichen auf Spendervariabilität variieren. (D) In der Summe, die Anwendung der Urokinase verdauen Protokoll (n = 21) Ergebnisse in vergleichbaren Gesamt MSC Erträge nach der Expansion Kultur auf natürliche Weise gerinnen kostenlose Proben (n = 7, Mittelwert ± Standardabweichung). Die statistische Analyse für die gesamte Abbildung 2 wurde unter Verwendung von Student-t-Test. 
Abbildung 3. Vergleich der Differenzierungspotenzial gegenüber aufgeschlossen nativ unclotted Proben. Canine MSCs von geronnen Knochenmark mit Urokinase (obere Reihe) und unclotted Knochenmark (untere Reihe) behandelt isoliert wurden in osteogenen Phänotyp differenziert und von Von Kossa (bar = gebeizt200 & mgr; m), wurde die adipogene Phänotyp gefärbten Oil Red O (bar = 100 & mgr; m, in den Einsätzen größeren Vergrößerung Fettvakuolen), während der Chondrogenese wurde durch Alcianblau Färbung ergab (bar = 100 & mgr; m, Gegenfärbung Kernechtrot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .
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Discussion
Routinemäßig wir probieren Knochenmark, während der Patient in der Chirurgie (in unserem Fall vor allem Wirbelsäulenchirurgie), mit dem Vorteil, dass nur wenig zusätzliche Arbeit muss durch das Personal im Operationssaal durchgeführt werden. Auch wenn die Proben mit Natriumcitrat sofort nach Entnahme gemischt wurden viele Proben teilweise geronnen, wenn sie im Labor zur Verarbeitung angekommen. Zu diesem Zeitpunkt würde Resampling zu Clotted Exemplare zu ersetzen eine separate zusätzliche Intervention erforderlich wieder lokale Betäubung oder Vollnarkose 6. Dies erfordert die Bereitschaft sowohl des Klinikpersonal und den Spender einen Beitrag zu leisten und verbraucht eine Menge von Ressourcen 21.
Hier bieten wir ein Protokoll, das rekombinante humane Urokinase verwendet auf geronnen Knochenmarkproben zu multi MSCs zu isolieren. Wir konnten zeigen, dass die Urokinase Behandlung nicht schaden, die Zellen und das Differenzierungspotential bleibt erhalten. Das Protokollist kurz, da es verlängert Probenverarbeitung nur um ca. 1 ½ Stunden im Vergleich zu unclotted Proben, während die vergleichbare Zellpools. Bisher dieses Protokoll wurde erfolgreich auf das Knochenmark Blutgerinnsel von verschiedenen Individuen und Hunde mit Urokinase aus mehreren Partien angewendet und hat robuste und reproduzierbare Erfolge. Abgesehen davon indirekt wirkt Urokinase über Aktivierung von Abtast- intrinsische Plasminogen. Dies impliziert, dass die Urokinase-Reaktion erfordert das Plasma-Umgebung. Es ist daher ratsam, Maßnahmen der Gerinnsel Spül- oder gleich mit zB PBS einzuführen. Dies würde die Serum-Umgebung zu verdünnen und zu einer deutlichen Verlangsamung der enzymatischen Reaktion.
Die Entscheidung, Urokinase für unsere Methode zu verwenden und nicht ein anderes Thrombolytikum war trivial: wir das Protokoll entwickelt, basierend auf dem Thrombolytikum in unserem Krankenhausapotheke zur Verfügung stehen. Für andere Forschungsgruppen kann es daher einfacher, eine Gewebe-typ verwendenE-Plasminogen-Aktivator (dh., eine andere Medikament wie Alteplase, Reteplase oder Tenecteplase), wenn Urokinase ist nicht verfügbar. Es existieren jedoch möglicherweise wichtige Unterschiede zwischen den Medikamenten: Gegensatz Gewebetyp-Plasminogen-Aktivatoren, Urokinase kann Zell-Aktivierung und Proliferation, wenn an den Urokinase-Plasminogenaktivator-Rezeptors (uPAR) 22 gebunden auszulösen. Bei der Bindung sind intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert, führen zu Zellmigration und Proliferation. In einer physiologischen Situation dies wird durch die Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen durch die aktivierten Zellen unterstützt. In unserem System, Urokinase verdünnt und nach und nach bei der Expansion Kultur entfernt, ohne nachteilige Auswirkungen zeigt. Noch mit Bezug auf die beabsichtigte Verwendung des isolierten MSCs, die Eignung jedes der Thrombolytika muß individuell bestimmt werden.
Im Allgemeinen werden hohe Dosierungen für eine schnelle und vollständige Gerinnsel Digest empfohlen, minimieren unerwünschte Auswahl während Gerinnsel Verarbeitung. Bemerkenswert, vielen früheren Studien verwendet bakterielle Streptokinase für die Verdauung von Blut und Knochenmark Blutgerinnsel 13,14. Jedoch kann dieses Medikament unerwünschte Aktivierung und der Reaktion des Immunsystems, die ein Hauptnachteil sein kann insbesondere, wenn die Anwendung von Zellen an Patienten soll provozieren.
Wir glauben daher, dass unser Protokoll nicht nur Forscher und Mediziner helfen, Zeit zu sparen und Kosten zu senken. Mit Urokinase - ein zugelassenes Medikament ohne enzymatische bekannt Antigenität - vielleicht sogar ein wertvolles Instrument für viele translationalen Forschungslabors Ziel therapeutische Verwendung von MSC Zubereitungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
