Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) spiller en viktig rolle i regenerativ medisin og tissue engineering. De kan migrere, differensiere i ulike celletyper 1 og innpode, som gjør dem til ideelle kandidater for autologe terapier 2,3. I det siste, kliniske forsøk med MSC for bein og brusk reparasjon, graft versus host sykdom eller hjertesykdom ble lansert fire. Disse MSC kan høstes fra navlestreng eller fettvev, men mest lovende resultater ble oppnådd fra benmarg stamceller 5.
Hoftekammen gjør det mulig å samle en betydelig mengde av benmarg og derfor fungerer som hovedområde for aspirasjon 6. Men kvaliteten på aspirer avtar med økende volum av benmarg trukket tilbake. Mens de første 5 ml av benmargs inneholde MSCer av høy kvalitet, tilbaketrekking av større mengder fører til fortynning av aspireres med perifert blod fROM den svært vascularized bein 7. På grunn av de foreliggende megakaryocytter og blodplater, benmarg aspirater er utsatt for koagulering, med mindre antikoagulanter er brukt. Men selv med antikoagulasjonsmidler, kan det oppstå klumper.
I benmargen, MSC representerer bare en liten andel av den totale celle basseng 8 og må utvides i kultur for de fleste tissue engineering eller terapeutiske anvendelser 4. Kvaliteten på en slik kultur, avhenger i stor grad på den første cellen basseng, ie., Mangfold og et høyt startnummer 9. Lavt antall MSC fra uttak kan delvis forklares med donor variabilitet. På den annen side, MSC fra kvalitetsprøver lave krever lengre tid i kultur og utvidet aging å nå ønsket antall celler. I begge tilfeller er forlenget aging en kilde til celle senescens og kan føre til tap av differensiering potensial 10. Derfor optimalisert protokoller som kan maksimere celle yield og hindre skadevirkninger må utvikles 11,12.
Da vi begynte å jobbe med canine MSC, var vi forbauset over å se at omtrent tre av fire hjørnetann beinmargsprøver inneholdt klumper, mens heldigvis klumpete humane prøver (en av ti) var mindre hyppig. På den annen side var det ingen overraskelse at vi observert mye lavere avkastning av MSC fra koagulerte prøver. Å løse den tilbakevendende spørsmålet om koagulerte prøver vi utviklet protokollen med trombolytisk medikament urokinase stedet for resampling.
Trombolytiske behandling kan motvirke livstruende situasjoner som okklusjon av blodårer forårsaker hjerteinfarkt, hjerneslag eller embolisms grunn av uønsket blodpropp. De virker ved nedbrytning av blodpropp gjennom enzymatisk spalting av fibrin av plasmin og enzymatisk plasminogenaktivatorer. Til tross for den utstrakte bruken for behandling av pasienter, bare svært få publikasjoner eksisterer at utnyttet trombolytiske aktiviteterfor laboratoriebruk å redde koagulerte prøver, for det meste fokus på lymfocytter. I 1987 Niku et al. beskrev bruk av streptokinase for å løse opp blodpropper som resulterer i funksjonelle lymfocytter 13 og fire år senere, De Vis et al. utvidet bruk av streptokinase for å isolere leukemiceller fra blod og benmarg for strømningscytometriske anvendelser 14. Antyder En nyere publikasjon bruk av Alteplase for kreftdiagnostikk 15. Mens du bruker den samme enzymatisk tilnærming, fokuserer vår protokoll om isolering av multipotent MSC skjema benmarg for å gi et verktøy for forskere på stamcellefeltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Menneskebenmargs aspirates fra hoftekammen ble samlet inn fra samtykkende givere med godkjenning av den etiske komité i Luzern. Canine benmarg aspirater fra hoftekammen ble oppsamlet med hunden eierens consent.Human (ca. 20 ml) og canine (ca. 10 ml) benmarg aspirater var anti-koagulert ved tilsetning av 15 ml 3,8% natriumsitrat umiddelbart etter uttak i drift teater. Prøvene ble overført til laboratorieomgivelser for å behandle den samme dag som trukket tilbake.
1. Utarbeidelse av Urokinase (Før 1. Bruk)
- Rekonstituere urokinase ved hjelp av steril fosfatbufret saltløsning (PBS) i henhold til produsentens instruksjoner: Tilsett 10 ml PBS for å septum innløps kolbe ved anvendelse av en 10 ml sprøyte. Oppløs den tørre substans ved å svinge for å oppnå 50.000 injeksjons enheter (U) per ml.
- Forbered 500 ul porsjoner (25.000 U hver) inn sterile rør. Butikk porsjoner -20 ° C og bruke den når det er nødvendig i minst seks måneder.
2. fremstillings Steps (Før Hver Bone Marrow Treatment)
- Tine en delmengde av urokinase (25.000 U) per levret benmargsaspirat (aspirer volumer opp til 25 ml har blitt behandlet ved hjelp av en enkel mengde på 25.000 U).
- Forvarm et vannbad eller risting inkubator til 37 ° C.
3. Enzymatisk Digest av Clot
- Utføre alt arbeid i en laminær biosikkerhet kabinett å unngå mikrobiell kontaminering av beinmargsprøver under behandlingen. Når du arbeider med potensielt smittefarlig humant materiale, er bruk av vernehansker samt forsiktig håndtering anbefales.
- Plasser en 100 um cellefilter på toppen av et sterilt 50 ml rør. Hell forsiktig den benmargsaspirat gjennom celle sil, vippe sil eller flytte rundt blodpropp materiale. Bruk en steril pipette tips forbedre strømning gjennom filterduken.
MERK: Unngå enhver utvanning av blodpropp, for eksempel ved å vaske blodpropp med PBS. Urokinase virker indirekte og krever komponenter av serum (f.eks. Plasminogen), fra biopsi for effektiv digest. Mens fortsetter prosedyren med koagelet materiale, kan filtratet holdes ved romtemperatur inntil videre bruk i trinn 3.6. - Overfør benmargen blodpropp materialet inn i en tom celle kultur rett med steril tang. Skjær rusk i små biter på ca 2 mm 3 med en steril skalpell.
- Overfør de små biter av klumpen inn i en 50 ml reaksjonsrøret ved hjelp av sterile pinsetter. Kontroller at hakket blodpropp har en våt utseende. Dersom det synes å være tørr, bruke noen av filtratet fra trinn 3.1 til å fukte.
- Triturer blodpropp ved å pipettere opp og ned for fem ganger med en 5 ml microtiter pipette. Legg til en alikvot av urokinase i prøven. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C enten i et vannbad eller ien risting (forsiktig) kuvøse.
- Triturate ved å pipettere opp og ned for fem ganger med en 5 ml pipette. Utføre dette trinnet i en biosikkerhet kabinett. Inkuber i 30 min til ved 37 ° C. Etter inkuberingen triturer igjen 5 ganger ved hjelp av en 5 ml pipette. Passere over en frisk 100 mikrometer celle sil til bassenget med filtratet fra trinn 3.2.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved romtemperatur i 10 min ved 500 x g. Kast supernatanten. Re-suspendere cellepelleten i media som beskrevet nedenfor eller i henhold til standard prosedyre for laboratoriet for MSC utvidelse kultur.
4. Seeding for Expansion Cell Kultur og CFU Plates
- Resuspender cellene (som består av erytrocytter og mononukleære celler) i 50 ml basalmedium: Alfa-MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2,5 mg / ml amfotericin B . Telle celler fortynnet 1:10 i trypanblått løsning ved hjelp av en Neubauer chamber.
- Plate cellene i cellekulturflasker med en tetthet på 5 x 10 7 celler / cm 2, og inkuberes i en fuktet inkubator ved 37 ° C. Hvis tilgjengelig, kan du bruke hypoksiske (5% oksygen) forhold. For CFU analysekontroll, platen 10 9-celler i en cellekulturskål på 10 cm i diameter.
- Etter 3 dagers dyrking er mesenchymale stamceller festet til cellekulturskål, mens andre celler forblir i suspensjon. Endre media med basalmedium supplementert med 5 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF). For CFU analysen kontroll, behandle cellekultur fatet likeså.
- Fortsett cellekultur for totalt 2 uker, utveksle medier tre ganger i uken. Hvis cellene overstige 80% confluency, fordelt trypsinering. For CFU analysekontroll, utveksler mediene på samme måte, men ikke splitte cellene i løpet av de to uker.
5. Giemsa Stain for CFU Assay
- Forbered 10 ml Giemsa-løsning per tallerken: dilute av stamløsning (7,6 g / l Giemsa i glycerol: metanol) 1:10 i sterilt vann (alltid fremstille en frisk arbeids fortynning).
- Fjern materialet fra cellekultur fatet og vaske cellene med PBS. Vær veldig precautious når du søker væske til petriskål og unngå å vaske av cellene.
- Fiks celler i ren metanol i 5 min ved RT. Kast Metanol. Tilsett Giemsa-løsning og inkuberes i 60 minutter i en fuktet inkubator ved 37 ° C.
- Vask to ganger med PBS. Luft tørke platen hodet først på et papirhåndkle. Telle koloniene manuelt. Dette oppnås best ved bruk av en tusj på baksiden av platen.
6. MSC Differensiering
- Canine MSC differensiering
MERK: Canine MSC ble differensiert i chondrogenic, osteogen og adipogenic linjene ved stimulering med den aktuelle medier for fire uker. - For Adipogenic differensiering, kultur MSC i monolag på 4 x 10 5 cells / cm 2 alternerende to ulike oppdrettsbetingelser som følger;
- Kultur i adipogenese vedlikeholdsmedia inneholdende DMEM + Glutamax, 3% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amfotericin B og 170 mM insulin.
- Kultur i adipogenese induserende medier med opprettholdelsesmedium supplert med 3% FBS, 5% kaninserum, 1 uM deksametason, 500 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 33 mM biotin, 5 uM og 17 uM rosiglitazon pantotenat 16.
- Kalas lipid dråper ved farging med Oil Red-O. Kort, fikse celler med 10% formaldehyd, vask med PBS og beis med 0,35% Oil rød O i isopropanol.
- For osteogen differensiering kultur MSC i monolayer på 7 x 10 3 celler / cm 2 og stimulerer i følgende:
- Avansert DMEM (GIBCO) + Glutamax, 5% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amfotericin B, 501; M L-askorbinsyre 2-fosfat, 10 mM ß-glycerophosphate og 100 nM deksametason.
- Identifisere de mineralise innskudd ved Von Kossa flekken (5% Agno 3). I korthet fiksere cellene med 10% formaldehyd, vaskes med PBS og flekken med 5% AGNO 3 i destillert vann.
- Chondrogenic differensiering
- Cut kuber (3 mm per side) fra en svamp formet medisinsk enhet, konstitueres fra frysetørket kollagen type I, og brukes som stillasmateriale å støtte celler 17.
- Seed MSC på toppen av kuber ved en konsentrasjon på 4 x 10 6 celler / ml (~ 70.000 celler / kube).
- Før tilsetting av media, la cellene til å følge de kuber i 30 min.
- Oppretthold MSC-kollagen-konstruksjonene i chondrogenic medier bestående av DMEM / F12 + Glutamax, 2,5% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amfotericin B, 40 ng / ml deksametason, 50 ug / ml askorbinsyre -2-fosfat,50 ug / ml L-prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selen X, og 10 ng / ml transformerende vekstfaktor-β1.
- Bruk Alcian blå flekker å visualisere akkumulering av proteoglykaner i konstruerer seksjoner. Kort, beis seksjonene O / N med 0,4% Alcian blå oppløst i 0,01% H 2 SO 4 og 0,5 M guanidinhydroklorid. Deretter ble vaske delene vaskes i 30 min i 40% DMSO og 0,05 M MgCI2. Celler ble kontra med atom rask rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fakta at 74% av hjørnetann beinmargsprøver (n = 54) inneholdt klumper når de kom i vårt laboratorium (figur 1A) sammen med redusert MSC avkastning fra disse prøvene, fikk oss til å tro at et betydelig antall av MSC ble fanget i klumper . Faktisk, er en enkel DAPI-flekk av seksjonert klumpmateriale bekrefter tilstedeværelse av kjernedannede celler i høy tetthet (figur 1B). Dette fører til slutt til lave tall for MSC tilgjengelige for utvidelse kultur, som utløste oss å utvikle protokollen med urokinase. Vanligvis levrer forsvinner nesten helt når du søker vår protokoll. Men under metodeutvikling vi opp spørsmålet om blodpropp fordøye systematisk ved veiing før og etter fordøye. Disse forsøk viste at de ufordøyde restene var 15% (dog) eller 9% (human) av den første koagel vekt (figur 2A).
Et typisk trekk ved benmarg avledet MSC er etheten å følge cellekultur retter. Forskere gjøre bruk av denne egenskapen til å velge for MSC. Som en konsekvens, en kolonidannende analyse gjør det mulig å evaluere kvaliteten av celle bassenget i en enkel, kvantitativ og pålitelig måte. I vårt laboratorium har kolonidannende analysen beskrevet her er anvendt rutinemessig til alle beinmargsprøver bearbeidet (også ikke-klumpete seg). Dette tillot oss å bruke analysen som viktigste kriterium for å bestemme effekten av urokinase fordøye. For å tillate direkte sammenligning, celler fra klumpete prøvefiltrater (dvs. som om klumpete prøver ble bare filtrert, men ikke enzymatisk behandlet) og spaltet propper ble sådd ut på separate 10 cm skåler, fulgt av inkubering i to uker. Ved å visualisere kolonidannende enheter (CFU) med Giemsa beis (som vist i figur 2B), observerte vi 3,8 ganger mer CFU fra urokinase reaksjoner av canine prøvene enn fra de tilsvarende initielle filtrater (figur 2C). Although mindre fremtredende, humane prøver en tilsvarende utvikling med 1,6 ganger mer CFU fra behandlede prøver, bekrefter egnetheten av protokollen. Faktisk platene spaltet koagel illustrerte i den høyre rad i figur 2B tilsvarer den typiske resultat sett i en samleprøve. Imidlertid kan donor variasjon lett resultere i CFU tall fra en halv til å doble av det som er avbildet.
Tar koloni-størrelse som indikator på celle basseng kvalitet, mer medium (2-5 mm) og store (> 5 mm) kolonier dukket opp på platene seeded fra blodpropp sammenlignet med CFU fra filtratene (Figur 2C). Dette indikerer vanligvis at MSC vokse normalt etter urokinase behandling. Også i aggregatet, sammenligning av fordøyd canine prøver (n = 21) til prøver uten klump (n = 7) ga sammenlignbare totale antallet MSC for behandlede prøver, selv om en stor inter prøven variasjon ble observert på grunn av den heterogene donorpopulasjon (Figur2D).
Som en siste funksjonstest av egnethet, induserte vi differensiering av MSC avledet fra fordøyd beinmargsprøver. Søknader i autolog stamcelleterapi er basert på MSC differensiering i brusk, bein eller fettvev eller MSC parakrint signaliserer 18. Celler kan bli guidet mot den ønskede banen for differensiering ved å velge de riktige dyrkingsforhold for adipogenic differensiering 19, osteogen differensiering 20 eller chondrogenic avstamning 17. Derfor, vi sammenlignet MSC fra benmarg blodpropp til MSC avledet fra unclotted benmargsprøve. Etter fire uker i kultur, var det mulig å differensiere MSC til alle de tre ovennevnte linjer. Dette ble histologisk testet med Von Kossa (for osteogen avstamning), Olje Red O (adipogenic) og Alcian Blå (chondrogenic) stainings, viser ingen forskjeller i graden av differensiering mellom gruppene ( 
Figur 1. benmarg propper. Prosent av hjørnetann og menneskelig benmargsprøver i delvis clotted tilstand ved ankomst (A). Videre fant vi at MSC gir fra koagulerte prøver ble sterkt redusert på grunn av et høyt antall celler fanget innenfor propper. Et høyt antall av kjerneceller er til stede i løpet av de klumper som demonstrert av DAPI-fargingen av en cryosection fra en hund benmarg koagel (B). Scale bar representerer 200 mikrometer. 
Figur 2. Isolering av MSC fra benmarg propper fordøyd med urokinase. (A) Vanligvis benmargspropper forsvinner nesten helt på urokinase fordøye.Ved metodeutvikling, vi vurdert blodpropp vekter for canine (n = 5, gjennomsnitt ± SD, ** p ≤0.01) og humane prøver (n = 3, gjennomsnitt ± SD, ns = ikke signifikant p = 0,10) som ble sterkt redusert på urokinase fordøye. (B) En enkel CFU-analysen kan tjene som en informativ verktøy for å vurdere kvaliteten på en MSC forberedelse. Å vurdere effekten av sammendraget, ble CFU-analysen utført for filtratene og fordøyd propper fra benmarg aspirates separat. Etter to uker i kultur, ble 10 cm kontrollplater farget med Giemsa og CFU ble talt opp. Analysen bekreftet at høyt antall CFU kan frigjøres fra blodpropp ved urokinase fordøye og være funksjonell. Dette bekreftes også av den høye frekvensen av store kolonier (klasse-divisjon:.> 5 mm i svart, 2-5 mm i mørk grå og <2 mm i lys grå Feilfelt representerer SD av total CFU (n = 5 for hund , n = 3 for menneskelig, ** p ≤0.01, ns = ikke signifikant, p = 0,17). (C) Bildes fra Giemsa-farget plater bekrefte resultatene vist. Platene vist for fordøyd blodpropp tilsvarer et typisk resultat for en fordøyd benmargsprøven - men kan tallene varierer i stor grad på grunn av donor variabilitet. (D) I sum, påfører urokinase fordøye protokollen (n = 21) resulterer i sammenlign totale MSC gir etter utvidelse kultur til naturlig koagulere gratis vareprøver (n = 7, gjennomsnitt ± SD). Statistisk analyse for hele Figur 2 ble utført ved anvendelse av Students t-test. 
Figur 3. Sammenligning av differensiering potensialet fordøyd versus opprinnelig unclotted prøver. Canine MSC isolert fra levret benmarg behandlet med Urokinase (øverste rad) og unclotted benmarg (nederste rad) ble differensiert i osteogen fenotype og farget av Von Kossa (bar =200 um), ble adipogenic fenotype farget etter Olje Red O (bar = 100 mikrometer, i innfellinger større forstørrelse av fett vakuoler), mens chondrogenesis ble avslørt av Alcian blå flekker (bar = 100 mikrometer; kontraatom rask rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rutinemessig vi prøve benmarg mens pasienten gjennomgår kirurgi (i vårt tilfelle hovedsakelig ryggraden kirurgi), med den fordelen at bare litt ekstra arbeid må utføres av personell i operasjonen teater. Selv om prøvene blandes med natriumcitrat umiddelbart etter tilbaketrekning, mange prøver var delvis koagulert når de kom i laboratoriet for behandling. På dette stadium vil resampling å erstatte koagulerte prøvene være en separat ekstra inngrep nødvendiggjør igjen lokal eller generell anestesi 6. Dette krever vilje til både klinisk personale og giveren til å bidra og bruker mye ressurser 21.
Her gir vi en protokoll som bruker rekombinant humant urokinase på klumpete beinmargsprøver for å isolere multipotente MSC. Vi kunne vise at urokinase behandling ikke skader cellene og differensieringen potensialet er beholdt. Protokollener kort siden det forlenger utvalgets behandling bare med ca 1 ½ time i forhold til unclotted prøver mens gir sammenlignbare celle bassenger. Til dags dato har denne protokollen blitt brukt på beinmargspropper fra ulike individer og hunder bruker urokinase fra flere partier og har vist robust og reproduserbar suksess. Bortsett fra dette, fungerer urokinase indirekte via aktivering av sample-egenverdi plasminogen. Dette innebærer at urokinase reaksjonen krever den plasmamiljøet. Det er derfor unadvisable å innføre trinnene av koagel skylling eller likt med f.eks PBS. Dette ville fortynne serumet miljø og føre til en betydelig nedbremsing av den enzymatiske reaksjonen.
Beslutningen om å bruke urokinase for vår metode og ikke en annen trombolytisk medikament var trivielt: vi utviklet protokoll basert på trombolytisk medikament lett tilgjengelig i vår sykehusapotek. For andre forskningsmiljøer kan det derfor være enklere å bruke en vev-type plasminogenaktivator (ie., et annet medikament produkt som alteplase, reteplase eller tenecteplase) hvis urokinase er ikke tilgjengelig. Imidlertid potensielt viktige forskjeller mellom de stoffene foreligger: i motsetning til vev-type plasminogenaktivatorer, urokinase kan utløse celleaktivering og proliferasjon når de er bundet til urokinase-type plasminogen aktivator reseptor (uPAR) 22. Ved binding, er intracellulære signalkaskader aktivert som fører til celle migrasjon og spredning. I en fysiologisk situasjon dette er videre støttet av utskillelsen av matriksmetalloproteinaser av aktiverte celler. Men i vårt system, er urokinase utvannet og gradvis fjernet ved ekspansjon kultur uten å vise skadelige effekter. Likevel, med hensyn til den tiltenkte bruk av isolerte MSCer, må egnetheten av en hvilken som helst av de trombolytiske midler som skal bestemmes individuelt.
Vanligvis er høye doser for rask og fullstendig clot digest anbefalt å minimize uønsket utvalg under blodpropp behandling. Bemerkelsesverdig, mange tidligere studier brukes bakteriell streptokinase for bearbeider blod og benmarg propper 13,14. Imidlertid kan dette stoffet fremkalle uønsket aktivering og responsen av immunsystemet, som kan være en stor ulempe, spesielt når anvendelsen av celler til pasienter er tiltenkt.
Vi mener derfor at vår protokollen ikke bare hjelpe forskere og medisinske fagfolk for å spare tid og redusere kostnader. Ved hjelp av urokinase - en godkjent enzymatisk stoffet uten kjent antigenevne - kan også gi et verdifullt verktøy for mange translasjonsforskning forskningslaboratorier med sikte på terapeutisk bruk av MSC forberedelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
