Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule 1 e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe 2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati 4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate 5.
La cresta iliaca permette di raccogliere una notevole quantità di midollo osseo e serve quindi come sito principale di aspirazione 6. Tuttavia, la qualità del aspirato diminuisce con l'aumento del volume di midollo osseo prelevato. Mentre i primi 5 ml di midollo osseo contengono cellule staminali mesenchimali di alta qualità, ritiro delle maggiori volumi porta alla diluizione del aspirato con sangue periferico fROM l'osso altamente vascolarizzato 7. A causa delle attuali megacariociti e piastrine, aspirati di midollo osseo sono inclini a coagulazione, a meno di utilizzare anticoagulanti. Ma anche con anticoagulanti, possono verificarsi la formazione di coaguli.
Nel midollo osseo, cellule staminali mesenchimali rappresentano solo una piccola parte del pool di cellule totale 8 e devono essere espansa in coltura per più ingegneria dei tessuti o applicazioni terapeutiche 4. La qualità di una tale cultura dipende in gran parte la piscina cellula iniziale, vale a dire., La diversità e un alto numero di partenza 9. Basso numero di cellule staminali mesenchimali da prelievi possono essere in parte spiegati dalla variabilità dei donatori. D'altra parte, MSC da campioni bassa qualità richiedono tempo maggiore di cultura e passaging esteso a raggiungere il numero desiderato di celle. In entrambi i casi, passaging esteso è fonte di senescenza cellulare e può portare alla perdita di differenziazione potenziale 10. Pertanto, i protocolli in grado di massimizzare cellulare y ottimizzatoield ed evitare effetti nocivi devono essere sviluppati 11,12.
Quando abbiamo cominciato a lavorare con MSC canina, siamo stati sorpresi di vedere che circa tre su quattro campioni di midollo osseo canini contenuti coaguli, mentre i campioni umani fortunatamente coagulato (uno su dieci) erano meno frequenti. D'altra parte è stata una sorpresa, che abbiamo osservato rendimenti molto più bassi di cellule staminali mesenchimali da campioni coagulati. Per risolvere il problema ricorrente dei campioni coagulati, abbiamo sviluppato il protocollo con il urokinase droga trombolitico invece di ricampionamento.
Terapie trombolitici possono contrastare in pericolo di vita situazioni come l'occlusione dei vasi sanguigni, causando un attacco di cuore, ictus o embolie a causa di coagulazione indesiderati. Funzionano degradazione dei coaguli attraverso taglio enzimatico di fibrina da plasmina e del plasminogeno attivatori enzimatici. Nonostante l'ampio uso per il trattamento di pazienti, solo pochissime pubblicazioni esistono che le attività trombolitici utilizzate, c'eper applicazioni di laboratorio per salvare campioni coagulati, soprattutto concentrandosi su linfociti. Nel 1987, Niku et al. descritto l'uso di streptochinasi per dissolvere i coaguli di sangue con conseguente linfociti funzionali 13 e quattro anni dopo, De Vis et al. esteso l'uso di streptochinasi per isolare cellule leucemiche dal sangue e del midollo osseo per le applicazioni di citometria a flusso 14. Una pubblicazione più recente suggerisce l'uso di Alteplase per la diagnostica del cancro 15. Mentre si utilizza lo stesso approccio enzimatico, il nostro protocollo si concentra su l'isolamento di cellule staminali mesenchimali multipotenti forma di midollo osseo per fornire uno strumento per i ricercatori nel campo delle cellule staminali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: aspirati di midollo osseo umano dalla cresta iliaca sono stati raccolti da donatori consenzienti, con l'approvazione del comitato etico del cantone di Lucerna. Canine aspirati di midollo osseo da cresta iliaca sono stati raccolti con consent.Human del proprietario del cane (circa. 20 ml) e canino (circa. 10 ml) aspirati di midollo osseo erano anti-coagulato per aggiunta di 15 ml di 3,8% di citrato di sodio immediatamente dopo la sospensione in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti al ambiente di laboratorio per la lavorazione lo stesso giorno ritirata.
1. Preparazione di Urokinase (Prima del 1 ° Use)
- Ricostituire urokinase utilizzando sterile tampone fosfato salino (PBS) secondo le istruzioni del produttore: Aggiungere 10 ml di PBS al pallone setto-ingresso utilizzando una siringa da 10 ml. Sciogliere la sostanza secca agitando per ottenere 50.000 unità di iniezione (U) per ml.
- Preparare 500 microlitri aliquote (25.000 U ciascuno) in stubi terile. Conservare aliquote -20 ° C e utilizzare quando richiesto per almeno 6 mesi.
2. preparative Steps (prima di ogni midollo osseo Treatment)
- Scongelare una aliquota di urochinasi (25.000 U) per coagulato aspirato midollare (volumi di aspirato fino a 25 ml sono stati trattati con successo con una sola aliquota di 25.000 U).
- Preriscaldare un bagno d'acqua o agitazione incubatore a 37 ° C.
3. enzimatica Digest del Clot
- Eseguire tutti i lavori in una cappa a flusso laminare biosicurezza per evitare la contaminazione microbica dei campioni di midollo osseo durante la lavorazione. Quando si lavora con materiale umano potenzialmente infetto, è consigliato l'uso di guanti protettivi e una gestione attenta.
- Inserire un filtro 100 micron cella sulla cima di una provetta sterile da 50 ml. Versare con cautela l'aspirato midollare attraverso il filtro delle cellule, inclinando il filtro o spostamento in materiale coagulo. Utilizzare un puntale sterile permigliore flusso attraverso le maglie del filtro.
NOTA: Evitare qualsiasi diluizione del coagulo, ad esempio, lavando il coagulo con PBS. Urokinase agisce indirettamente e richiede componenti del siero (es., Del plasminogeno) dalla biopsia per un'efficace digest. Continuando la procedura con il materiale del coagulo, il filtrato può essere conservato a temperatura ambiente fino a nuovo uso nel passo 3.6. - Trasferire il materiale coagulo midollo osseo in un piatto di coltura cellulare vuota con pinza sterile. Tagliare i detriti in piccoli pezzi di circa 2 mm 3 utilizzando un bisturi sterile.
- Trasferire i piccoli pezzi di coagulo in una provetta da 50 ml utilizzando le pinze sterili. Assicurarsi che il coagulo tritato ha un aspetto bagnato. Se sembra essere asciutto, utilizzare alcune delle filtrato dal punto 3.1 per inumidire.
- Triturare il coagulo pipettando su e giù per 5 volte con un 5 ml microtitolo pipetta. Aggiungere 1 aliquota urochinasi al campione. Incubare per 30 minuti a 37 ° C sia a bagnomaria o inun scuotimento (leggermente) incubatore.
- Triturare pipettando su e giù per 5 volte con una pipetta 5 ml. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza. Incubare per altri 30 min a 37 ° C. Dopo l'incubazione, triturare ancora 5 volte con un 5 ml pipetta. Passare su una nuova 100 micron filtro cella di mettere in comune con il filtrato dal punto 3.2.
- Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in media come descritto di seguito o secondo la procedura standard di laboratorio per la cultura espansione MSC.
4. Semina per la Cultura di espansione cellulare e Piastre CFU
- Risospendere le cellule (comprensivi di eritrociti e cellule mononucleari) in 50 ml di terreno di base: Alpha-MEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 2,5 mg / ml di amfotericina B . Contare le cellule 01:10 diluito in soluzione Trypan Blue con un chambe Neubauerr.
- Piastra le cellule in fiasche di coltura cellulare alla densità di 5 x 10 7 cellule / cm 2 e incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C. Se disponibile, utilizzare ipossiche (5% di ossigeno) condizioni. Per il controllo del test CFU, piatto 10 9 cellule in un piatto di coltura cellulare di 10 cm di diametro.
- Dopo 3 giorni di coltura, le cellule staminali mesenchimali sono fissate al piatto di coltura cellulare, mentre altre cellule rimangono in sospensione. Cambiare la media con terreno base integrato con 5 ng / ml di base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Per il controllo del test CFU, trattare il piatto di coltura cellulare allo stesso modo.
- Continuare coltura cellulare per un totale di 2 settimane, scambiando supporti tre volte alla settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, raggruppati per tripsinizzazione. Per il controllo del dosaggio CFU, scambiare media similmente, ma non dividere le celle per il corso di due settimane.
5. Giemsa per Assay CFU
- Preparare 10 ml di Giemsa soluzione per ogni piatto: dilute soluzione di riserva (7,6 g / l Giemsa in glicerolo: metanolo) 1:10 in acqua sterile (preparare sempre una diluizione di lavoro fresco).
- Rimuovere il supporto dal piatto di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS. Essere molto precautious quando si applica il liquido alla capsula di Petri e di evitare lavare via le cellule.
- Fissare cellule in metanolo puro per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il metanolo. Aggiungere la Giemsa soluzione e incubare per 60 minuti in un incubatore umidificato a 37 ° C.
- Lavare due volte con PBS. Far asciugare il capo piastra prima su un tovagliolo di carta. Contare le colonie manualmente. Ciò si ottiene con un pennarello sul retro della piastra.
6. MSC Differenziazione
- MSC Canine differenziazione
NOTA: MSC Canine sono state differenziate in condrogenica, osteogenico e lignaggi adipogenico dalla stimolazione con il supporto appropriato per quattro settimane. - Per Differenziazione adipogenico, MSC cultura in monostrato a 4 x 10 5 cells / cm 2 alternando due diverse condizioni di coltura come segue;
- Culture in mezzi di manutenzione adipogenesi contenente DMEM + Glutamax, 3% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B e insulina 170 mM.
- Cultura in adipogenesi mezzi indurre con terreno di mantenimento integrato con il 3% FBS, siero di coniglio 5%, 1 micron desametasone, a 500 micron 3 Isobutyl-1-metilxantina, 33 micron biotina, 5 micron rosiglitazone e 17 micron pantotenato 16.
- Revel le goccioline lipidiche dalla colorazione con Oil Red-O. In breve, riparare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchiare con il 0,35% di olio O rosso in isopropanolo.
- Per la cultura differenziazione osteogenica MSC in monostrato a 7 x 10 3 cellule / cm 2 e stimolare il seguente:
- Avanzata DMEM (GIBCO) + Glutamax, 5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B, 501; M di acido L-ascorbico 2-fosfato 10 mM ß-glicerofosfato e 100 nM desametasone.
- Identificare i depositi di mineralizzazione di macchia Von Kossa (5% AgNO 3). In breve, fissare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchia con 5% AgNO 3 in acqua distillata.
- Differenziazione condrogeniche
- Cubi Cut (3 mm per lato) da un dispositivo medico a forma di spugna, costituite da liofilizzato collagene di tipo I, e utilizzati come materiale scaffold per sostenere le cellule 17.
- MSC seme sulla sommità dei cubetti alla concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml (~ 70.000 cellule / cubo).
- Prima dell'aggiunta di supporto, permettono alle cellule di aderire ai cubi per 30 min.
- Mantenere costrutti MSC-collagene nei media condrogenica comprensivi di DMEM / F12 + Glutamax, 2,5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 mg / ml di amfotericina B, 40 ng / desametasone ml, 50 mg / ml ascorbico acido 2-fosfato,50 mg / ml L-prolina, 1x Insulin-transferrina-Selenio X, e 10 ng / ml fattore di crescita trasformante-β1.
- Utilizzare Alcian colorazione blu di visualizzare l'accumulo di proteoglicani in costrutti sezioni. In breve, macchiare sezioni O / N con 0,4% blu Alcian sciolta in 0,01% H 2 SO 4 e 0,5 M guanidina cloridrato. Avanti, lavare le sezioni sono state lavate per 30 minuti nel 40% DMSO e 0,05M MgCl 2. Le cellule sono state di contrasto con rosso veloce nucleare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fatti che il 74% dei campioni di midollo osseo canino (n = 54) conteneva coaguli quando sono arrivati nel nostro laboratorio (Figura 1A) insieme con diminuzione dei rendimenti MSC da questi campioni, ci ha fatto credere che un numero considerevole di MSC era intrappolato all'interno dei coaguli . Infatti, un semplice DAPI-macchia di materiale coagulo sezionata conferma la presenza di cellule nucleate in alta densità (Figura 1B). Questo conduce infine a un basso numero di cellule staminali mesenchimali disponibili per la cultura di espansione, che ci hanno scatenato per sviluppare il protocollo utilizzando urokinase. Grumi genere scompaiono quasi del tutto quando si applica il nostro protocollo. Tuttavia, durante lo sviluppo del metodo abbiamo affrontato la questione di coagulo digerire sistematicamente tramite pesatura prima e dopo il digest. Questi esperimenti hanno rivelato che i resti non digeriti erano 15% (cane) o 9% (umano) del peso iniziale del coagulo (Figura 2A).
Una caratteristica tipica di midollo osseo derivate MSC è unbilità di aderire ai piatti di coltura cellulare. I ricercatori fanno uso di questa caratteristica per selezionare per la MSC. Di conseguenza, una colonia formando test consente di valutare la qualità del pool di cellule in un modo semplice, quantitativa ed affidabile. Nel nostro laboratorio, l'analisi formando colonie qui descritto è stato applicato di routine per tutti i campioni di midollo osseo trattati (anche quelli non coagulato). Questo ci ha permesso di utilizzare il test come criterio principale per determinare l'efficacia della urokinase digest. Per consentire il confronto diretto, le cellule dai filtrati campione coagulato (cioè come se campioni coagulati erano appena filtrati ma non trattati enzimatica) e digeriti coaguli sono state seminate su separati 10 piatti cm seguita da incubazione per due settimane. Quando visualizzazione unità formanti colonie (CFU) con Giemsa (come mostrato nella Figura 2B), abbiamo osservato 3,8 volte più CFU dalle reazioni urochinasi di campioni canini che dai corrispondenti filtrati iniziali (Figura 2C). Although meno prominente, campioni umani hanno seguito un andamento simile, con 1.6 volte più CFU da campioni trattati, confermando l'adeguatezza del protocollo. Infatti, le piastre di coagulo digerito illustrati nella riga destra della Figura 2B corrispondono al risultato tipica vista per un campione composito. Tuttavia, la variazione donatore può facilmente portare a numeri CFU da metà al doppio di quello che è raffigurato.
Prendendo la colonia-formato come indicatore della qualità pool di cellule, più media (2-5 mm) e grandi (> 5 mm) colonie apparse sulle piastre seminate di grumi rispetto CFU da filtrati (Figura 2C). Questo indica generalmente che le MSC crescono normalmente dopo il trattamento urokinase. Anche nel complesso, il confronto di esemplari canini digeriti (n = 21) per campioni senza coagulo (n = 7) dato numeri paragonabili di MSC totali per campioni trattati, anche se una grande variabilità inter-campione è stato osservato a causa della popolazione dei donatori eterogenea (Figura2D).
Come ultimo test funzionale di idoneità, abbiamo indotto la differenziazione di cellule staminali mesenchimali derivate da campioni di midollo osseo digeriti. Applicazioni in terapie con cellule staminali autologhe sono basate su MSC differenziazione in cartilagine, osso o tessuto adiposo o MSC paracrine segnalazione 18. Le celle possono essere guidati verso il percorso desiderato di differenziazione scegliendo le condizioni di coltura appropriate per la differenziazione adipogenico 19, differenziazione osteogenico 20 o stirpe condrogenica 17. Quindi, abbiamo confrontato MSC da midollo osseo coagulo di cellule staminali mesenchimali derivate dal coagulato campione di midollo osseo. Dopo quattro settimane in coltura, è stato possibile differenziare MSC in tutte e tre le linee suddette. Questo è stato istologicamente provata con Von Kossa (per linea osteogenica), Oil Red O (adipogenico) e Alcian blu (condrogeniche) colorazioni, che mostrano differenze nel grado di differenziazione tra i gruppi ( 
Figura 1. Bone coaguli osseo. Percentuale di campioni canini e del midollo osseo umano in stato parzialmente coagulato all'arrivo (A). Inoltre, abbiamo scoperto che i rendimenti MSC da campioni coagulati sono stati fortemente ridotti a causa di un elevato numero di cellule intrappolate all'interno dei coaguli. Un elevato numero di cellule nucleate sono presenti all'interno dei coaguli come dimostrano DAPI-colorazione di un cryosection da un midollo osseo coagulo canino (B). Bar Scala rappresenta 200 micron. 
Figura 2. Isolamento di cellule staminali mesenchimali da coaguli di midollo osseo digerito con urokinase. (A) In genere, la formazione di coaguli di midollo osseo scompaiono quasi completamente su urokinase digest.Dopo lo sviluppo del metodo, abbiamo valutato pesi coagulo per canino (n = 5, media ± SD, ** p ≤0.01) e campioni umani (n = 3, media ± SD, ns = non significativo p = 0,10), che sono stati fortemente ridotti su urokinase digest. (B) Un semplice saggio CFU può servire come strumento informativo per valutare la qualità di un preparato MSC. Per valutare l'efficacia del digest, il saggio CFU è stata effettuata per filtrati e coaguli digeriti da aspirati midollari separatamente. Dopo due settimane di cultura, 10 placche di comando cm sono state colorate con GIEMSA e CFU sono stati contati. Il test ha confermato che elevato numero di CFU può essere rilasciato dal coagulo per urochinasi digerire e rimanere funzionali. Ciò è confermato anche dalla elevata frequenza di grandi colonie (classe-divisione:.> 5 mm di nero, 2-5 mm in grigio scuro e <2 mm in grigio chiaro barre di errore rappresentano SD del totale CFU (n = 5 per il cane , n = 3 per l'essere umano, ** p ≤0.01, ns = non significativo, p = 0,17). (C) Pictures dalle piastre Giemsa-macchiati confermare i risultati mostrati. Le piastre mostrati per coagulo digerito corrispondono a un tipico risultato per un campione di midollo osseo digerito - tuttavia, i numeri possono variare ampiamente a causa della variabilità del donatore. (D) In somma, applicando il urokinase digerire protocollo (n = 21) si traduce in rendimenti comparabili totale MSC dopo coltura espansione naturale coagulo campioni gratuiti (n = 7, media ± SD). L'analisi statistica per l'intera figura 2 è stato eseguito utilizzando di Student t-test. 
Figura 3. Confronto di potenziale di differenziazione di digerito contro campioni nativamente coagulato. MSC Canine isolate dal midollo osseo coagulato trattati con Urokinase (riga in alto) e del midollo osseo non coagulato (fila in basso) sono stati differenziati in fenotipo osteogenico e macchiato da Von Kossa (bar =200 micron), fenotipo adipogenico era macchiato da Oil Red O (bar = 100 micron, negli inserti grandi ingrandimento di vacuoli di grasso), mentre condrogenesi è stato rivelato da Alcian colorazione blu (bar = 100 micron; controcolorazione rosso veloce nucleare). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati in laboratorio per l'elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni coagulati sarebbe un intervento supplementare separata che richiede ancora anestesia locale o generale 6. Ciò richiede la volontà sia del personale clinico e il donatore di contribuire e consuma molte risorse 21.
Qui forniamo un protocollo che utilizza urokinase umana ricombinante su campioni di midollo osseo coagulato per isolare MSC multipotenti. Potremmo dimostrare che il trattamento urokinase non danneggia le cellule e il potenziale di differenziazione viene mantenuta. Il protocolloè breve poiché prolunga campione di trasformazione solo di circa 1 ½ ora rispetto ai campioni non coagulato senza sensibili piscine cellulari comparabili. Fino ad oggi, questo protocollo è stato applicato con successo a coaguli di midollo osseo da individui e diversi cani utilizzando urokinase da più lotti e ha dimostrato il successo solido e riproducibile. Oltre a questo, urochinasi agisce indirettamente tramite attivazione del plasminogeno campione intrinseca. Ciò implica che la reazione urochinasi richiede plasma-ambiente. È quindi sconsigliabile introdurre passi di coagulo di risciacquo o simili con ad esempio, PBS. Ciò diluire l'ambiente siero e portare ad una significativa rallentamento della reazione enzimatica.
La decisione di utilizzare urokinase per il nostro metodo e non un altro farmaco trombolitico era banale: abbiamo sviluppato il protocollo basato sul farmaco trombolitico prontamente disponibile nella nostra farmacia ospedaliera. Per gli altri gruppi di ricerca che può quindi essere più semplice utilizzare un tessuto-tipe del plasminogeno (es., un farmaco diverso, come alteplase, reteplase o tenecteplase) se urokinase non è disponibile. Tuttavia, esistono potenzialmente importanti differenze tra le droghe: a differenza dei tessuti di tipo attivatori del plasminogeno, urokinase può innescare l'attivazione e la proliferazione cellulare quando si lega al urokinase tipo recettore attivatore del plasminogeno (uPAR) 22. Su vincolante, cascate di segnalazione intracellulare vengono attivati che portano alla migrazione e la proliferazione cellulare. In una situazione fisiologica ciò è ulteriormente supportata dalla secrezione di metalloproteinasi di matrice da cellule attivate. Tuttavia, nel nostro sistema, urochinasi viene diluito e gradualmente rimosso sulla cultura di espansione senza mostrare effetti dannosi. Ancora, per quanto riguarda l'uso previsto di MSC isolate, l'idoneità di qualsiasi dei farmaci trombolitici deve essere determinata singolarmente.
In generale, alti dosaggi per una rapida e completa coagulo digest sono raccomandati a minimize selezione indesiderati durante la lavorazione del coagulo. Notevoli, molti studi precedenti utilizzati streptokinase batterica per digerire sangue e midollo osseo coaguli 13,14. Tuttavia, questo farmaco può provocare l'attivazione e la risposta del sistema immunitario, che può essere un grave inconveniente soprattutto quando l'applicazione di celle a pazienti è destinato indesiderato.
Riteniamo pertanto che il nostro protocollo non solo aiuta ricercatori e professionisti medici per risparmiare tempo e ridurre i costi. Utilizzando urokinase - un farmaco enzimatica approvata senza antigenicità nota - può anche fornire uno strumento prezioso per molti laboratori di ricerca traslazionale per un uso terapeutico di preparati MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
