Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent un rôle majeur dans la médecine régénérative et de l'ingénierie tissulaire. Ils peuvent migrer, se différencier en différents types de cellules et une greffer, ce qui les rend idéales pour les candidats thérapies autologues 2,3. Dernièrement, des essais cliniques utilisant MSC pour les os et la réparation du cartilage, maladie du greffon contre l'hôte ou une maladie cardiaque ont été lancés 4. Ces cellules souches mésenchymateuses peuvent être récoltées à partir du tissu du cordon ombilical ou adipeux, mais les résultats les plus prometteurs ont été obtenus à partir de la moelle osseuse les cellules souches dérivées 5.
La crête iliaque permet de recueillir une quantité considérable de la moelle osseuse et sert donc de site principal d'aspiration 6. Cependant, la qualité de l'aspiration diminue avec l'augmentation du volume de la moelle osseuse retirée. Alors que les cinq premiers ml de ponction de la moelle osseuse contiennent MSC de haute qualité, le retrait de volumes plus importants conduit à une dilution de l'aspiration avec sang périphérique fepuis l'os très vascularisé 7. En raison de la présente des mégacaryocytes et des plaquettes, des aspirats de moelle osseuse sont sujettes à la coagulation, à moins que les anticoagulants sont utilisés. Mais même avec des anticoagulants, des caillots peuvent se produire.
Dans la moelle osseuse, cellules souches mésenchymateuses ne représentent qu'une faible proportion de la piscine total de cellules 8 et doivent être multipliées en culture pour la plupart ingénierie tissulaire ou quatre applications thérapeutiques. La qualité d'une telle culture dépend largement de la piscine de la cellule initiale, ce est à dire., La diversité et une grande départ numéro 9. De faibles effectifs d'MSC de retraits peuvent se expliquer en partie par la variabilité des bailleurs de fonds. D'autre part, les CSM à partir d'échantillons de faible qualité nécessitent plus de temps dans la culture et repiquage prolongé pour atteindre le nombre souhaité de cellules. Dans les deux cas, des passages est une source étendue de la sénescence cellulaire et peut conduire à la perte de potentiel de 10 différenciation. Par conséquent, les protocoles qui peuvent maximiser cellulaire y optimiséield et prévenir des effets néfastes doivent être développés 11,12.
Lorsque nous avons commencé à travailler avec MSC canines, nous avons été étonnés de voir que les échantillons de moelle osseuse canines environ trois sur quatre contenaient des caillots, tandis que les échantillons humains heureusement coagulé (un sur dix) ont été moins fréquentes. D'autre part, il ne est pas surprenant, que nous avons observé des rendements beaucoup plus faibles de MSC à partir d'échantillons coagulés. Pour résoudre le problème récurrent des échantillons coagulés, nous avons développé le protocole utilisant l'urokinase de drogue thrombolytique lieu de rééchantillonnage.
Thérapies thrombolytiques peuvent contrecarrer les situations de la vie en danger, comme l'occlusion des vaisseaux sanguins provoquant une crise cardiaque, accident vasculaire cérébral ou embolie raison de coagulation non désirée. Ils fonctionnent par la dégradation des caillots par clivage enzymatique par la plasmine de la fibrine et du plasminogène activateurs enzymatiques. Malgré la large utilisation pour le traitement des patients, que très peu de publications existent que les activités thrombolytiques utiliséspour les applications de laboratoire pour sauver échantillons coagulés, en se concentrant principalement sur les lymphocytes. En 1987, Niku et al. décrit l'utilisation de streptokinase pour dissoudre les caillots sanguins dans les lymphocytes fonctionnels résultant 13 et quatre ans plus tard, De Vis et al. étendu l'utilisation de la streptokinase pour isoler les cellules leucémiques dans le sang et la moelle osseuse pour des applications de cytométrie en flux 14. Une publication plus récente suggère l'utilisation de Alteplase pour le diagnostic de cancer 15. Tout en utilisant la même approche enzymatique, notre protocole met l'accent sur l'isolement des cellules souches mésenchymateuses multipotentes forme la moelle osseuse de fournir un outil pour les chercheurs dans le domaine des cellules souches.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: ponctions de moelle osseuse humaines de la crête iliaque ont été recueillies de consentir donateurs avec l'approbation du comité d'éthique du canton de Lucerne. Aspirats de moelle osseuse Canine de la crête iliaque ont été recueillies avec consent.Human de propriétaire de chien (env. 20 ml) et canin (env. 10 ml) aspirats de moelle osseuse étaient anti-coagulé par addition de 15 ml de citrate de sodium à 3,8% immédiatement après le retrait dans la salle d'opération. Les échantillons ont été transférés à l'environnement du laboratoire de traitement du même jour comme retirée.
1. Préparation de Urokinase (Avant le 1 er Utilisations)
- Reconstituer l'urokinase en utilisant une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) selon les instructions du fabricant: Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon de septum d'entrée en utilisant une seringue de 10 ml. Dissoudre la substance sèche en agitant pour obtenir 50 000 unités d'injection (U) par ml.
- Préparer des aliquots de 500 ul (25,000) dans chaque U sterile tubes. aliquotes de magasins -20 ° C et l'utiliser en cas de besoin pendant au moins six mois.
2. préparatives étapes (Avant chaque os traitement moelle)
- Décongeler une aliquote de l'urokinase (25.000 U) coagulé par aspiration de moelle osseuse (volumes aspirés jusqu'à 25 ml ont été traités avec succès en utilisant une seule portion aliquote de 25 000 U).
- Préchauffer un bain d'eau ou incubateur agitateur à 37 ° C.
3. digestion enzymatique du Clot
- Effectuer tous les travaux dans un biosécurité de flux laminaire armoire pour éviter la contamination microbienne des échantillons de moelle osseuse au cours du traitement. Lorsque vous travaillez avec des matières potentiellement infectieuses humaine, l'utilisation de gants de protection ainsi que manipulation prudente est conseillée.
- Placer un tamis de 100 um de la cellule au-dessus d'un tube de 50 ml stérile. Versez délicatement la ponction de moelle osseuse à travers le tamis de la cellule, en inclinant la crépine ou déplacer le matériel d'un caillot. Utiliser un embout de pipette stérile pourune meilleure circulation à travers les mailles du filtre.
REMARQUE: éviter toute dilution du caillot, par exemple, en lavant le caillot avec du PBS. Urokinase agit indirectement et nécessite des composants du sérum (ie., Plasminogène) de la biopsie pour condensé efficace. Tout en continuant l'opération avec le matériau de caillot, le filtrat peut être conservé à température ambiante jusqu'à utilisation ultérieure dans l'étape 3.6. - Transférer le matériel de caillots de moelle osseuse dans une boîte de culture de cellule vide aide de pinces stériles. Couper les débris en petits morceaux d'environ 2 mm 3 à l'aide d'un scalpel stérile.
- Transférer les petits morceaux de caillot dans un tube à réaction de 50 ml à l'aide des pinces stériles. Veiller à ce que le caillot hachée a un aspect mouillé. Se il semble être sec, utiliser une partie du filtrat de l'étape 3.1 pour humidifier.
- Triturer le caillot par aspiration et pendant 5 fois en utilisant 5 ml microtitrage pipette. Ajouter une fraction aliquote de l'échantillon d'urokinase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C soit dans un bain d'eau ou dansune agitation (doucement) incubateur.
- Triturer par pipetage de haut en bas pour les cinq fois à l'aide d'une pipette 5 ml. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique. Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. Après l'incubation, triturer encore 5 fois à l'aide d'une pipette de 5 ml. Passez votre souris sur un nouveau 100 um tamis cellulaire de mettre en commun avec le filtrat de l'étape 3.2.
- Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante pendant 10 min à 500 x g. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu tel que décrit ci-dessous ou selon le mode opératoire standard de votre laboratoire pour la culture d'extension MSC.
4. Le classement pour Expansion Culture cellulaire et UFC Plaques
- Remettre en suspension les cellules (comprenant des érythrocytes et des cellules mononucléées) dans 50 ml de milieu de base: Alpha-MEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2,5 mg / ml d'amphotéricine B . Compter les cellules 01h10 dilué dans une solution bleu Trypan utilisant une chambe Neubauerr.
- Plaque les cellules dans des flacons de culture de cellules à une densité de 5 x 10 7 cellules / cm 2 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C. Si possible, utilisez hypoxiques (5% d'oxygène). Pour le contrôle de dosage CFU, plaque 10 9 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre.
- Après 3 jours de culture, les cellules souches mésenchymateuses sont attachés à la boîte de culture de cellules alors que les autres cellules restent en suspension. Changer les médias avec le milieu de base supplémenté avec 5 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF). Pour le contrôle de dosage CFU, traiter la boîte de culture cellulaire de même.
- Continuer culture cellulaire pour un total de deux semaines, l'échange de médias trois fois par semaine. Si les cellules dépassent 80% de confluence, diviser par trypsinisation. Pour le contrôle de dosage CFU, échanger les médias de même, mais ne pas diviser les cellules pour le cours des deux semaines.
5. Giemsa pour le dosage CFU
- Préparer 10 ml de solution par Giemsa-plat: dilute la solution mère (7,6 g / l dans le glycérol Giemsa: méthanol) 1h10 dans l'eau stérile (toujours préparer une dilution de travail frais).
- Retirez le support de la boîte de culture cellulaire et laver les cellules avec du PBS. Soyez très précautionneux lors de l'application liquide à la boîte de Pétri et éviter de laver hors des cellules.
- Fixer les cellules dans du méthanol pur pendant 5 min à température ambiante. Jeter le méthanol. Ajouter la solution Giemsa et incuber pendant 60 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C.
- Laver deux fois avec du PBS. Air sécher la tête de la première plaque sur une serviette en papier. Compter les colonies manuellement. Ceci se fait à l'aide d'un marqueur sur le dos de la plaque.
6. MSC Différenciation
- La différenciation des cellules souches mésenchymateuses Canine
REMARQUE: MSC Canine ont été différenciées en chondrogène, ostéogénique et lignées adipogéniques par stimulation avec le support approprié pour quatre semaines. - Pour La différenciation adipocytaire, MSC de culture en monocouche à 4 x 10 5 CELLS / cm 2 en alternance deux conditions de culture différentes de la manière suivante;
- Culture dans un milieu d'entretien contenant de l'adipogenèse DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B et 170 mM d'insuline.
- Culture dans l'adipogenèse médias induire avec du milieu de maintenance additionné de 3% de FBS, sérum de lapin à 5%, 1 uM de dexaméthasone, 500 uM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 33 uM de biotine, 5 uM et 17 uM de rosiglitazone 16 pantothenate.
- Revel les gouttelettes lipidiques par coloration avec Oil Red-O. En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tacher avec O rouge 0,35% d'huile dans de l'isopropanol.
- Pour la culture de la différenciation ostéogénique MSC en monocouche à 7 x 10 3 cellules / cm 2 et de stimuler dans ce qui suit:
- Avancée DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B, 501; M d'acide L-ascorbique-2-phosphate, 10 mM de ß-glycerophosphate et 100 nM de dexaméthasone.
- Identifier les dépôts de minéralisation de Von Kossa tache (5% AgNO 3). En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tache avec 5% AgNO 3 dans l'eau distillée.
- Différenciation chondrogénique
- cubes coupées (3 mm de chaque côté) à partir d'un dispositif médical en forme d'éponge, constituées à partir lyophilisée de collagène de type I, et utilisés comme matériau d'échafaudage pour soutenir 17 cellules.
- MSC de semences sur le dessus des cubes à la concentration de 4 x 10 6 cellules / ml (~ 70 000 cellules / cube).
- Avant l'addition de médias, permettent aux cellules d'adhérer aux cubes pendant 30 min.
- Maintenir constructions MSC-collagène dans des milieux chondrogénique constitué de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B, 40 ng / dexaméthasone ml, 50 pg / ascorbique ml acide 2-phosphate,50 ug / ml de L-proline, 1x insuline-transferrine-sélénium X, et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant-β1.
- Utilisez coloration au bleu alcian pour visualiser l'accumulation des protéoglycanes dans les sections de constructions. Brièvement, tacher les sections O / N avec 0,4% de bleu alcian dissous dans 0,01% de H 2 SO 4 et 0,5 M de chlorhydrate de guanidine. Ensuite, laver les coupes ont été lavées pendant 30 min dans 40% de DMSO et 0,05 M MgCl 2. Les cellules ont été contre-rouge nucléaire rapide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les faits que 74% des échantillons de moelle osseuse canins (n = 54) contenait des caillots quand ils sont arrivés dans notre laboratoire (figure 1A) ainsi diminué les rendements de MSC partir de ces échantillons, nous a fait croire qu'un nombre considérable de MSC a été piégé dans les caillots . En effet, une simple DAPI-taches de matériau de caillot coupe confirme la présence de cellules nucléées à haute densité (figure 1B). Cela conduit finalement à un faible nombre de cellules souches mésenchymateuses disponibles pour la culture d'expansion, qui nous ont déclenché de développer le protocole utilisant urokinase. Typiquement caillots disparaître presque complètement lors de l'application de notre protocole. Cependant, au cours du développement de la méthode, nous avons abordé la question de caillot digérer systématiquement par pesée avant et après digestion. Ces expériences ont révélé que les restes non digérés étaient de 15% (chien) ou 9% (humaine) du poids du caillot initial (figure 2A).
Une caractéristique typique de la moelle osseuse provenant MSC est l'unbilité d'adhérer à des boîtes de culture cellulaire. Les chercheurs font usage de cette caractéristique pour sélectionner des CSP. Par conséquent, un essai de formation de colonie permet d'évaluer la qualité du pool de cellules d'une manière simple, fiable et quantitative. Dans notre laboratoire, l'essai de formation de colonies décrit ici a été appliquée systématiquement à tous les échantillons de moelle osseuse transformés (aussi ceux non coagulé). Cela nous a permis d'utiliser le dosage comme critère principal pour déterminer l'efficacité de l'urokinase digest. Pour permettre une comparaison directe, les cellules de filtrats d'échantillon coagulé (ce est à dire que si les échantillons ont été coagulé simplement filtrés mais pas traités par voie enzymatique) et digérés caillots ont été ensemencées sur différents boîtes de 10 cm, suivie par une incubation de deux semaines. Lorsque la visualisation unités formant des colonies (CFU) avec Giemsa (comme représenté sur la figure 2B), nous avons observé 3,8 fois plus CFU urokinase à partir des réactions d'échantillons canins que des filtrats initiaux correspondants (Figure 2C). Although moins important, des échantillons humains ont suivi une tendance similaire avec 1,6 fois plus CFU à partir d'échantillons traités, confirmant la pertinence du protocole. En effet, les plaques de caillot digéré illustrés dans la bonne ligne dans la figure 2B correspondent au résultat typique vu pour un échantillon groupé. Cependant, la variation des bailleurs de fonds peut facilement se traduire en nombre UFC de la moitié au double de ce qui est représenté.
Prenant la colonie de taille comme indicateur de la qualité du pool de cellules, plus moyen (2-5 mm) et de grande taille (> 5 mm) colonies sont apparues sur les plaques ensemencées de caillots par rapport à l'UFC de filtrats (figure 2C). Ceci indique généralement que les CSM croissent normalement après traitement urokinase. Aussi, dans l'ensemble, la comparaison des spécimens canins digérés (n = 21) à des échantillons sans caillot (n = 7) a donné un nombre comparable de MSC total des échantillons traités, même si une grande variation inter-échantillon a été observée en raison de la population de donneurs hétérogène (Figure2D).
Comme dernier test d'aptitude fonctionnelle, nous avons induit la différenciation des cellules souches mésenchymateuses dérivées des échantillons de moelle osseuse digérés. Applications dans les thérapies de cellules souches autologues sont basées sur la différenciation MSC dans le cartilage, les os ou le tissu adipeux ou de signalisation MSC 18 paracrine. Les cellules peuvent être orientés vers la trajectoire souhaitée de la différenciation par le choix des conditions de culture appropriées pour la différenciation adipogène 19, différenciation ostéogénique 20 ou 17 lignée chondrogénique. Par conséquent, nous avons comparé les MSC de caillot de moelle osseuse de cellules souches mésenchymateuses dérivées de l'échantillon de moelle osseuse non coagulé. Après quatre semaines de culture, il est possible de différencier les MSC dans les trois lignées mentionnés ci-dessus. Ceci a été testé avec histologiquement Von Kossa (par lignée ostéogénique), Oil Red O (adipogénique) et bleu alcian (chondrogéniques) colorations, montrant aucune différence dans le degré de différenciation entre les groupes ( 
Figure 1. caillots de moelle osseuse. Pourcentage d'échantillons de canines et de moelle osseuse humaine en état partiellement coagulé à l'arrivée (A). En outre, nous avons constaté que les rendements de MSC échantillons coagulés ont été fortement réduites en raison d'un nombre élevé de cellules piégées dans les caillots. Un nombre élevé de cellules nucléées sont présents dans les caillots tel que démontré par coloration DAPI-cryosection d'un d'un caillot de moelle osseuse canine (B). La barre d'échelle représente 200 um. 
Figure 2. Isolement des cellules souches mésenchymateuses de caillots de moelle osseuse digéré par urokinase. (A) En règle générale, les caillots de moelle osseuse disparaissent presque complètement sur urokinase digest.Lors du développement de la méthode, nous avons évalué le poids de caillot pour chien (n = 5, moyenne ± SD, ** p ≤0.01) et des échantillons humains (n = 3, moyenne ± SD, ns = non significative p = 0,10) qui ont été fortement réduits après urokinase digest. (B) Un dosage CFU simple peut servir d'outil d'information pour évaluer la qualité d'une préparation de MSC. Pour évaluer l'efficacité de la digestion, le dosage CFU a été réalisée pour filtrats et des caillots digérés d'aspiration de la moelle osseuse séparément. Après deux semaines en culture, 10 des plaques de contrôle cm ont été colorés au Giemsa et CFU ont été comptées. L'analyse a confirmé que nombre de CFU peut être libéré du caillot par l'urokinase digérer et rester fonctionnel. Ce est également confirmée par la fréquence élevée des grandes colonies (classe-division:.> 5 mm en noir, 2-5 mm en gris foncé et <2 mm en gris clair barres d'erreur représentent SD sur un total de CFU (n = 5 pour chien , n = 3 pour l'homme, ** p ≤0.01, ns = non significatif, p = 0,17). (C) Photos à partir de plaques colorées au Giemsa confirmer les résultats présentés. Les plaques indiquées pour caillot digéré correspondent à un résultat typique d'un échantillon de moelle osseuse digéré - cependant, les nombres peuvent varier largement due à la variabilité des bailleurs de fonds. (D) Dans la somme, l'application de la urokinase digérer protocole (n = 21) des résultats des rendements de MSC totales comparables après culture d'extension naturellement caillot échantillons gratuits (n = 7, moyenne ± écart type). L'analyse statistique de l'ensemble de la figure 2 a été réalisée en utilisant le t -test de l'étudiant. 
Figure 3. Comparaison du potentiel de différenciation des digéré par rapport échantillons nativement non coagulé. De MSC Canine isolées de coagulé moelle osseuse traitée avec Urokinase (rangée du haut) et non coagulé moelle osseuse (rangée du bas) ont été différenciés dans le phénotype ostéogénique et coloré par Von Kossa (bar =200 um), phénotype adipogénique a été coloré par Oil Red O (bar = 100 um; dans les encarts plus grand grossissement de vacuoles graisseuses), tandis que la chondrogenèse a été révélé par coloration au bleu Alcian (bar = 100 um; contre-coloration rouge nucléaire rapide). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Régulièrement on échantillonne moelle osseuse tandis que le patient subit une intervention chirurgicale (dans notre cas de chirurgie principalement la colonne vertébrale), avec l'avantage que seul le travail peu supplémentaire doit être effectué par le personnel de la salle d'opération. Même si les échantillons sont mélangés avec du citrate de sodium immédiatement après le retrait, de nombreux échantillons ont été partiellement coagulé quand ils sont arrivés dans le laboratoire pour le traitement. A ce stade, le rééchantillonnage pour remplacer échantillons coagulés serait une intervention séparée supplémentaire nécessitant nouveau anesthésie locale ou générale 6. Cela exige de la volonté à la fois du personnel clinique et le donateur de contribuer et consomme beaucoup de ressources 21.
Ici, nous fournissons un protocole qui utilise l'urokinase humaine recombinante sur des échantillons de moelle osseuse coagulé pour isoler des MSC multipotentes. Nous avons pu démontrer que le traitement d'urokinase ne nuit pas aux cellules et le potentiel de différenciation est retenue. Le protocoleest court car il prolonge le traitement des échantillons seulement d'environ 1 ½ h par rapport à des échantillons non coagulé tout en donnant piscines cellulaires comparables. À ce jour, ce protocole a été appliqué avec succès sur caillots de moelle osseuse provenant de différents individus et les chiens en utilisant urokinase de plusieurs lots et a montré le succès robuste et reproductible. En dehors de cela, l'urokinase agit indirectement par l'intermédiaire de l'activation du plasminogène intrinsèque d'échantillonnage. Ceci implique que la réaction nécessite d'urokinase du plasma et l'environnement. Il est donc déconseillé d'introduire des mesures de rinçage de caillot ou similaire avec, par exemple, PBS. Cela diluer le milieu de sérum et conduire à un ralentissement significatif de la réaction enzymatique.
La décision d'utiliser urokinase pour notre méthode et non un autre médicament thrombolytique était trivial: nous avons développé le protocole basé sur le médicament thrombolytique facilement disponibles dans notre pharmacie de l'hôpital. Pour les autres groupes de recherche, il peut donc être plus facile d'utiliser un mouchoir-type activateur du plasminogène (ie., un médicament différent, comme l'altéplase, retéplase ou tenecteplase) si urokinase ne est pas disponible. Cependant, des différences potentiellement importantes entre les médicaments existent: la différence des activateurs de plasminogène de type tissulaire, l'urokinase peut déclencher l'activation des lymphocytes et la prolifération lorsqu'il est lié au récepteur de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPAR) 22. Lors de la liaison, cascades de signalisation intracellulaires sont activés qui conduisent à la migration et la prolifération cellulaire. Dans une situation physiologique ce est en outre étayée par la sécrétion de métalloprotéases de la matrice par les cellules activées. Cependant, dans notre système, urokinase est dilué et progressivement supprimé sur la culture d'expansion sans montrer des effets néfastes. Cependant, en ce qui concerne l'utilisation prévue de MSC isolées, l'aptitude de l'un des médicaments thrombolytiques doit être déterminé individuellement.
Généralement, des doses élevées pour caillot rapide et complète digestion sont recommandés pour Minimize sélection indésirables pendant le traitement d'un caillot. , De nombreuses études antérieures remarquables utilisés streptokinase bactérien pour digérer sang et de moelle osseuse caillots 13,14. Cependant, ce médicament peut provoquer une activation indésirable et la réponse du système immunitaire, qui peut être un inconvénient majeur, en particulier lorsque l'application de cellules de patients est destiné.
Nous pensons donc que notre protocole ne aide pas seulement les chercheurs et les professionnels de la santé pour gagner du temps et réduire les coûts. Utilisation urokinase - un médicament enzymatique approuvé sans antigénicité connu - peut même fournir un outil précieux pour de nombreux laboratoires de recherche translationnelle visant à une utilisation thérapeutique des préparations de MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
