Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Die Proteinsynthese ist ein fundamentaler Prozess, um die Genexpression beeinflussen vielfältigen biologischen Prozesse, insbesondere die Anpassung an Umweltbedingungen. Die Initiierungsschritt, der den Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten auf der mRNA-Initiationscodon beteiligten Initiationsfaktor einschließlich eIF4G1 beinhaltet. Defekte in diesem geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Translation an verschiedenen Erkrankungen verbunden. Um die möglichen Folgen eines solchen Deregulierungen studieren, Oozyten von Xenopus laevis bilden ein attraktives Modell mit hohem Grad von der Erhaltung der wesentlichen zellulären und molekularen Mechanismen mit menschlichen. Darüber hinaus soll während meiotischen Reifung Oozyten transkriptionell unterdrückt und alle notwendigen Proteine aus bereits vorhandenen, maternalen mRNAs umgerechnet. Dieses preisgünstige Modell ermöglicht exogene mRNA, um perfekt mit einem effektiven Übersetzungs integriert werden. Hier ist ein Protokoll für die Bewertung der Übersetzung mit einem Faktor von Interesse (hier eIF4G1) mit stor beschriebened mütterlichen mRNA, die die ersten sind, um polyadenylierte und während Oocytenreifung als physiologischer Auslese übersetzt werden. Zuerst mRNA durch in vitro-Transkription von Plasmiden von Interesse (hier eIF4G1) synthetisiert werden in Oozyten und die Kinetik der Oocytenreifung von Keimbläschen Schlagerkennung injiziert wird bestimmt. Die untersuchten mütterlichen mRNA Ziel ist die Serin / Threonin-Proteinkinase mos. Seine Polyadenylierung und die anschließende Übersetzung zusammen mit der Expression und Phosphorylierung von Proteinen des MOS-Signalkaskade in Eizellreifung Beteiligten untersucht. Variationen des derzeitigen Protokolls zu unterbreiten Translationsfehlern werden ebenfalls vorgeschlagen, um der Allgemeinheit zu betonen. Angesichts der zunehmend Hinweise, dass aberrante Proteinsynthese kann in der Pathogenese von neurologischen Erkrankungen beteiligt sein, bietet ein solches Modell die Möglichkeit, leicht zu beurteilen diese Beeinträchtigung zu erkennen und neue Ziele.
Introduction
Proteine sind wesentliche Elemente des zellulären Lebens und damit zu größeren Maßstab des Organismus. Sie sorgen für die Mehrzahl von Zellfunktionen einschließlich der Struktur, Transport, Reaktionskatalyse, Regulierung der Genexpression usw. Ihre Expression ist das Ergebnis eines komplexen Mechanismus der Übersetzung für die Konvertierung einer mRNA in Protein. Die Übersetzung wird auf verschiedene Kontrollen unterzogen, sich anzupassen und die Genexpression nach den Zell Anforderungen während der Entwicklung und Differenzierung, Alterung, physiologischen Spannungen oder pathologischen Erscheinungen regulieren.
Über Internal Ribosome Entry Segment (IRES) Strukturen und CAP-unabhängige Translation Enhancers (cap-abhängige, cap-unabhängig: Die Übersetzung wird in 3 Phasen (Initiation, Elongation und Termination) und präsentiert 3 Einleitung Übersetzungssysteme, um auf diese Bedürfnisse zu reagieren unterteilt CITE).
Meisten eukaryotischen mRNA in einer cap-depe setztenndent Weise über die 7-Methylguanosin 5'-Triphosphat Kappe, die als Erkennungsfunktion während der Proteinsynthese dient. Diese Kappe bindet an eIF4E, einer Komponente von eIF4F Komplex mit eIF4G1 und eIF4A. Mit anderen Partnern wie Poly (A) Binding Protein (PABP) verbunden sind, eIF2-GTP-Met-tRNA Met, damit diese Translationsinitiationsfaktoren, um mRNA zirkularisieren und 43S-Komplex zur Verbesserung seiner Zugänglichkeit zu Formen bis zum August Initiationscodon Anerkennung 1. Dieses Ereignis entspricht dem Ende der Translationsinitiations dh dem ersten Schritt der Übersetzung.
CAP-unabhängige Translation von mRNA-Codierung für essentiellen Proteine unter Stressbedingungen, die beispielsweise Zellproliferation und Apoptose induzieren. Dieser Mechanismus beinhaltet Sekundärstrukturen der mRNA-5'-untranslatierten Region (UTR) bezeichnet IRES, dem Carboxy-terminalen Ende mit eIF4G1 eIF4A und dem 43S-Komplex assoziiert. Die Bindung dieser 43S vorge Einleitung complexe IRES leitet die Kappe unabhängige Translation ohne eIF4E Faktor 2,3.
Schließlich ist ein weiterer Übersetzungsmechanismus noch nicht gut verstanden unterstützt diese CAP-unabhängige Translation Aktivität unter Stressbedingungen über CITE Strukturen innerhalb mRNA UTR 4 entfernt.
Durch diese verschiedenen Formen der Übersetzung, die sich um ihre Initiationsschritte spielt Übersetzung eine entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase und jede Änderung in einer dieser Prozesse würde somit beeinflussen den Organismus mit kleinen bis großen Skaleneffekten. In der Tat ist die Einleitung einer geschwindigkeitsbestimmenden Schritt über die richtigen Übersetzungsprozesse von mRNA in Proteine und damit das Ziel von zahlreichen Kontrollen und Regulierungspunkte 5. Ob es sich für die letztere oder für Komponenten dieser Prozesse, wenn man stellt sich heraus, um defekt zu sein, wird es das vorgegebene Gleichgewicht in der Zelle zu stören und so konnten pathologische bedingungen führengen. In diesem Zusammenhang haben Mutationen in Translationsfaktoren in mehreren Erkrankungen einschließlich neurodegenerativer Störungen wie `Leukoenzephalopathie mit verschwindender weißen Materie' (eIF2B1-5 Untereinheit) 6, in Walcott-Rallison Syndrom (EIF2AK3 kodierenden Gen PERK) 7, potentiell in involviert Parkinson-Krankheit (eIF4G1 p.R1205H) 8. Es ist daher wichtig, um zelluläre und molekulare Studien dieser mutierten Proteine durchzuführen, um das Wissen über die Entwicklung der Krankheit und dem allgemeinen Verfahren der Translationsinitiation zu erhöhen.
Zur Durchführung dieser Studien ist es wichtig, um die am besten geeigneten Modellen wählen, die Konsequenzen dieser Mutationen beobachten Xenopus laevis Oozyten sind besonders gut aufgrund ihrer physiologischen und biochemischen Eigenschaften angepasst:. Physiologische Synchronizität (in der Phase G2 des Zellzyklus blockiert) , hohe Kapazität der Proteinsynthese (200-400 ng / Tag / Eizelle), hohe Anzahl von extrahierten oocytes aus demselben Tier (800-1.000 Oozyten / weiblich) und der Zellgröße (1,2-1,4 mm Durchmesser), die ihre Handhabung vereinfacht. Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten synthetisierte mRNA leicht durchgeführt werden, um die Translation Schritte zu zerlegen. In dieser Ansicht zeigt es andere Vorteile. Angesichts der Geschwindigkeit der Meiose Progression und der Übersetzung nach der mRNA Mikroinjektion (~ 24 Stunden), Xenopus-Oozyten eine schnelle System im Vergleich zu rekonstituierten Zellsystemen (aus E. coli extrahiert, Weizenkeime oder Kaninchen-Retikulozyten …), in der eine mRNA ist setzten mit einer reduzierten Translationsrate und mit einer niedrigeren Geschwindigkeit. So werden die Auswirkungen einer Mutation in einer mRNA eingeführt schnell beobachtbar und einfach in verschiedenen Oozyten untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Xenopus-Oozyten, dass mütterliche mRNAs sind latent und Proteintranslation vor Progesteron Stimulation blockiert. Zugabe von Progesteron ist ein geeignetes Mittel zur Steuerung des Übersetzungs Induktion. Cytoplasmic polyadenylation nicht während der Oogenese auftreten. Es beginnt bei der Eizellreifung in Progesteron-stimulierten Eizellen in einer zeitlichen Reihenfolge und setzt sich während der frühen Entwicklung und könnte verwendet werden, um die verschiedenen Schritte der Übersetzung zu untersuchen.
Die Polyadenylierung mos mRNA ist unter den ersten, auftreten, und es gehört mit Aurora A / Eg2, histonähnlichen B4 mRNA zur Klasse der "frühen Reifung" Gene als in Charlesworth et al definiert. (2004) 9. Die Translations Induktion der "späten" mRNA wie Cyclin A1 und Cyclin B1 tritt um die Zeit der Keimbläschen Aufteilung (GVBD). MOS-mRNA kodiert für ein Serin / Threonin-Proteinkinase. Die Übersetzung ist von entscheidender Bedeutung, da sie die MAP-Kinase-Kaskade, die indirekt aktiviert die Eizellreifung induziert. Zwar in Reaktion auf Progesteron, Polyadenylierung mos-mRNA wird durch ein Verfahren mit Aurora A / Eg2 regulatorische Proteine und andere RNA-Bindungsproteine mit verbesserten the 3'UTR mos-mRNA. Diese erhöhte Polyadenylierung mos-mRNA führt zu einer Erhöhung des MOS Proteinebene, die wiederum aktiviert MEK1. Dieser Vorgang vermittelt die Aktivierung von extrazellulären signalregulierten Kinase 2 (ERK2) (Abbildung 1). Diese Signalkaskade kann dann lösen die Reifung M-Phasen-fördernde Faktoren, einen Komplex von Cyclin B und Cdc2 Kinase gebildet und schließlich zu meiotische Wiederaufnahme.
Daher in Xenopus laevis Oozyten, könnte die Untersuchung der mütterlichen mRNA wie MOS leicht verwendet werden, um ihre Translatierbarkeit mit mehreren Endpunkten ihrer effiziente Polyadenylierung der Übersetzung mehrerer MOS-Signalkomponenten, darunter auch die Bestimmung des GVBD Geschwindigkeit testen. Dieses System ist daher interessant, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren ohne Einmischung von neu transkribierten mRNA oder der Transfektionseffizienz zu bewerten, Probleme oft mit eukary vorkommendeOhrzellstudien.
Hier wird ein Protokoll eingesetzt, wo eine Mutante eIF4G1 mRNAs mikroinjiziert in Xenopus laevis Oozyten und die Übersetzung der mütterlichen mRNA getestet. In Gegenwart von einem Defekt in GVBD Progression, mos mRNA Polyadenylierung, die durch die Eizelle meiotischen Zellzyklus und für die nachfolgende Übersetzung der frühen und späten Klasse mRNAs essentiell für Progression ermittelt. Die Phosphorylierung Aurora A / Eg2 und ERK wird auch untersucht, um die Folge der mos deregulation.Thus bestätigen Xenopus-Oozyten, sind ein einfacher Weg, um verschiedene Schritte der mRNA-Translation zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Translation ist ein Mechanismus in der Pathophysiologie von zahlreichen menschlichen Erkrankungen einschließlich mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Zum Beispiel in der Parkinson-Krankheit mehrere Berichte vorgeschlagen, die Wertminderung in der Übersetzung mit erblichen Mutationen 8,12,13 verbunden.
Mehrere zelluläre Modelle stehen zur Verfügung, um die Translation zu studieren. Hier wird, um die translatorische Folgen einer Mutation in eIF4G1, die als dominan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
