Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Protein sentezi, çeşitli biyolojik süreçleri çevresel koşullara özellikle adaptasyon etkileyen gen ifadesi temel bir süreçtir. MRNA başlangıç kodonu da dahil olmak üzere ilgili eIF4G1 başlatma faktörü ribozomal alt birimlerinin düzenlenmesine içeren başlangıç aşaması. Çevirinin bu oran sınırlayıcı bir aşama kusurlar, çeşitli bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu tür özerkleştirmeler olası sonuçlarını incelemek için, Xenopus oositler insanla temel hücresel ve moleküler mekanizmaları korunması yüksek derecede çekici bir model teşkil laevis. Buna ek olarak, mayoz olgunlaşma sırasında, oosit transkripsiyonel bastırılmış ve gerekli tüm proteinleri önceden var, maternal mRNA'lardan çevrilir. Bu ucuz modeli etkin bir çeviri ile mükemmel entegre olmak için eksojen mRNA sağlar. Burada (eIF4G1 here) ilgi konusu bir faktör ile çeviri değerlendirmek stor kullanmak için bir protokol açıklananİlk olduklarını anne mRNA ed poliadenile ve fizyolojik okuma olarak oosit olgunlaşması sırasında tercüme edilecek. İlk başta, mRNA ilgi plazmidler (buradan eIF4G1) in vitro transkripsiyonu ile sentezlenmiş oluşum safhası torbacığı yarılmasının tespiti ile oosit ve oosit olgunlaşma kinetiği enjekte edilir belirlenir. Çalışılan anne mRNA hedef, serin / treonin protein kinaz mos olup. Bu poliadenilasyon ve daha sonraki için oosit olgunlaşmasında yer alan sinyalleme kaskadında mos proteinlerinin ekspresyonu ve fosforilasyon ile birlikte incelenmiştir. Geçerli protokol Varyasyonları ortaya koymak için öteleme kusurları da genel uygulanabilirliğini vurgulamak için önerilmiştir. Anormal protein sentezinin nörolojik bozuklukların patogenezinde olabilir dair kanıtlar ortaya ışığında, böyle bir model kolayca bu bozukluğunu değerlendirmek ve yeni hedefler belirlemek için bir fırsat sunuyor.
Introduction
Proteinler organizmanın daha büyük ölçekte temel hücresel yaşam elemanları ve bu nedenle bulunmaktadır. Onlar yapısı, ulaşım, reaksiyon kataliz, yönetmelik, gen ifadesi vb Onların ifade protein içine bir mRNA'nın dönüşümünü sağlayan çeviri karmaşık bir mekanizmanın sonucudur içeren hücresel fonksiyonlarının çoğunu sağlamaktadır. Için uyarlamak ve gelişme ve farklılaşma, yaşlanma, fizyolojik baskılara ya da patolojik seyri sırasında, hücre ihtiyaçlarına göre gen ifadesini düzenlemek için çeşitli kontroller tabi tutulur.
Kap-bağımlı, kap-bağımsız İç Ribozom Giriş Segment (IRES) yapıları ve kap-Bağımsız Çeviri arttırıcılar (via: Çeviri 3 başlatma çeviri sistemleri bu ihtiyaçlara cevap vermek amacıyla, 3 aşamadan (başlatma, uzama ve sonlandırma) ve hediyeler ayrılmıştır ) CITE.
Çoğu eukaryotik mRNA bir kap-Depe çevrilirProtein sentezi sırasında bir tanıma özelliği olarak hizmet vermektedir 7-methylguanosine 5'-trifosfat kapağı aracılığıyla ndent şekilde. Bu kapak eIF4E, eIF4G1 ve eIF4A ile eIF4F kompleksi bileşenine bağlanır. Poli (A) bağlayıcı protein (PABP) gibi diğer ortaklarla ilişkili elF2-GTP-Met-tRNA Met, bu çeviri başlatma faktörleri mRNA sirküler ve tanınması 1 kodon Ağustos başlatılması kadar formlara 43S kompleksi olan erişilebilirliği iyileştirmek için izin verir. Bu olay, translasyon başlatma yani, çeviri birinci etabının sonuna karşılık gelmektedir.
Cap bağımsız için, örneğin hücre çoğalmasının ve apoptozun için neden stresli koşullar altında esas proteinler için kodlayan mRNA tarafından kullanılır. Bu mekanizma, mRNA ikincil yapısını içerir 5'-çevrilmemiş bölümü (UTR) IRES adlandırılan eIF4A ve 43S kompleksi ile ilişkili eIF4G1 karboksi-terminal ucu. Bu 43S, ön başlatma c bağlanmasınınIRES için omplex eIF4E faktörü 2,3 gerek kalmadan kapak bağımsız çeviri başlatır.
MRNA UTR 4 içinde yer alan yapıların CITE aracılığıyla Nihayet, yine iyi anlaşılmış değildir başka bir çeviri mekanizması vurguladı şartlar altında bu kap-bağımsız çeviri etkinliğini destekler.
Kendi başlatma aşamalarının göre farklı tercüme bu çeşitli modları ile, çeviri, hücresel homeostazında kritik bir rol ve böylece büyük ölçekli etkileri küçük organizmaya etkisi olur, bu işlemlerin biri herhangi bir değişiklik oynar. Nitekim, başlatma proteinlere mRNA doğru çeviri süreçlerini yöneten bir oran sınırlayıcı bir adımdır ve bu nedenle çok sayıda kontrol ve düzenleme noktalarının 5 hedefidir. Ikincisi için ya da bu işlemlerin bileşenleri için olsun biri arızalı olduğu ortaya çıkarsa, bu hücrede kurulan dengeyi bozacak ve böylece patolojik Condi yol açabilirleri. Bu bağlamda, çeviri faktörlerinin mutasyonlar, potansiyel olarak, beyaz matter' (eIF2B1-5 alt-birimi) 6, Walcott-Rallison sendromunda (Perk için EIF2AK3 kodlayan gen) 7, ufuk ile lökoensefalopati `gibi nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda yer almışlardır Parkinson hastalığı (eIF4G1 p.R1205H) 8. Bu hastalık gelişimi üzerine ve çeviri inisiyasyon genel sürecine bilgimizi artırmak için bu mutant proteinlerin hücresel ve moleküler çalışmalar yapmak için bu nedenle önemlidir.
Bu çalışmaları yürütmek için, bu mutasyonların sonuçlarını gözlemlemek için en uygun modelleri seçmek için esastır Xenopus oositler, özellikle de onların fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle uyarlanmış laevis. Fizyolojik eşzamanlılık (hücre döngüsünün faz G2 bloke) , protein sentezinin yüksek kapasiteli (200-400 ng / gün / oosit), ekstre solüsyonu ° yüksek sayıdaaynı hayvandan ytes (800-1.000 oosit / kadın) ve manipülasyonunu daha da kolaylaştırır hücre boyutu (çapı 1.2-1.4 mm). Sentezlenen mRNA ile Xenopus oosit Mikroenjeksiyon kolayca tercüme adımları incelemek için yapılabilir. Bu görüşe göre, diğer avantajlar sağlar. Mayoz ilerleme hızı ve çevirinin mRNA mikroenjeksiyon (~ 24 saat) sonra göz önüne alındığında, Xenopus oosit yeniden hücresel (E.coli çıkarılan, buğday mikroplar veya tavşan retikülosit …) sistemleri bir mRNA olduğu karşılaştırıldığında hızlı bir sistemi temsil azaltılmış tercüme oranıyla ve düşük bir hızda çevrilmiştir. Yani, bir mRNA tanıtılan bir mutasyonun etkisi hızla gözlemlenebilir ve kolayca birkaç oositlerinde okudu olacaktır. Xenopus oositleri diğer bir avantajı, maternal mRNA'lar latent ve protein için projesteron uyarması önce engellenmiş olmasıdır. Progesteron eklenmesi dolayısıyla çeviri indüksiyon kontrol için iyi bir araçtır. Sitoplazmik polyadenylation oogenez sırasında meydana gelmez. Bu zamansal sırayla progesteron uyarılmış oosit oosit olgunlaşması sırasında başlar ve erken gelişme boyunca devam eder ve çevirinin farklı adımları incelemek için kullanılabilir.
Mos mRNA poliadenilasyon meydana ilk arasındadır ve Charlesworth ark tanımlanan "erken olgunlaşma" genlerin sınıfına Aurora A / EG2, Histone Benzeri B4 mRNA ile aittir. (2004) 9. Böyle Cyclin A1 ve B1 Siklin olarak "geç" mRNA öteleme indüksiyon germinal vezikül arıza (GVBD) zamanında etrafında oluşur. Mos mRNA, bir serin / treonin protein kinazın-kodlar. Dolaylı oosit olgunlaşmasını aktive MAP kinaz kaskad indükler beri çeviri önemlidir. Gerçekten de, progesteron tepki olarak, mos mRNA poliadenilasyon eg2 düzenleyici proteinleri ve inci başka RNA bağlanma proteinleri Aurora A / kapsayan bir işlem ile arttırılırmos mRNA'nın e 3'UTR içerir. Mos mRNA bu artan poliadenilasyon da MEK1 aktive mos proteini seviyesinin bir artışa yol açar. Bu işlem, hücre dışı bir sinyal ayarlı kinaz 2-(ERK2) (Şekil 1) ait aktivasyon aracılık eder. Bu sinyal yolunun daha sonra faktör teşvik olgunlaşma M-fazı, Siklin B, Cdc2 kinaz tarafından oluşturulan bir kompleks tetikler ve sonunda öz değişmesine ait yeniden başlamasını sonuçlanır olabilir.
Xenopus oosit laevis nedenle, bu tür mos gibi anne mRNA çalışma kolayca birkaç mos, bileşenler sinyal de GVBD oranının belirlenmesi de dahil olmak üzere çeviri onların verimli poliadenilasyonu birkaç uç noktaları ile çevirilebilirlik test etmek için kullanılabilir. Bu sistem, yeni transkripsiyonu mRNA veya transfeksiyon verimlilik müdahalesi olmadan çeviri başlatma faktörleri mutasyonların ilk sonuçlarını değerlendirmek, bu nedenle ilginç sorunlar sıklıkla eukary ile meydana gelenotik hücre çalışmaları.
Burada, bir protokol Xenopus oosit laevis ve anne mRNA çeviri test edilir mutant eIF4G1 mRNAlar microinjected nerede kurulmuştur. Oosit mayoz hücre döngüsü boyunca ve erken ve geç sınıf mRNA'larının sonraki çeviri için ilerlemesi için gerekli olan bir GVBD ilerlemesinde defekt, mos mRNA polidenilasyondan huzurunda tespit edilmiştir. Fosforilasyonu Aurora A / EG2 ve ERK de mos deregulation.Thus sonucunu doğrulamak için çalışılmıştır, Xenopus oositler mRNA çeviri farklı adımlar analiz için basit bir yol gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tercüme birkaç nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere sayısız insan bozukluklarının patofizyolojisinde rol bir mekanizmadır. Parkinson hastalığında Örneğin çeşitli raporlar kalıtsal mutasyonlara 8,12,13 ile bağlantılı tercüme edilen değer göstermiştir.
Çeşitli hücresel modeller çeviri incelemek için kullanılabilir. Burada, eIF4G1 ve eIF4E mümkün 8 arasındaki etkileşimi azaltmak gibi baskın negatif mutasyonu hareket eIF4G1 bir m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
