Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Xenopus अनुवाद हानि की पहचान के लिए एक मॉडल के रूप laevis

Published: September 27, 2015 doi: 10.3791/52724
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2, 1, 1
1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

Abstract

प्रोटीन संश्लेषण विविध जैविक प्रक्रियाओं पर्यावरण की स्थिति के लिए विशेष रूप से अनुकूलन को प्रभावित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया है। mRNA दीक्षा कोडोन, eIF4G1 सहित शामिल दीक्षा कारक पर राइबोसोमल सब यूनिटों के विधानसभा शामिल है जो दीक्षा कदम,। अनुवाद की इस दर सीमित कदम में दोष विविध विकारों से जुड़े होते हैं। ऐसे deregulations के संभावित परिणामों का अध्ययन करने के लिए, Xenopus oocytes मानव के साथ आवश्यक सेलुलर और आणविक तंत्र के संरक्षण के उच्च डिग्री के साथ एक आकर्षक मॉडल का गठन laevis। इसके अलावा, अर्धसूत्रीविभाजनिक परिपक्वता के दौरान, oocytes transcriptionally दमित कर रहे हैं और सभी आवश्यक प्रोटीन पहले से मौजूद, माता के रूप में ली गई mRNAs से अनुवाद कर रहे हैं। यह सस्ता मॉडल के लिए एक प्रभावी अनुवाद के साथ पूरी तरह से एकीकृत बनने के लिए बहिर्जात mRNA के लिए सक्षम बनाता है। यहाँ (eIF4G1 यहाँ) ब्याज की एक कारक के साथ अनुवाद का आकलन stor प्रयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णन किया गया हैपहली बार कर रहे हैं कि मातृ mRNA एड polyadenylated और एक शारीरिक readout के रूप में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान अनुवाद करने के लिए। सबसे पहले, mRNA के हित के प्लास्मिडों (यहाँ eIF4G1) की इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा synthetized कीटाणु पुटिका टूटने का पता लगाने के द्वारा oocytes और डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के कैनेटीक्स में इंजेक्ट कर रहे हैं निर्धारित किया जाता है। अध्ययन किया मातृ mRNA लक्ष्य सेरीन / threonine प्रोटीन काइनेज राज्यमंत्री है। इसके polyadenylation और इसके बाद के अनुवाद डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में शामिल झरना संकेत राज्यमंत्री के प्रोटीन की अभिव्यक्ति और फास्फोरिलीकरण के साथ मिलकर जांच कर रहे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल के बदलाव आगे रख अनुवादकीय दोष भी अपने सामान्य प्रयोज्यता पर जोर देना प्रस्तावित है। न्यायपालिका प्रोटीन संश्लेषण मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के रोगजनन में शामिल किया जा सकता है कि सबूत उभरते के प्रकाश में, इस तरह के एक मॉडल को आसानी से इस हानि का आकलन करने और नए लक्ष्यों की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है।

Introduction

प्रोटीन जीव की बड़े पैमाने पर आवश्यक सेलुलर जीवन के तत्वों और इस तरह कर रहे हैं। वे संरचना, परिवहन, प्रतिक्रिया कटैलिसीस, विनियमन, जीन अभिव्यक्ति आदि उनकी अभिव्यक्ति प्रोटीन में एक mRNA के रूपांतरण की अनुमति के अनुवाद का एक जटिल तंत्र का परिणाम है सहित सेलुलर कार्यों के बहुमत किया जाता है। अनुवाद अनुकूल करने के लिए और विकास और भेदभाव, उम्र बढ़ने, शारीरिक तनाव या रोग अभिव्यक्तियों के दौरान सेल की जरूरत के अनुसार जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए विभिन्न नियंत्रण के अधीन है।

टोपी पर निर्भर है, टोपी-स्वतंत्र आंतरिक राइबोसोम एंट्री सेगमेंट (IRES) संरचनाओं और टोपी स्वतंत्र अनुवाद Enhancers (वाया: अनुवाद 3 दीक्षा अनुवाद प्रणालियों इन जरूरतों पर प्रतिक्रिया करने के क्रम में तीन चरणों (दीक्षा, बढ़ाव और समापन) और तोहफे में बांटा गया है ) हवाला देते हैं।

अधिकांश यूकेरियोटिक mRNA के एक टोपी depe में अनुवाद कर रहे हैंप्रोटीन संश्लेषण के दौरान एक मान्यता सुविधा के रूप में कार्य करता है कि 7-methylguanosine 5'-ट्रायफ़ोस्फेट टोपी के माध्यम से ndent तरीके से। इस टोपी eIF4E, eIF4G1 और eIF4A साथ eIF4F परिसर के एक घटक को बांधता है। पाली (ए) बाध्यकारी प्रोटीन (PABP) जैसे अन्य भागीदारों के साथ जुड़े, eIF2-जीटीपी-मेट-tRNA मेट, इन अनुवाद दीक्षा कारकों mRNA के परिपत्र फेरना और मान्यता 1 कोडोन अगस्त दीक्षा तक रूपों के लिए 43s जटिल इसकी पहुंच में सुधार करने के लिए अनुमति देते हैं। इस घटना अनुवाद दीक्षा यानी, अनुवाद के पहले कदम के अंत से मेल खाती है।

कैप-स्वतंत्र अनुवाद उदाहरण सेल प्रसार और apoptosis के लिए प्रेरित जोर देकर कहा कि शर्तों के तहत आवश्यक प्रोटीन के लिए mRNA एन्कोडिंग द्वारा प्रयोग किया जाता है। इस तंत्र mRNA में माध्यमिक संरचनाओं शामिल 5'- untranslated क्षेत्र (UTR) IRES कहा जाता है, eIF4A और 43s जटिल के साथ जुड़े eIF4G1 की carboxy टर्मिनल अंत। इस 43s पूर्व दीक्षा ग के बंधनIRES को omplex eIF4E कारक 2,3 के लिए आवश्यकता के बिना टोपी स्वतंत्र अनुवाद आरंभ करता है।

MRNA UTR 4 के भीतर स्थित संरचनाओं CITE के माध्यम से अंत में, अभी भी अच्छी तरह से नहीं समझा गया एक और अनुवाद तंत्र पर बल दिया शर्तों के तहत इस टोपी स्वतंत्र अनुवाद गतिविधि का समर्थन करता है।

उनकी दीक्षा कदम से भिन्न अनुवाद के इन विभिन्न साधनों के माध्यम से, अनुवाद सेलुलर homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका है और इस तरह बड़े पैमाने पर प्रभाव के लिए छोटे से जीव प्रभाव होगा इन प्रक्रियाओं में से एक में किसी भी बदलाव के लिए खेलता है। दरअसल, दीक्षा प्रोटीन में mRNA का सही अनुवाद प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले एक सीमित दर कदम है और इस तरह कई नियंत्रण और विनियमन अंक 5 का लक्ष्य है। यह बाद के लिए या इन प्रक्रियाओं के घटकों के लिए है कि क्या एक दोषपूर्ण होने का पता चला है, यह सेल में स्थापित संतुलन उपद्रव जाएगा और इस प्रकार वैकृत कब्जा करने के लिए ले जा सकता हैमाहौल। इस संदर्भ में, अनुवाद कारकों में परिवर्तन ऐसे में संभावित सफेद matter' (eIF2B1-5 सबयूनिट) 6, वालकोट-Rallison सिंड्रोम में (पर्क के लिए EIF2AK3 जीन एन्कोडिंग) 7, गायब हो जाने के साथ leukoencephalopathy `के रूप में neurodegenerative विकारों सहित कई विकारों में शामिल किया गया है पार्किंसंस रोग (eIF4G1 p.R1205H) 8। यह रोग के विकास पर और अनुवाद दीक्षा की सामान्य प्रक्रिया पर हमारे ज्ञान में वृद्धि करने के लिए इन उत्परिवर्ती प्रोटीन के सेलुलर और आणविक अध्ययन का संचालन करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।

इन अध्ययनों के लिए बाहर ले जाने के लिए, यह इन म्यूटेशन के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए सबसे पर्याप्त मॉडल का चयन करने के लिए आवश्यक है Xenopus oocytes विशेष रूप से अच्छी तरह से उनकी शारीरिक और जैव रासायनिक गुणों के कारण अनुकूलित कर रहे हैं laevis:। शारीरिक समक्रमिकता (सेल चक्र के चरण G2 में अवरुद्ध) प्रोटीन संश्लेषण की उच्च क्षमता (200-400 एनजी / दिन / डिम्बाणुजनकोशिका), निकाले OOC की उच्च संख्याएक ही पशु से ytes (800-1000 oocytes / महिला) और उनके हेरफेर सुविधा है, जो सेल आकार (व्यास में 1.2-1.4 मिमी)। संश्लेषित mRNA के साथ Xenopus oocytes के microinjection आसानी से अनुवाद कदम काटना करने के लिए किया जा सकता है। इस दृश्य में यह अन्य लाभ प्रस्तुत करता है। अर्धसूत्रीविभाजन प्रगति की गति और अनुवाद के mRNA microinjection (~ 24 घंटे) के बाद दिया, Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका पुनर्गठन सेलुलर (कोलाई से निकाला, गेहूं रोगाणु या खरगोश रेटिकुलोसाइट ...) सिस्टम एक mRNA है जिसमें की तुलना में एक तेज प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है एक कम अनुवाद दर के साथ और एक कम गति से अनुवाद किया। तो, एक mRNA में पेश एक उत्परिवर्तन के प्रभाव को जल्दी से नमूदार और आसानी से कई oocytes में अध्ययन किया जाएगा। Xenopus oocytes की एक और लाभ यह मातृ mRNAs अव्यक्त हैं और प्रोटीन अनुवाद प्रोजेस्टेरोन उत्तेजना से पहले अवरुद्ध है कि है। प्रोजेस्टेरोन के अलावा इस प्रकार अनुवाद प्रेरण नियंत्रित करने का एक अच्छा साधन है। Cytoplasmic पीolyadenylation डिम्बजनन दौरान उत्पन्न नहीं होती है। यह एक अस्थायी आदेश में प्रोजेस्टेरोन उत्तेजित oocytes में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान शुरू होती है और जल्दी विकास भर में जारी है और अनुवाद के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

राज्यमंत्री mRNA का polyadenylation घटित करने के लिए पहले के बीच में है और यह चार्ल्सवर्थ एट अल में परिभाषित के रूप में "जल्दी परिपक्वता" जीन की कक्षा में अरोड़ा ए / Eg2, हिस्टोन-तरह बी 4 mRNA के साथ संबंध रखता है। (2004) 9। ऐसे Cyclin A1 और Cyclin बी 1 के रूप में "देर" mRNA के translational प्रेरण कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) के समय के आसपास होता है। राज्य मंत्री mRNA के एक सेरीन / threonine प्रोटीन काइनेज encodes। यह परोक्ष रूप से डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता को सक्रिय करता है कि नक्शा काइनेज झरना लाती है के बाद से अपने अनुवाद महत्वपूर्ण है। दरअसल, प्रोजेस्टेरोन के जवाब में राज्यमंत्री mRNA का polyadenylation Eg2 नियामक प्रोटीन और वें के साथ अन्य आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अरोड़ा ए / जुड़े एक प्रक्रिया के माध्यम से बढ़ाया हैराज्यमंत्री mRNA का ई 3'UTR। राज्यमंत्री mRNA की इस बढ़ती polyadenylation बदले में MEK1 को सक्रिय करता है जो राज्य मंत्री प्रोटीन के स्तर की वृद्धि हुई है, की ओर जाता है। इस प्रक्रिया को बाह्य संकेतन विनियमित काइनेज 2 (ERK2) (चित्रा 1) के सक्रियण मध्यस्थता करता है। यह संकेत झरना तो कारकों को बढ़ावा देने परिपक्वता एम चरण, Cyclin बी और Cdc2 काइनेज द्वारा गठित एक जटिल ट्रिगर, और अंततः अर्धसूत्रीविभाजनिक बहाली में परिणाम कर सकते हैं।

Xenopus oocytes laevis इसलिए, इस तरह के राज्यमंत्री के रूप में मातृ mRNA का अध्ययन आसानी से कई राज्यमंत्री, घटकों संकेत भी GVBD दर के निर्धारण सहित का अनुवाद करने के लिए उनके कुशल polyadenylation से कई समापन के साथ उनके translatability परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रणाली को नव लिखित mRNA का या अभिकर्मक दक्षता के हस्तक्षेप के बिना अनुवाद दीक्षा कारकों में परिवर्तन के पहले परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए इसलिए दिलचस्प है, समस्याओं अक्सर eukary के साथ होने वालीकान का सेल अध्ययन करता है।

इधर, एक प्रोटोकॉल Xenopus oocytes laevis और मातृ mRNA का अनुवाद परीक्षण किया है में उत्परिवर्ती eIF4G1 mRNAs microinjected रहे हैं, जहां की स्थापना की है। डिम्बाणुजनकोशिका अर्धसूत्रीविभाजनिक सेल चक्र के माध्यम से और जल्दी और देर वर्ग mRNAs के बाद के अनुवाद के लिए प्रगति के लिए आवश्यक है, जो एक GVBD प्रगति में दोष, राज्यमंत्री mRNA polyadenylation की उपस्थिति में पता लगाया है। फास्फोरिलीकरण अरोड़ा ए / Eg2 और ERK भी राज्यमंत्री deregulation.Thus का परिणाम पुष्टि करने के लिए अध्ययन किया है, Xenopus oocytes mRNA के अनुवाद के विभिन्न चरणों का विश्लेषण करने के लिए एक आसान तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी Xenopus प्रयोगों प्रयोगशाला पशु प्रयोग के लिए यूरोपीय समुदाय परिषद के दिशा निर्देशों (86/609 / EEC) के नियमों के अनुसार लिले 1 विश्वविद्यालय के पशु सुविधा पर प्रदर्शन किया गया। पशु प्रोटोकॉल (Comité डी Ethique एन प्रयोगों Animale नॉर्ड-पस-de-Calais CEEA 07/2010) स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. Oocyte हैंडलिंग

  1. संवेदनाहारी समाधान तैयार: बाँझ पानी की एक एक एल में tricaine मीथेन Sulphonate पाउडर का 1 ग्राम भंग।
  2. महिला Xenopus इस समाधान में laevis डुबकी तनाव से बचने और जानवर पूरी तरह से (एक पैर चुटकी करने के लिए किसी भी प्रतिक्रिया के बिना) बेहोश होने के लिए लगभग 45 मिनट इंतजार करने के लिए बीकर को कवर किया।
  3. तो साफ एल्यूमीनियम पन्नी पर अपनी पीठ पर जानवरों की जगह साबुन के साथ मेंढक को धो लें और नल के पानी से कुल्ला।
  4. पेट के पार्श्व भाग की और संदंश के साथ अंडाशय स्तर पर त्वचा दबाना।इथेनॉल 70% के साथ उपयोग करने से पहले साफ कैंची से लगभग 1 सेमी का एक चीरा। खंड काफी गहरी है कि सुनिश्चित करें और विकास के विभिन्न चरणों में कई oocytes पाया जाता है, जिसमें डिम्बग्रंथि ऊतक के छांटना अनुमति देने के लिए अंतर्निहित पेट की दीवार तक पहुँचने के लिए।
  5. ND96 मध्यम (96 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl के साथ एक पेट्री डिश (50 मिमी) में उन्हें चार बार धोने, अंडाशय पालियों काटना, 1 मिमी 2 MgCl, 1.8 मिमी CaCl 2, 5 मिमी HEPES, NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित पूरक 50 ग्राम के साथ / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन / पेनिसिलिन, 225 माइक्रोग्राम / एमएल सोडियम पाइरूवेट, / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध 30 माइक्रोग्राम, 1 μl / एमएल टेट्रासाइक्लिन) रक्त और मलबे के सभी निशान को हटाने के लिए।
    नोट: टेट्रासाइक्लिन एक इष्टतम संरक्षण और microinjection उपचार के बाद एक अच्छी वसूली की अनुमति देता है।
  6. एक सप्ताह के लिए उनके संरक्षण की अनुमति, 14 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम में डूबे एक कवर पेट्री डिश में उन्हें दुकान।
  7. पेट की दीवार और पशुचिकित्सा absorbable टी के साथ त्वचा सिलाईhread और एक suturing सुई (3 या 4 टांके आवश्यक हो जाएगा)।
  8. पानी के बिना एक बीकर में पशु प्लेस और मेंढक फिर से बढ़ जाता है जब तक नल के पानी के साथ त्वचा Moister। भागने से रोकने के लिए बीकर कवर।
  9. एक 10 गुना बढ़ाई के साथ एक stereomicroscope के तहत संदंश के 2 जोड़ी का उपयोग करके ध्यान से 5 से 10 oocytes के समूहों में मध्यम में अंडाशय पालियों अलग करें। चरण VI में चयन oocytes। वे एक भूरे रंग पिगमेंट पशु ध्रुव और व्यास 10 में 1.2 मिमी के लिए द्वितीय) उनके आकार बेहतर एक स्पष्ट बेल्ट के द्वारा अलग पीले वनस्पति पोल के साथ) मैं द्वारा उनके आकार और रंग पहचाना जा सकता है।
  10. (कोलैजिनेज़ डिम्बाणुजनकोशिका / कूपिक सेल कनेक्शन हज़म) डिम्बाणुजनकोशिका defolliculation की सुविधा के लिए 45 मिनट के दौरान कोमल आंदोलन के तहत एक पेट्री डिश में (टेट्रासाइक्लिन बिना ND96 में भंग क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से 1 मिलीग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ ए) एक collagenase समाधान में चयनित oocytes सेते हैं। ND96 माध्यम के साथ 3 या 4 बार 14 पर रखा oocytes कुल्लासी।
    नोट: oocytes कम या डिम्बाणुजनकोशिका सतह प्रोटीन को नष्ट करने का और गरीब व्यवहार्यता के कारण के जोखिम के कारण अधिक से अधिक 45 मिनट सेते हैं मत करो। कोलेजिनेस उपचार सहज GVBD पैदा कर सकते हैं।
  11. 3-4 घंटे के लिए मध्यम में oocytes सेते हैं। दूरबीन आवर्धक कांच के तहत ठीक चिमटी के साथ कूपिक कोशिकाओं को हटाने और ND96 माध्यम में 19 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए।

MRNA संश्लेषण की 2. तैयारी

  1. मैं एंजाइम Pme का उपयोग कर enzymatic पाचन द्वारा निम्नलिखित plasmids के 5 माइक्रोग्राम Linearize।
    नोट: pcDNA6.2 / एक 1599 एमिनो एसिड eIF4G1 सीडीएनए जंगली प्रकार (eIF4G1-गुम्मट; NM_198241) युक्त वी 5-DEST म्यूटेशन c.2105T के साथ, एक eIF4G1 प्रमुख नकारात्मक सीडीएनए (eIF4G1-डी.एन.) युक्त pcDNA6.2 / वी 5-DEST > जी c.2106A> सी, c.2120-> जी, c.2122T> ए, 2125T> - और c.2126T> जी इसी प्रोटीन की 618 करने की स्थिति 612 पर eIF4G1 और eIF4E के बीच बातचीत के क्षेत्र में परेशान बातचीत betweएन eIF4G1 और eIF4E 8, Chloramphenicol Acetyl ट्रांस्फ़्रेज़ युक्त pcDNA6.2 / सी-EmGFP (GFP)। 3 प्लास्मिडों से प्रत्येक के लिए 2 मिश्रण तैयार: मैं एंजाइम पहली सहित Pme और दूसरा नियंत्रण के रूप में एंजाइम के बिना।
  2. एक शास्त्रीय इथेनॉल प्रक्रिया का उपयोग प्लास्मिड डीएनए वेग और Nuclease मुक्त एच 2 ओ के 20 μl में यह resuspend
  3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग अपनी एकाग्रता का निर्धारण करते हैं। एकाग्रता क्रेना टाइप करने के लिए μl 150 एनजी / करने के लिए बेहतर होना चाहिए।
  4. प्लाज्मिड linearization को सत्यापित करने के लिए एक नमूने के μl और एक 0.8% agarose जेल पर लोड हो रहा है बफर के 5 μl के साथ उनके नियंत्रण चलाएँ।
  5. इन विट्रो प्रतिलेखन और निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्रेना शुद्धि के लिए एक किट का प्रयोग करें। लिखित क्रेना Nuclease मुक्त एच 2 ओ के 20 μl में resuspended यदि आवश्यक हो तो नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  6. 0.2 एम MOPS (पीएच 7.0), 20 मीटर युक्त MOPS 10X पलायन बफर तैयारएम सोडियम एसीटेट और 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच)। एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान जीवाणुरहित। समाधान ऑक्सीकरण से बचने के लिए आरटी पर प्रकाश से सुरक्षित समाधान शेयर।
  7. NaOH, एचसीएल के साथ क्रमिक वैद्युतकणसंचलन टैंक साफ और अच्छी तरह से एक हे के लिए डबल फिल्टर्ड पानी से rinsed / एन RNase से बचने और आरएनए गिरावट को रोकने के लिए।
  8. Mops और formaldehyde युक्त एक 1.5% agarose जेल डाली। पूरा agarose विघटन तक गर्म और यह 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। धूआं हुड के तहत, MOPS 10X के 0.1 मात्रा formaldehyde के 6.6% और ethidium ब्रोमाइड के 4 ग्राम (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। धूआं हुड के तहत जेल डालो और जेल कड़ा करने के लिए लगभग 1 घंटा इंतजार।
    नोट: संक्रामक और ethidium ब्रोमाइड विषाक्त कर रहे हैं।
  9. क्रेना के 1 μl, formaldehyde के 8.8%, formamide का 60% और mops 10X के 0.1 मात्रा के साथ एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में माइग्रेशन के लिए नमूने तैयार करें। 70 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब डाल दिया। नमूने अपकेंद्रित्र कुछ ही सेकंड में5000 x जी। जेल लोड हो रहा बफर के 2 μl जोड़ें।
    नोट: Formamide विषैला होता है।
  10. 90V पर 20 मिनट के लिए नमूने चलाएँ। क्रेना गुणवत्ता की जांच करने के लिए यह विश्लेषण करने से पहले जेल destain Nuclease मुक्त एच 2 ऊ / एन में जेल लेना।
  11. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग क्रेना एकाग्रता का निर्धारण और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।

संश्लेषित आरएनए और oocytes परिपक्वता उत्तेजना 3. Microinjection

  1. Oocytes microinjection के लिए आवश्यक उपकरण तैयार करें। छोटा गिलास केशिका खींचने के लिए एक micropipette खींचने का प्रयोग करें। Stereomicroscope के तहत, एक कुंद अंत बनाने के लिए चिमटी के साथ केशिका का सिरा बंद तोड़ने। विपरीत छोर पर एक Millipore 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग खनिज तेल के साथ केशिका micropipette भरें। Microinjection पिपेट पर micropipette माउंट। उचित गिलास केशिका साथ प्रयोग किया जाए अच्छा सटीकता देने के लिए निर्माता द्वारा calibrated एक सटीक micropipette चुनें।
  2. Microinjection defolliculation के बाद 1-2 घंटा प्रदर्शन करना, oocytes पर डिम्बाणुजनकोशिका वसूली के लिए आवश्यक देरी 14 डिग्री सेल्सियस पर रखा। नीचे के साथ प्रयोग करें पेट्री डिश oocytes के लिए एक चिपकने वाली सतह बनाने के लिए और ND96 माध्यम के साथ उन्हें भरने के लिए संदंश के साथ स्क्रैप है।
  3. 45 डिग्री सेल्सियस के कोण पर केशिका micropipette के साथ oocytes की एक के बाद एक इंजेक्शन की अनुमति के एक पेट्री डिश में एक स्क्रैप लेन साथ oocytes की व्यवस्था।
  4. कोशिका द्रव्य में नमूने के एक इष्टतम प्रसार के लिए pigmented पशु क्षेत्र के नीचे, डिम्बाणुजनकोशिका इक्वेटोरियल क्षेत्र में इंजेक्षन। गहराई से लगभग 150-200 माइक्रोन पर केशिका टिप का केवल सबसे पतला हिस्सा डालें।
  5. पहली बार एक डिम्बाणुजनकोशिका में 60 nl की एक मात्रा में विभिन्न प्लास्मिडों से क्रमशः प्राप्त क्रेना के 30 एनजी इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद, नमूना बच (2A चित्रा) से बचने के लिए केशिका टिप को हटाने से पहले 5-10 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
    नोट: 120 nl अधिक नहीं है। के रूप में धीरे-धीरे आप कर सकते हैं इंजेक्षन। आसुत जल के साथ एक नियंत्रण की सिफारिश की है।
  6. अगले डिम्बाणुजनकोशिका इंजेक्षन करने के लिए मैन्युअल पेट्री डिश ले जाएँ।
    नोट: टिप 2 से 3 microinjections के बाद स्नान समाधान के बाहर एक छोटा सा पल्स पैदा करने से भरा हुआ नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  7. 24 कुओं संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरण इंजेक्शन oocytes (10 oocytes / अच्छी तरह से) ताजा ND96 माध्यम के 3 मिलीग्राम से भरा है और 19 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें छोड़ दें।
  8. 19 डिग्री सेल्सियस पर अर्धसूत्रीविभाजनिक परिपक्वता (GVBD) को गति प्रदान करने के लिए प्रोजेस्टेरोन (पीजी) (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ ND96 में oocytes सेते 15 घंटा या pcDNA6.2 / वी 5-DESTeIF4G1 और pcDNA6 से क्रमशः प्राप्त polyadenylated CRNAs के microinjection के बाद 4 घंटा 0.2 / सी-EmGFP एक नियंत्रण (2A चित्रा) के रूप में इस्तेमाल किया।
    नोट: क्रेना के साथ फ्लोरोसेंट मार्कर के सह इंजेक्शन क्रेना इंजेक्शन और डिम्बाणुजनकोशिका में बने रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छा उपकरण है। एक GFP टैग के साथ ब्याज की एक क्रेना का उपयोग करते हुए इस तरह के प्रारंभिक प्रयोगों प्रदर्शन करना।
  9. Microinject के रूप में # 3.5 अलग अनुपात (1: 3, 2: 2, 3: 1) ते क्रम में eIF4G1-WT और eIF4G1-डी.एन. सीआरएनए polyadenylated कीसेंट उत्परिवर्ती phenotype (चित्रा 2 डी) पर eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए का अनुवाद प्रभाव।

4. कीटाणु पुटिका टूटने निर्धारण

  1. एक stereomicroscope के साथ काले जानवर ध्रुव पर एक सफेद स्थान की उपस्थिति को देख कर पीजी उत्तेजना के बाद परिपक्व oocytes की संख्या की गणना। चौबीसवें घंटे (चित्रा 2 बी, 2 सी) तक गिनती हर घंटे दोहराएँ।

5. वेस्टर्न ब्लाट (पश्चिम बंगाल) विश्लेषण

  1. 50 मिमी Hepes, पीएच 7.4, 500 मिमी NaCl, 0.05% एसडीएस, 5 मिमी 2 MgCl, 1 मिलीग्राम: निम्नलिखित बफर में 200 μl में 4 डिग्री सेल्सियस पर, 10 पीठ द्वारा oocytes और एक micropipette टिप के साथ आगे आंदोलनों के समूह Homogenize / एमएल गोजातीय सीरम albumin, 10 मिलीग्राम / एमएल leupeptin, 10 मिलीग्राम / एमएल aprotinin, 10 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध, 10 मिलीग्राम / एमएल benzamidine, 1 मिमी PMSF, 1 मिमी सोडियम वैनेडेट।
  2. 10,000 XG पर 15 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र लिपिड (ऊपरी चरण) और झिल्ली (नीचे चरण) च दूर करने के लिएractions। प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और Laemmli या एक बीआईएस Tris नमूना बफर के साथ शेष पूरा करने के लिए एक विभाज्य की दुकान, cytoplasmic अंश लीजिए (1: 1)।
    नोट: बीआईएस Tris जैल और लोडिंग बफर हाइड्रोलिसिस से प्रोटीन की रक्षा करता है कि एक और तटस्थ पीएच है
  3. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना के 20 ग्राम गरम करें। Acrylamide जेल के कुओं में प्रत्येक नमूना लोड। उचित बफर के साथ एक टैंक में जेल रखें।
  4. 200 वी पर 1 घंटे के लिए एक वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना
  5. टीबीएस पीएच में पश्चिम बंगाल 8.0 एहसास (Tris एचसीएल 15 मिमी, सोडियम क्लोराइड 150 मिमी, बीच 0.1%, जिसमें 10% गोजातीय सीरम albumin) एक बकरी विरोधी अरोड़ा ए / Eg2 (1: 3000, 2 घंटा) के साथ या एक खरगोश विरोधी के साथ -Aurora ए / Eg2-पी (1: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 हे / एन), माउस विरोधी ERK2 (1: 3000, 2 घंटा), बकरी विरोधी ERK2-पी (Tyr204) (1: 3000, 2 घंटा 10,000, 2 घंटा) और खरगोश विरोधी Rsk (1:), खरगोश विरोधी राज्यमंत्री (1: 5000, 4 घंटा), खरगोश विरोधी GFP (1: 3000, 2 घंटा) antibodies.Use माउस विरोधी वी 5 एंटीबॉडी (1 : लोडिंग नियंत्रण के रूप में 1000, 2 घंटा) ()।
  6. धुलाईझिल्ली में 3 बार 10 मिनट के लिए टीबीएस-बीच में और साथ 1 घंटा सेते 1 के dilutions पर एक विरोधी माउस या विरोधी खरगोश या विरोधी बकरी (आईजीएम) हॉर्सरैडिश peroxidase लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी या तो: 5000: 1, 7500 और 1 : क्रमश: 5,000।
  7. टीबीएस-बीच में 10 मिनट के 3 washes के प्रदर्शन और उन्नत ईसीएल डिटेक्शन सिस्टम के साथ प्रतिजन एंटीबॉडी परिसरों का पता लगाने।

6. polyadenylation परख

  1. नमूना एक 1.5 मिलीलीटर में शर्त के अनुसार 5 oocytes। Nuclease मुक्त पीबीएस 1X (7.4 पीएच) के 1 मिलीलीटर के साथ उन्हें धो लें। निम्नलिखित कदम धूआं हुड के तहत बनाया जाएगा।
  2. (निर्माता निर्देश देखें) एक शास्त्रीय जैविक प्रक्रिया का उपयोग कर शाही सेना निकालें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifugation (10,000 XG) द्वारा शाही सेना की वसूली। 10 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला और शुष्क हवा आरएनए निकालें।
  4. Nuclease मुक्त एच 2 ओ के 30 μl में Resuspend शाही सेना गोली
  5. एक नया ट्यूब में नमूने के 15 μl ले लो और Nuclease मुक्त एच 2 ओ के 85 μl जोड़ने क्लीन अपएसई नमूने निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलिका के स्तंभ पर उनकी गुणवत्ता में सुधार करने के लिए। Nuclease मुक्त एच 2 ओ के 30 μl का उपयोग कर आरएनए Elute
  6. आरएनए अखंडता की जाँच करने के लिए एक 0.8% agarose जेल पर लोड हो रहा है बफर के 5 μl के साथ नमूने के 1 μl चलाएँ।
  7. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग आरएनए एकाग्रता का निर्धारण।
  8. शर्त के अनुसार 2 बंधाव मिश्रण तैयार (यानी, eIF4G1-गुम्मट, eIF4G1-डी.एन. और एच 2 ओ नियंत्रण) निम्नलिखित अभिकर्मकों के साथ: आरएनए ligase के 10 यू, 10X बफर के 0.1 मात्रा 1 मिमी एटीपी, PEG8000 50% का 10% प्राइमर P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 और Nuclease मुक्त एच 2 ओ के साथ 10 μl अंतिम मात्रा लाने के 0.1 माइक्रोग्राम पीजी उत्तेजना के बिना oocytes से प्राप्त पहली मिश्रण शाही सेना में जोड़ें और पीजी से प्राप्त दूसरी मिश्रण आरएनए में oocytes को प्रेरित किया।
  9. एंजाइम निष्क्रिय करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  10. हमेंईए सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) किट। ट्यूब प्रति, आरटी मिश्रण तैयार करें: 10X आरटी बफर के 0.1 मात्रा Nuclease मुक्त एच के साथ प्राइमर P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 मिमी dNTP मिश्रण, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 50 यू और 0.1 माइक्रोग्राम पूरा अंतिम मात्रा 2 हे 10 μl की। पहले से प्राप्त बंधाव प्रतिक्रिया के 10 μl जोड़ें। निर्माता द्वारा वर्णित शर्तों के तहत आर टी प्रदर्शन करते हैं।
  11. (पीसीआर) मिश्रण, ट्यूब प्रति पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन तैयार: बफर 10X के 0.1 मात्रा 1.5 मिमी 2 MgCl, 133 माइक्रोन dNTP मिश्रण, 0.2 माइक्रोन विशिष्ट प्राइमर, 0.2 माइक्रोन प्राइमर p2, 0.025 यू Taq पोलीमरेज़, सीडीएनए के 1 μl और पूरा साथ Nuclease मुक्त 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए एच 2 ओ। निम्न शर्तों के तहत पीसीआर प्रदर्शन: 50 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, [30 सेकंड के लिए 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 56 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस] के लिए * 40 चक्र, 72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट 9 के लिए। इस प्रकार के रूप में विशिष्ट प्राइमरों हैं: राज्यमंत्री, जीTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone की तरह बी 4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin बी 1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9।
  12. एक 3% agarose जेल तैयार करें। प्रत्येक पीसीआर उत्पादों लोडिंग बफर के 10 μl में जोड़ें। एक इष्टतम माइग्रेशन के लिए 110 वी पर नमूने के 10 μl के साथ जेल चला। उनके अनुवाद करने के लिए एक शर्त है जो पूंछ पाली (ए) और इस तरह आरएनए परिपक्वता की लंबाई को दर्शाती आकार का एक परिवर्तन का पालन करने के लिए 10 और 20 मिनट के बाद जेल का विश्लेषण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पीजी उत्तेजना के 24 घंटा (आंकड़े 2 बी, 2 सी) के बाद Xenopus oocytes और प्रतिशत डिम्बाणुजनकोशिका GVBD के निर्धारण की काइनेटिक परिपक्वता:

EIF4G1-डी.एन. उत्परिवर्तन के translational परिणामों का अध्ययन करने के लिए, Xenopus में पीजी करने के लिए प्रतिक्रिया (एच 2 ओ, GFP) के eIF4G1-गुम्मट के लिए और अन्य नियंत्रण की स्थिति की तुलना में है क्रेना eIF4G1-डी.एन. साथ microinjected oocytes laevis। नियंत्रण की परवाह किए बिना इंजेक्ट क्रेना की या eIF4G1 overexpression की प्रकृति के डिम्बाणुजनकोशिका microinjection की घटनाओं का आकलन करने के लिए सक्षम करें।

microinjected नियंत्रण की शर्तों के द्वारा विशेषता 10 oocytes (एच 2 हे और GFP) की गतिज maturations गुम्मट के समान हैं और GVBD के दौर से गुजर की संख्या पीजी उत्तेजना (चित्रा 2 बी) के बाद बहुत 12 पर एक दूसरे के करीब है और 24 घंटा कर रहे हैं। 24 घंटे के बाद, oocytes की परिपक्वता (फाई गुम्मट के लिए 95.7%, GFP के लिए एच 2 हे और 97.5% के लिए 97.1% तक पहुँच Gure -2)। इस प्रकार, एच 2 ओ या नियंत्रण सीआरएनए या eIF4G1 सीआरएनए साथ microinjections डिम्बाणुजनकोशिका अर्धसूत्रीविभाजन रिहाई पर थोड़ा प्रभाव है। इसके विपरीत 8 घंटा पीजी उत्तेजना के बाद, GVBD के दौर से गुजर eIF4G1-डी.एन. सीआरएनए साथ microinjected oocytes की संख्या eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए (चित्रा 2 बी) काफी 85.8% से कम हो जाती है eIF4G1-गुम्मट oocytes बनाम eIF4G1-डी.एन. की व्याप्ति अर्धसूत्रीविभाजन रिहाई की तुलना में देरी हो रही है और 12 घंटे में 77.4% और 24 घंटा क्रमशः पीजी उत्तेजना (चित्रा -2) के बाद। यह 13 घंटे पीजी उत्तेजना के बाद, परिपक्व oocytes की संख्या अधिकतम पीजी उत्तेजना के बाद केवल 20 घंटा हासिल की है, जिसके लिए eIF4G1-डी.एन. को छोड़कर सभी स्थितियों के लिए एक अधिकतम तक पहुँच जाता है कि यह भी उल्लेखनीय है। इस प्रकार, eIF4G1-डी.एन. उत्परिवर्तन की उपस्थिति eIF4G1-गुम्मट की तुलना में गरीब डिम्बाणुजनकोशिका अर्धसूत्रीविभाजन रिहाई की ओर जाता है।

EIF4G1-डब्ल्यूटी (चित्रा 2 डी) के लिए eIF4G1-डी.एन. धन्यवाद की उपस्थिति में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता की बहाली:

_content "> eIF4G1-डी.एन. क्रेना microinjection impairs या ब्लॉकों डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता, eIF4G1-WT और eIF4G1-डी.एन. CRNAs के विभिन्न अनुपात-microinjected सह रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए। इन परिस्थितियों में, डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता की वृद्धि के स्तर के रूप में मनाया जाता है eIF4G1-गुम्मट क्रेना बढ़ाने के लिए और eIF4G1-डी.एन. क्रेना decrease.While परिपक्वता के उन eIF4G1-डी.एन. सीआरएनए की एक खुराक के साथ oocytes की 17.5% में मनाया जाता है, यह प्रतिशत eIF4G1-गुम्मट CRNAs के 3 खुराक के सह microinjection और साथ 76.7% तक पहुँच eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए की एक खुराक की उपस्थिति डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के 95% के लिए होता है। इस प्रयोग eIF4G1-डी.एन. साथ microinjected Xenopus oocytes की परिपक्वता दोष अपरिवर्तनीय नहीं है और आंशिक रूप से बहाल किया जा सकता है दिखाता है।

पहले और पीजी उत्तेजना (चित्रा 2 ई) के बाद अनुवाद की क्षमता का एक संकेतक के रूप में पश्चिम बंगाल पर मनाया प्रोटीन संकेत अभिव्यक्ति राज्यमंत्री:

eIF4G1-WT और eIF4G व्यक्त oocytes में वी 5-टैग की प्रोटीन के स्तर1-डी.एन. समान microinjection दक्षता को दर्शाती समान हैं। प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया Rsk प्रोटीन का स्तर भी पहले और पीजी उत्तेजना के बाद सभी परिस्थितियों में समान है। GFP प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया है या नहीं पीजी साथ भी GFP क्रेना साथ microinjected oocytes में मौजूद है। इन आंकड़ों microinjection और eF4G1 की overexpression GFP के अनुवाद उपद्रव नहीं है कि इंगित करता है। हालांकि, कोई GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति से पहले और eIF4G1-डी.एन. व्यक्त oocytes में पीजी उत्तेजना के बाद का पता लगता है। जैसी कि उम्मीद थी, कोई अंतर्जात राज्यमंत्री अभिव्यक्ति पीजी उत्तेजना के अभाव में पता लगता है। इसके अलावा, राज्य मंत्री अभिव्यक्ति eIF4G1-गुम्मट में मनाया जाता है और एच 2 ओ नियंत्रण की स्थिति पिछले परिणामों eIF4G1-गुम्मट की कि overexpression दिखाने के साथ समझौते में पीजी उत्तेजना के बाद अंतर्जात राज्यमंत्री 16 पर थोड़ा परिणाम है। इसके विपरीत, राज्यमंत्री अभिव्यक्ति की काफी कमी पीजी उत्तेजना के बाद ध्यान देने योग्य है।

पेशेवरझरना संकेत राज्यमंत्री के कुछ घटकों की Tein अभिव्यक्ति भी परीक्षण किया है। उदाहरण के लिए, अरोड़ा ए / Eg2 प्रोटीन प्रेरण और इसके प्रोटीन ढील की या पीजी उत्तेजना मनाया जाता है के बाद से प्रेरित अपने फॉस्फोरिलेटेड प्रपत्र का कोई पता लगाने राज्यमंत्री के लिए नदी के ऊपर काम कर रहा है। इसके विपरीत, राज्यमंत्री से प्रेरित ERK2 फास्फोरिलीकरण की ढील eIF4G1-डी.एन. की उपस्थिति में मनाया जाता है।

इन परिणामों के प्रोटीन और राज्यमंत्री निर्भर ERK2 सक्रियण में राज्यमंत्री शाही सेना के अंतर्जात अभिव्यक्ति eIF4G1-डी.एन. की अभिव्यक्ति से प्रभावित कर रहे हैं कि सुझाव दिया।

mRNA polyadenylation (चित्रा 2 एफ):

Xenopus के लिए आवश्यक कई mRNAs (राज्यमंत्री, Cyclin A1, Cyclin बी 1 और हिस्टोन की तरह बी 4) के polyadenylation अर्धसूत्रीविभाजन वसूली परीक्षण किया गया था oocytes। प्रदर्शन परख mRNA की पाली (ए) पूंछ की लंबाई के लिए इसी amplimer आकार में वृद्धि पीजी उत्तेजना के बाद मौजूद है परिभाषित करने के लिए सक्षम बनाता है। दरअसल, पी के साथजी उत्तेजना एक पाली (ए) पूंछ के अलावा eIF4G1-डी.एन. उत्परिवर्तन सहित सभी परिस्थितियों में मनाया जाता है।

चित्र 1
MAPK झरना सक्रियण की चित्रा 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। हार्मोनल उत्तेजना पर अरोड़ा ए / Eg2 और CPEB मार्ग के उन सहित घटित कई एंजाइमों की गतिविधियों में पीजी तेजी से बदलाव से। अरोड़ा ए / Eg2 की Hyperphosphorylation CPEB करने के लिए (Cytoplasmic polyadenylation तत्व बाध्यकारी प्रोटीन) फास्फोरिलीकरण ओर जाता है। फॉस्फोरिलेटेड CPEB, राज्यमंत्री mRNA का 3'UTR पर सीपीई (Cytoplasmic polyadenylation तत्व) को पहचानता है CPSF (दरार और polyadenylation विशिष्टता फैक्टर) रंगरूटों और पीएपी (पाली (ए) पोलीमरेज़) द्वारा mRNA polyadenylation को सक्रिय करता है। पीजी उत्तेजना भी PKA और cdk1, Maskin / eIF4E हदबंदी और eIF4E / eIF4G1 संघ के दोनों कार्रवाई के माध्यम से क्रमिक Maskin फास्फोरिलीकरण को बढ़ावा देता है। eIF4G1 किन्नर रंगरूटोंeIF4G1 के साथ सूचना का आदान प्रदान और पाली (ए) पूंछ पहचानता है, जो PABP सहित आबादी दीक्षा भागीदारों। एक बार जब राज्यमंत्री में बदल जाता है, फास्फोरिलीकरण द्वारा ERK2 / MAPK को सक्रिय करता है जो फास्फोरिलीकरण, द्वारा खल्क / MAPKK को सक्रिय करता है, संश्लेषित। इस तथाकथित MAPK झरना एम चरण प्रविष्टि काइनेटिक, धुरी morphogenesis और डीएनए संश्लेषण के निषेध को नियंत्रित करने से अर्धसूत्रीविभाजनिक प्रक्रियाओं में शामिल किया गया है। झरना प्रोटीन संश्लेषण बनाए कि एक सकारात्मक फीडबैक लूप में अंतर्निहित है। एक यह है कि GVBD सक्रियण के लिए संश्लेषित किया जा करने के लिए अनुरोध केवल प्रोटीन नहीं है राज्यमंत्री नोट करने के लिए है, यानी, Cyclin बी परिपक्वता उपलब्धि के लिए अनुवाद करने के लिए आवश्यक हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. eIF4G1-डी.एन. उत्परिवर्ती Xenopus laevis में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता और अनुवाद को प्रभावित करता है। V5 टैग eIF4G1 प्रोटीन (WT और डी.एन.) एन्कोडिंग plasmids से निकाली गई आरएनए हैंXenopus में microinjected oocytes laevis। 15 घंटे के बाद, oocytes की परिपक्वता प्रोजेस्टेरोन (पीजी) से प्रेरित है (प्रयोगों कम से कम 3 बार प्रदर्शन किया गया और प्रतिनिधि परिणाम दिखाया जाता है)। (ए) Schematicoverview प्रयोग प्रोटोकॉल की। eIF4G1 और / या GFP CRNAs के इंजेक्शन पीजी उत्तेजना से पहले तीर-प्रमुखों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए नमूने 2 समय बिंदुओं पर (पीजी उत्तेजना और GVBD गतिज के अंत में) प्राप्त किया गया है। GVBD द्वारा विशेषता 10 oocytes की (बी) काइनेटिक परिपक्वता पीजी उत्तेजना के बाद 24 घंटे के दौरान परीक्षण किया है। डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में देरी eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए साथ microinjected उन लोगों की तुलना eIF4G1-डी.एन. सीआरएनए साथ microinjected oocytes में मनाया जाता है 24 घंटे के बाद परिपक्व oocytes (सी) का प्रतिशत पीजी उत्तेजना (एन = 4; * पी ​​<0.05)।। डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में कमी eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए की तुलना में eIF4G1-डी.एन. सीआरएनए साथ microinjected उन में मनाया जाता है। (डी) ReversioeIF4G1-गुम्मट उत्परिवर्ती में जोड़ा जाता है जब अनुवाद मशीनरी अभी भी कार्य दिखा रहा है कि eIF4G1-डी.एन. उत्परिवर्ती सीआरएनए और eIF4G1-गुम्मट सीआरएनए साथ microinjected oocytes की एन फेनोटाइप मूल्यांकन। (ई) प्रोटीन oocytes से निकाला और अपने स्तर विश्लेषण immunoblotting द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । मनाया जाता है eIF4G1-डी.एन. परिस्थितियों में ERK2 फास्फोरिलीकरण, राज्यमंत्री और GFP अभिव्यक्ति की perturbations। (एफ) राज्यमंत्री के polyadenylation, Cyclin A1, oocytes से Cyclin बी 1 और हिस्टोन की तरह बी 4 mRNAs पीसीआर प्रवर्धन और प्रवास पर बाद मनाया पीजी के साथ प्रेरित है या नहीं 3% agarose जेल। पीजी उत्तेजना के बाद, आकार> 100 polyadenylation में वृद्धि का सब स्थितियों के लिए पता लगाया है। पहली लेन सीढ़ी से मेल खाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अनुवाद कई neurodegenerative रोगों सहित कई मानव विकारों के physiopathology में शामिल एक तंत्र है। पार्किंसंस रोग में उदाहरण के लिए कई रिपोर्टों वंशानुगत म्यूटेशन 8,12,13 के साथ जुड़े अनुवाद में हानि का सुझाव दिया।

कई सेलुलर मॉडल अनुवाद अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं। इधर, eIF4G1 और eIF4E भागीदारों के 8 के बीच बातचीत को कम करने के रूप में प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्तन कार्य करता है कि eIF4G1 में एक परिवर्तन के translational परिणामों का अध्ययन करने के क्रम में, Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका प्रयोग किया जाता है laevis। यह जैव रासायनिक प्रयोगों के लिए सामग्री की एक पर्याप्त राशि के लिए अग्रणी और डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के विभिन्न चरणों के macroscopic टिप्पणियों की सुविधा, सिंथेटिक mRNA की microinjection को सुविधाजनक बनाने के लिए केवल एक ही विशाल सेल से बना है, क्योंकि यह मॉडल सादगी के फायदे हैं। इस प्रक्रिया को स्थिर सेल की तुलना में भी समय कुशल हैलाइन पीढ़ी। इसके अलावा, डिम्बाणुजनकोशिका तैयारी और आरएनए microinjections के कई प्रोटोकॉल पहले से ही सेल चक्र या nucleocytoplasmic परिवहन 14,15 के अध्ययन के लिए विशेष रूप से वर्णित किया गया है। अनुवाद अध्ययन करने के लिए इस तरह के प्रोटोकॉल की सीमा के बारे में, एक विशेष रूप से ध्यान mRNA की एकाग्रता के बारे में लिया जाना चाहिए। यह एकाग्रता अनुवाद प्रक्रिया तर करने के लिए नहीं है, क्रम में उच्च (120 nl अधिकतम में नहीं अधिक से अधिक 30 एनजी) करने के लिए नहीं होना चाहिए। खाते में इस तत्व ले रहा है, Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका EIF4G1 प्रतिलिपि की एक उत्परिवर्ती फार्म के साथ चित्रा 2 में प्रस्तुत आंकड़ों द्वारा सत्यापित के रूप में प्रोटीन अनुवाद अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल है।

दरअसल, उत्परिवर्तित eIF4G1 की उपस्थिति में, राज्यमंत्री प्रोटीन के अनुवाद में हानि मनाया जाता है और गुम्मट के लिए और स्थिति को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में GVBD के 90% की कमी के साथ सहसंबद्ध। इसके विपरीत, eIF4G1-गुम्मट की overexpression स्तर ओ में संशोधन में परिणाम नहीं थासाहित्य डेटा 16,17 के साथ समझौते में च राज्यमंत्री अनुवाद।

कई जैविक संशोधनों इन परिणामों की व्याख्या हो सकती। कि mRNA मातृ मूल के हैं और पहले से ही पीजी द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन सक्रियण से पहले लिखित राज्यमंत्री जानने के बाद, परेशान तंत्र प्रतिलेखन और अनुवाद कदम के बीच हो जाना चाहिए। उल्लेखनीय है, राज्यमंत्री अनुवाद इसके अनुवाद 18,19 करने के लिए पीजी उत्तेजना के बाद पूंछ के अलावा पाली (ए) पूंछ के बिना एक अव्यक्त mRNA से शुरू है कि आणविक घटनाओं का एक झरना का परिणाम है। इस प्रकार, कई परिदृश्यों सहित संभव हो रहे हैं: अनुवाद दीक्षा में दोष इस विफलता के कारण के रूप में संदेह किया जा सकता है, या स्वयं के द्वारा mRNA polyadenylation, या राज्यमंत्री टेप के mRNA polyadenylation के डिफ़ॉल्ट राज्यमंत्री के लिए प्रमुख कारक के फोस्फोराइलेशन के दोषों को एक करने के लिए ले जा सकता है अनुवादकीय कमी।

इन पिछले 2 तंत्र का आकलन करने के लिए, पश्चिम बंगाल से इन कारकों की अभिव्यक्ति की जांच की है। अभिव्यक्तCPEB फास्फोरिलीकरण के लिए जिम्मेदार फॉस्फोरिलेटेड अरोड़ा ए / Eg2 के आयन स्तर, उत्परिवर्तित eIF4G1 की उपस्थिति में कोई अशांति दिखाया। उसी नस में, mRNA polyadenylation या अन्य mRNA polyadenylation राज्यमंत्री पीजी उत्तेजना (चित्रा 2 एफ) के बाद उत्परिवर्तित eIF4G1 की उपस्थिति में मनाया जाता है। आगे उत्तरी धब्बा प्रयोगों की सिफारिश की जाएगी polyadenylation प्रोफ़ाइल की पुष्टि के साथ ही राइबोसोम mRNA की भर्ती 16 से हो सकता है कि क्या स्थापित करने के क्रम में polysomes की सुक्रोज ढाल अलगाव प्रदर्शन करने के लिए।

तो, झरना की पहली और आखिरी तत्वों का अध्ययन करके, परेशान चरण polyadenylation की घटना के बहाव होने का संदेह था। यह राज्यमंत्री अभिव्यक्ति दोष ERK2 के फोस्फोराइलेशन पर उम्मीद प्रभाव दे दी है कि क्या परीक्षण करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। उत्परिवर्तन की उपस्थिति में, राज्यमंत्री अभिव्यक्ति की कमी फॉस्फोरिलेटेड ERK2 स्तर की कमी करने के लिए और फलस्वरूप एक दोष में करने के लिए नेतृत्वGVBD प्रगति (चित्रा 1 और 2 ई)। इस प्रकार, eIF4G1 उत्परिवर्तन राज्यमंत्री अनुवाद की एक उम्मीद कमी करने के लिए जुड़ा हुआ है। पहले से eIF4F जटिल गठन उपद्रव हो सकता है कि एक सह immunoprecipitation अध्ययन 8 ने सुझाव दिया है eiF4G1-डी.एन. में eIF4G1 अनुक्रम में eIF4E बाध्यकारी डोमेन का विलोपन शायद eIF4G1 / eIF4E बातचीत में कमी का जिम्मेदार है।

इस प्रोटोकॉल सेलुलर जीव विज्ञान में कई दिलचस्प आवेदन किया है। बेहतर दीक्षा कारकों की विशिष्ट डोमेन की भूमिका को समझने के लिए और इन विवो अनुवाद या डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के लिए जरूरी है कि उन लोगों को परिभाषित करने के लिए: यह सेट-अप जैसे सेलुलर जीव विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक सवालों का एक नंबर के लिए प्रारंभिक जांच के रूप में आदर्श है। इस संदर्भ में, Wakiyama एट अल। (2000) eIF4E और PABP 17 के लिए बाध्यकारी डोमेन युक्त eIF4G1 की एमिनो टर्मिनल क्षेत्र के डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में महत्व पता चला है; splic अध्ययन करने के लिएदीक्षा के आईएनजी 20 कारकों; टोपी स्वतंत्र ढंग से 21 में अनुवाद उनके mRNA, की टोपी पर निर्भर अनुवाद और IRES संरचनाओं के निषेध के साथ उदाहरण के लिए eIF4G1 दरार के माध्यम से अपने उद्देश्यों के लिए मेजबान अनुवाद मशीनरी अपहरण वायरस द्वारा इस्तेमाल के लिए तंत्र को समझने के लिए; oocytes इस तरह के अध्ययन के लिए 22 पसंद का मॉडल हैं क्योंकि कोशिका चक्र पर अनुवाद कारकों में उत्परिवर्तन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए; अनुवाद यानी की दीक्षा गवर्निंग मुख्य तंत्र का अध्ययन करने के लिए, टोपी पर निर्भर है और टोपी स्वतंत्र एक या कई प्रणालियों एक प्रोटीन संश्लेषण अशांति में शामिल कर रहे हैं कि क्या परिभाषित करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल के कई रूपों को आसानी से सूर्यास्त method23 या रिपोर्टर mRNA microinjection द्वारा अनुवाद दक्षता के निर्धारण सहित, इन लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पहली बार एक cistron युक्त bicistronic संवाददाता mRNA का जो प्रयोग में Renilla luciferase टोपी पर निर्भर अनुवाद किया जाएगाजुगनू luciferase युक्त दूसरी cistron IRES के माध्यम से अनुवाद किया जाएगा, जबकि संरचनाओं अनुवाद homeostasis को बनाए रखने के लिए तत्पर ठीक दोषों और / या मुआवजा डाल करने के लिए दीक्षा की विधा को परिभाषित करने के लिए सक्षम होना चाहिए। इसके अलावा, इस तरह के luciferase संवाददाता आरएनए प्रयोगों मानव के साथ अधूरा संरक्षण तंत्र के कारण संभावित बाधा पहुँचा विशेष विकास तंत्र पर भरोसा नहीं करने के लिए लाभ प्रदान करते हैं।

इन मौलिक सवालों के समानांतर में, इस तरह के प्रोटोकॉल मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए योगदान कर सकता है कि हानिकारक स्थितियों से निपटने के लिए पहले कदम के रूप में लागू किया जा सकता है। शारीरिक स्थितियों में, अनुवाद दीक्षा कदम ऐसे ऑक्सीकरण, हाइपोक्सिया, तापमान परिवर्तन, विकिरण और पोषक तत्वों के अभाव के रूप में जोर दिया की शर्तों के तहत नियमों के विशेषाधिकार प्राप्त लक्ष्य कर रहे हैं। इस तरह की स्थितियों में, टेप की एक चयनात्मक अनुवाद तनावों के खिलाफ आवश्यक हैं और सेल अस्तित्व होता है कि प्रोटीन एन्कोडिंग।इस प्रक्रिया को अभिभूत किया जाता है, तनाव वैकृत हो जाते हैं और सक्रिय रूप से कई न्यूरोलॉजिकल प्यार के विकास में भाग लेते हैं। सेलुलर तनाव अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग, पेशीशोषी पार्श्व काठिन्य या prion रोग (क्र्युट्ज़्फेल्ड्ट-जेकब) 24 और इन तनावों सामने आया प्रोटीन रिस्पांस (UPR) की सक्रियता के लिए प्रेरित के रूप में कई neurodegenerative रोगों में शामिल कर रहे हैं। इन UPR तंत्र में से एक लाभ यह है कि सक्रियण के माध्यम से एक कम अनुवाद और 25 परिसरों eIF4F और 43s के बीच बाध्यकारी को रोकने के द्वारा अनुवाद रोक के परिणामों के साथ eIF2α सबयूनिट के फोस्फोराइलेशन की ओर जाता है। Xenopus oocytes में, ऑक्सीडेटिव एजेंटों और / या ज्ञात उत्परिवर्तित जीन के अलावा इन तनावों की नकल और उत्परिवर्तित जीन अनुवाद प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है कि क्या स्थापना होगी ऐसी विकृतियों को संबद्ध किया जाना है। उदाहरण के लिए पार्किंसंस रोग, Xenop में eIF4G1 p.R1205H की शुरूआत मेंहमें डिम्बाणुजनकोशिका जुड़े या तनाव या physiopathology 26 में अनुवाद की भागीदारी के सवाल को संबोधित कर सका mRNA polysomal प्रोफाइल के जीनोम चौड़ा विश्लेषण oxidative के लिए नहीं।

डिम्बाणुजनकोशिका के लिए लागू इन सभी आवेदनों इस प्रकार अब neurodegenerative विकारों सहित कई प्यार करने के जुड़े होने के लिए जाना जाता है कि अनुवाद में गड़बड़ी का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं के एक बड़े क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine methane sulphonate Sandoz MS-222 oocytes handling
Forceps Moria Dumont MC40
Streptomycin/penicillin Sigma 781
Sodium pyruvate Sigma P2256
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Tetracyclin Sigma T7660
Veterinarian absorbable Vicryl thread Johnson&Johson Intl JV1205
Collagenase A Roche diagnostics 10103586001
PmeI New England Biolabs R0560S Preparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2O Life Technologies 10977
Sodium Acetate Merck 6268
Absolute ethanol Sigma 02854
Nano Drop Thermo Scientific
TBE 10X Eppendorf 0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/ml Life Technologies 15585-011
mMESSAGE mMACHINE Kit Ambion by Life Technologies AM1344
MOPS Sigma M1254
EDTA Fluka 03609
Agarose Life Technologies 16500-500
Formaldehyde 37% Merck 1.04003.1000
Formamide Fluka 47671
Gel Doc Imager Biorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries Drummond Scientific Company 3-000-510-X microinjection
Replacement Glass 8" Drummond Scientific Company 3-000-210-G8
0.45 µm filter Millipore SLHA025NB
Progesterone Sigma P0130
Hepes Sigma H3375 Western Blot
NaCl Sigma S5886
SDS Biorad 161-0301
MgCl2 Sigma A3294
Bovine serum albumin Sigma A4612
leupeptin Sigma L8511
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6506
PMSF Sigma P7626
sodium vanadate Sigma S6508
Laemmli buffer Biorad 161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX Biorad 456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting system W.E.P. Compagny
Glycine Biorad 161-0718
Tris-HCl Biorad 161-0719
Hybond ECL Membrane Amersham Life Science 10401180
Methanol VWR 20846-292
Ponceau Red (0.5%) Sigma P3504
Tween 20 Sigma P2287
anti-GFP Life Technologies A11122
anti-V5 Santa Cruz Biotechnology sc-58052
anti-Eg2 Santa Cruz Biotechnology sc-27884
anti-Eg2-P Cell Signaling C39D8
anti-ERK2 Santa Cruz Biotechnology sc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204) Santa Cruz Biotechnology sc-7976
anti-Rsk Santa Cruz Biotechnology sc-231
anti-mos Santa Cruz Biotechnology sc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2378
Advanced ECL Detection System Amershan Life Science RPN2135
PBS 1x Sigma P4417 polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) Qiagen 79306
Chloroform Sigma 31998-8
Isopropanol Sigma 278475-1L
RNeasy mini kit Qiagen 74106
RTL buffer  Qiagen 79216
RNAse free DNAse set Qiagen 79254
Primers Eurogentec
T4 RNA ligase 1  New England Biolabs M0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kit Applied Biosystems, Life Technologies 4368813
Taq polymerase Life Technologies 10342020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
  3. Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
  4. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
  5. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  6. Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
  7. Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
  8. Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
  9. Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
  10. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
  11. Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
  12. Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
  13. Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
  14. Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
  15. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
  16. Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
  17. Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
  18. Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
  19. Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
  20. Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
  21. Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
  22. Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
  23. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  24. Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
  25. Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
  26. Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 103, डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता अनुवाद दीक्षा eIF4G1 microinjection polyadenylation neurodegeneration
<em>Xenopus</em> अनुवाद हानि की पहचान के लिए एक मॉडल के रूप <em>laevis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Broucker, A., Semaille, P.,… More

de Broucker, A., Semaille, P., Cailliau, K., Martoriati, A., Comptdaer, T., Bodart, J. F., Destée, A., Chartier-Harlin, M. C. Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment. J. Vis. Exp. (103), e52724, doi:10.3791/52724 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter