Protocol
3 % 아가 로스 2- 히드 록시 에틸의 제조 1.
- 깨끗하고 건조한 100 ml의 유리 병에, 30㎖의 증류수이어서 2- 히드 록시 아가 (아가 로스 VII) 0.9 g을 추가한다.
- 15 초 부드럽게의 혼합물이 소용돌이 전자 레인지. 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때까지이 단계를 적어도 세 번 이상 반복합니다.
- 15 분 동안 용액을 함유 한 병을 압력솥.
- 아가로 오스 솔루션을 추가로 사용하기 전에 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 실온에서 솔루션을 저장합니다.
아래 층의 2. 준비 : 0.6 % 아가 로스 젤
- 취급시 피펫에 응고에서 아가로 오스를 방지하기 위해 5 ㎖와 37 ° C 배양기에서 10 ml의 피펫 사전 따뜻한 몇 가지.
- 부분적으로 병 뚜껑 마이크로파 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가로 오스 용액을 느슨하게. 그런 다음, 부드럽게 또 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다. 주의 : 아가 소용돌이 때주의자체 솔루션 용액이 공기에 노출 이상 유출 할 수있을 때까지 상승하기 때문이다.
- 병에 잔류 고체 젤, 몇 초 동안 전자 레인지가있는 경우.
- 조기 고화 아가 용액을 방지하기 위해 다음 단계에서 45 ° C의 물 중탕에서 아가로 오스를 포함하는 용액을 보관 용기.
- 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어. 참고 : MCF10DCIS 미디어는 DMEM / F12, 5 % 말 혈청, 5 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 구성되어 있습니다.
- 전송 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 예열 피펫을 사용하여 3 % 아가 로즈 용액 3 ㎖.
- 즉시 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 12 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합 원뿔 튜브를 반전. 그것은 식민지 나중에 계산을 방해하므로 모든 거품을 형성하지보십시오.
- 부드럽게 기포를 형성하지 않고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에,이 혼합물을 2 ㎖를 추가한다.
- 6 웰 배양 판 horizonta을 품어에서야 1 시간 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 혼합물이 응고 할 수 있도록합니다.
- 혼합 응고 후, 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 바닥 층을 사용할 준비가 된 것입니다.
셀 함유층 3. 제조 : 0.3 % 아가로 스겔
- 를 Trypsinize MCF10DCIS 세포를 4 × 104 / ml의 세포 농도로 희석.
- 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 피펫 및 전송을 사용하여 3 % 아가로 오스의 2 mL를 취하여.
- 즉시 원뿔 튜브에 MCF10DCIS 미디어의 8 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 모든 거품을 형성하지 마십시오.
- (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 MCF10DCIS 세포 (4 × 104 / ㎖) 2 mL를 취하여 BB-CLA로 처리.
- 1 : 1 희석, 0.6 % 아가로 오스와 세포를 섞는다.
- 세포 혼합물을 아가로 1 ㎖를 취하여 부드럽게 6 웰 배양 (P)의 바닥층 상에 추가후반 (2 × 104 세포 / ㎖).
- 상단 층이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 판을 놓습니다.
- 혼합 응고 후, 공급 층을 추가하기 전에 일주일 동안 37 ° C의 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
세포층 4. 준비 : 0.3 % 아가 로스 젤
- 전자 렌지 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가 용액. 부드럽게 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다.
- 45 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션 병 평형.
- 37 ° C의 물을 욕조에 MCF10DCIS 미디어를 따뜻하게.
- 50 ML 원뿔 튜브에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 9 ml의 3 % 아가로 오스 액 1ml를 섞어 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 공기 방울을 형성하지 마십시오.
- BB-CLA와 혼합물 (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 치료.
- 부드럽게에 대한없이 (이 혼합물 1 ㎖를 추가밍 바닥 연질 층을 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에) 거품.
- 혼합물이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 플레이트를 놓습니다.
- 피더 층이 굳은 후, 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다.
- 콜로니 형성이 관찰 될 때까지 새로운 매체를 사용하여 세포를 보충하기 위해 기존의 세포층에 0.3 % 아가로 오스 / 중 / 처리 용액 1 ㎖를 중첩하여이 공급 절차 주간를 반복합니다. 주 : 한천 부드럽고 피더 레이어 것은 따라서, 피더 레이어에서 추가 영양분 용이 세포에 도달하는 셀 - 함유 층으로 확산되며, 매우 부드럽고.
5. 데이터 수집
- 소프트 한천에 세포 성장 2.5 주 후, 각 웰을 광학 현미경을 사용하여 콜로니 수를 카운트. 정량을 용이하게하기 위해, 투명도에 그리드를 인쇄에 그리드를 부착6 웰 플레이트는 세포가 계산하는 동안 어디에 찾을 수 있도록 도와줍니다. (각 식민지의 직경에 의해 정량화 등) 식민지의 크기가 달라질 수 있기 때문에, 채점되는 식민지 결정하는 기준 식민지 크기를 미리 정의. 예를 들어, 70 μm의 또는 데이터 분석의 큰 콜로니의 크기를 포함한다.
- 더 콜로니 형성과 미래에 대한 계산을 방지하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 이 건조 겔을 방지 파라 필름 6 웰 배양 접시를 밀봉.
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Representative Results
소프트 한천 콜로니 형성 분석은 암세포의 종양 유발 문서화 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 반고체 매트릭스 선택적 앵커리지 독립적 인 방식으로 증식 할 수있는 세포의 성장을 선호한다는 것이다. 이 특성은 주로 암세포가 아닌 일반 세포에 의해 발휘된다. 우리는 주로 약물에 의해 종양 성장 억제의 효과를 테스트하고 유방암 세포의 종양 유발에서 과발현 또는 PADI 유전자를 포함하여 우리의 관심 유전자의 고갈의 효과를 테스트하기 위해이 기술을 사용한다. 여기서는 PADI2 MCF10DCIS 과발현 세포의 종양 형성 억제에 BB-CLA의 효과 평가 (도 1 및도 2).
결과는 BB-CLA 크게 MCF10DCIS 세포 유래 콜로니 형성을 억제하는 것을 보여준다.도 3은 도시, 그 PADI 억제제의 존재하에, t DMSO 제어에 비해 모두 여기 콜로니 형성 및 콜로니 크기가 감소했다. [주 :. BB-CLA는 DMSO에 용해시키고, 이에 따라, DMSO는 대조군으로 사용 하였다] BB-CLA 대한 콜로니 크기 MCF10DCIS 세포가 100 ㎛ 인 (20)의 범위 내에서 현저 하였다 처리 동안 DMSO 대한 콜로니 크기 제어 성장의 2.5 주 후 70 μm의 150의 큰 범위를 나타내었다.
70 ㎛의보다 큰 콜로니를 계수하고 (도 4)를 분석 하였다. 만 1,967 식민지가 부드러운 한천 문화의 2.5 주 후에 BB-CLA 투여군에서 관찰되었다 반면 DMSO 제어에 3536 식민지의 평균이 있었다. 이것은 PADI 억제제 유방암 세포의 중요한 종양 억제 (MCF10DCIS 세포)를 나타내는, 1 μM BB-CLA의 존재하에 평균 콜로니 형성의 44 % 감소를 나타낸다.
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BB-CLA의 그림 1. 화학 구조.
소프트 한천 콜로니 형성 검정을위한 프로토콜의도 2 개략도. 6 웰 배양 플레이트의 각 웰은 제 0.6 % 아가 로스 겔 (바닥 층)으로 코팅 하였다. MCF10DCIS 세포 및 BB-CLA 억제제 (1 μM) 또는 DMSO (대조군)를 함유하는 0.3 % 아가 로스 겔 혼합물은 0.6 % 겔의 상부에 적층 하였다. 일주일 후, 0.3 % 아가 로스 겔 혼합물 (BB-CLA 함유) 연질 층의 상부에 첨가 하였다. 2-4주 후, 콜로니 형성이 관찰되었다 및 데이터 분석을 위해었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MCF10DCIS 콜로니 수의 그림 4. 정량 BB-CLA 치료. MCF10DCIS 세포는 BB-CLA (0 μM (DMSO) 또는 1 μm의 BB-CLA)의 서로 다른 농도로 부드러운 한천에서 성장했다 후. 2.5 주 후 개별 콜로니 큰 번째70 μm의 계수한다. 실험은 4 회 반복 하였다 (N = 4). 대조군과 처리 된 샘플 사이의 총 세포 수의 차이는 통계적 유의성 두 샘플 스튜던트 t 검정 (* p <0.005)에 의해 결정 하였다.
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Discussion
소프트 한천 콜로니 형성 속도는 세포의 종류에 따라 달라 9. 따라서, 셀의 수는 최적화하고 그에 따라 조정되어야로 시작. 제안 된 초기 범위는 잘 6- 웰 플레이트를 이용하여 당 4~10 X 10월 2일부터 1일까지 X (5) 사이의 세포이다. 또한, 콜로니 크기는 각 셀의 성장 속도에 따라 변화한다. 따라서, 콜로니 크기 소정 컷오프 하류 정량적 분석에 대한 개별 콜로니 주석 필요하다. 여기서, 더 이상 70 μm의 도금은 초기로부터 유도되지 않은 세포 증식의 포함을 피하기 위하여 정량 콜로니.
3D 아가 로스 젤을 할 때 최적 성장을 위해, 그것은 일반적으로 2 차원 세포 배양에 사용되는 동일한 세포 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 종종 매체를 변경하면, 따라서 세포가 새로운 매체에 적응할 수 있도록하기 위해 추가 계대를 필요로, 세포의 성장 속도를 변경하기 때문이다. 예를 들면, MCF10DCIS 세포는 RPMI-1640, DMEM 또는 DMEM / F12 배지에서 최적으로 성장시킬 수있다. MCF10DCIS 배양액은 DMEM / F12를 RPMI-1640에서 변경되는 경우에는, 세포 증식 속도의 현저한 감소가있다. 또한, 치료는 혈청없이 콜로니 형성은 열을 억제 할 것이다 때문에 일정 수준의 혈중 농도를 유지하기 위해주의해야한다. 아가로 오스는 극초단파 후 또한, 병이 매체는 셀의 과열을 방지하기 위해 세포를 포함하는 혼합 전에 45 ° C의 수조에서 평형을 허용한다. 아가 로스가 실온에서 급속하게 고화 감안할 때, 우리는 또한 모든 피펫, 6 웰 배양 플레이트를 처리하는 동안 조기 고화를 방지하기 위하여 아가로 오스 용액을 첨가하기 전에 37 ° C의 배양기에서 예열되는 것을 추천한다.
소프트 한천 콜로니 형성 기술은 암 세포주의 범위에서 발암을 측정하기위한 중요한 도구이지만, 일부 라인은 소프트 아가에서 성장하지 않는다. Anot방법 그녀 잠재적 단점은 소프트 아가로 도금되면 생세포를 복원 할 수없는 점이다. 화합물은 생체 이용률이 더 짧은 기간이있는 경우 또한, 상기 공급 단계가 더 자주 (즉, 매일) 수행되어야하며 샘플은 7 일 이내에서 수집 될 필요가있을 것이다. 콜로니 크기에 대한 임계도 여전히 관찰 될 수있는 샘플들 사이의 전위차를 허용하면서 감소 될 필요가있을 것이다. 이러한 경우, 제어 - 위양성 및 위음성 결과를 최소화하기 위해 실험적인 매개 변수를 최적화하기 위해 도입 될 필요가있다. 많은 수의 샘플을 테스트 할 때 또한,이 기법은 시간 소모적이고 어려운 일 수있다. 그러나, 기술의 진보는 이러한 한계의 일부를 극복하는 데 도움이 있습니다. (이 원고에 설명 된대로) 기존의 부드러운 한천 분석은 일반적으로 6 웰 배양 플레이트 또는 6mm 배양 접시를 사용합니다. 자동 플레이트 리더로, 그러나, multipl즉 샘플을 384- 웰 플레이트 (11)에 처리 될 수있다. 예를 들어, 연구자들은 따라서 수동으로 콜로니 번호 11를 계산하는 필요성을 제거, 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 예컨대 알라 마르 블루 등의 염료 및 테트라 졸륨 염료 및 콜로니 종양 세포를 미리로드. 이러한 높은 처리 능력, 따라서 대규모 항암제 스크린의 의무이다.
요컨대, 연질 한천 분석은 약물, 호르몬에 대한 그들의 감도에 관해서 암세포 (유방암, 전립선 암, 난소 암 등)의 넓은 범위의 종양 발생을 평가하기 위해 사용될 수있는 유용한 임상 전 기법 열, 저산소증 및 기타 처리 조건의 다수. 분석은 더 나은 암 진행의 메커니즘을 이해하고 새로운 암 치료의 항 종양 가능성을 테스트 할 암 연구를위한 간단하고 유익한 도구를 제공하고 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
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