Abstract
Kalsiyum vasküler dokularda çok sayıda fizyolojik süreçte önemli bir düzenleyicidir. En endotel ve düz kas fonksiyonları yüksek hücre içi kalsiyum ([Ca2 +] i) ve nitrik oksit (NO) değişikliklere bağlıdır. Amacıyla iki foton mikroskobu ile boyaları [Ca 2 +] i, NO ve alt molekülleri vazokonstriktörlere ve vazodilatörler yanıt olarak bir kan damarı tarafından işlenir, biz kalsiyum etiketleme geçerli yeni bir teknik (ya da NO-etiketleme) geliştirdi nasıl anlamak için İzole kan damarlarındaki kalsiyum taşıma (veya NO üretimini) ölçmek için. Burada anlatılan sıçan, etiket kalsiyum veya HAYIR endotel veya düz kas hücrelerinin içinde aort izole ve görüntü kalsiyum geçici (veya HAYIR üretim) fizyolojik aşağıdaki iki foton mikroskop kullanarak nasıl gösterir bir ayrıntılı adım-adım prosedürü ya da farmakolojik uyaranlar. yöntemi kullanmanın yararları çok yönlüdür: 1) aynı anda mümkündürly endotel hücreleri ve farklı uyarıcılara tepki olarak, düz kas hücreleri, hem de geçici kalsiyum ölçülmesi; 2) görüntü, endotelyal hücreler ve nativ ortamda düz kas hücrelerinin bir sağlar; 3) Bu yöntem hücre içi kalsiyum veya HAYIR değişiklikler ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir karşı çok hassastır; ve 4) tarif edilen yaklaşımı, bu reaktif oksijen türleri gibi diğer moleküller, ölçümü için uygulanabilir. Özetle, iki foton lazer emisyon mikroskobu uygulama geçici kalsiyum ve izole bir kan damarı endotel ve düz kas hücrelerinde NO üretimini yüksek kalitede nicel verilerin sağlanan ve vasküler fonksiyonları düzenleyen mekanizmaların anlayışımızı teşvik etmiştir izlemek için.
Introduction
Kalsiyum, endotel ve düz kas hücreleri gibi vasküler hücreler içinde temel bir ikinci mesajcı olan. Bu vasküler kasılma için birincil uyaran ve endotel içinde YOK nesil yoluyla etkileri de dahil olmak üzere, vasküler dilatasyon önemli bir rol oynamaktadır. Nedeniyle görüntüleme teknolojilerinin sınırlamaları nedeniyle, sağlam geminin içinde kalsiyum işleme gözlemlemek neredeyse imkansız olmuştur. İki foton görüntüleme sistemleri ve yeni kalsiyum yaratılması veya HAYIR etiketleme boyalarının geliştirilmesi, kalsiyum dinamikleri ve damarsal içinde NO üretimini anlamaya başlamak için yeterli derinlik ve çözünürlükte görüntü mümkün kılar.
İki foton mikroskop son zamanlarda doku, organ ve çünkü derinden düşük eşiğe ve yüksek sinyal duyarlılığı ile dokulara nüfuz üstün yeteneği bile tüm hayvan çalışmalarında uygulanmıştır. 1,2 illuminat iki foton uyarma dar spektrumluiyon odak noktası olan ve olmayan descanned dedektörlerin kullanımı iki foton mikroskopi geleneksel konfokal mikroskobu üstündür nedenleri vardır. Mikroskopisi nedeniyle oto-floresan ve konfokal iğne deliği içine out-of-focus ışık saçılması için gerekli doku derinlikte yüksek kaliteli görüntüler üretemez. Sonuç olarak, [Ca2 +] i sinyal ölçmek için iki foton mikroskopu kullanılarak bir yöntem ve yüksek bir çözünürlüğe ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip olduğu gibi, tek tek kan taşıyıcı hücrelerin NO üretimi geliştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan deney prosedürleri Wisconsin Tıp Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi.
Sıçan Aort 1. İzolasyonu
- Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakımı) veya başka bir IACUC ile sıçan uyutmak yöntemi onayladı.
- Bir yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. Karın organları açığa çıkarmak amacıyla, deri ve deri altı karın dokusu sayesinde küçük bir ventral orta hat kesi yapmak. Şekil 1 'de gösterildiği gibi kullanılması gazlı bez yavaşça aort ve vena cava açığa çıkarmak için bağırsak saptırır.
- Kısaca, bağ dokusu ve vena kava gelen aort teşrih künt. Böbrek mümkün olduğunca yakın aort kapalı kravat, dikiş kullanma. Aort 2 cm ve 15 ml konik tu yerleştirin - yaklaşık 1 teşrihNormal fizyolojik tuz çözeltisi içeren olabilir (PSS; mM olarak: 140 NaCl, 1.2 MgCl2, 2 CaCl2, 4.5 KCI, 6 Glikoz, 10 HEPES), buz üzerinde.
- Aort izole edildikten sonra, onaylanmış IACUC protokollere göre hayvan euthanize. Olmayan tüm yaşam bitiminde prosedürleri hayvanın insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanları euthanize. 3
- Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, forseps ince uçlu ve microscissors aort kapalı yağ ve bağ dokusu teşrih. Aort temiz kez uzunlamasına aort kesip daha sonra buz üzerinde PSS yerleştirin.
2. Boya Yükleme ve Kuluçka
- Pipet alüminyum folyo ile kaplanmış olan tek tek 500 ul tüplere, DMSO-bazlı çözelti içinde temin edilmektedir 1mM Fluo-04:00 boya, 7 ul. Zamanla boya özelliklerini korumak için -20 ˚C de dondurucuda saklayın. Not: Bu yüzden aliquotedmel çözümler, en az altı ay stabil olmalıdır.
- Kullanımdan önce, boya çözeltileri açmadan önce oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Kullanımdan hemen önce çalışan çözümleri hazırlayın. Daha sonra kullanılmak üzere sulandırılmış reaktifi tutmayın.
- Bir kalsiyum içeren PSS 450 ul DMSO çözeltisi içinde çözülmüştür hazır 1 mM Fluo-04:00 boya 7 ul ekleyin. Asetoksimetil (AM) esterleri dağıtmak yardımcı ve kalsiyum boya yükleme iyileştirmek için yükleme kokteyli olmayan DMSO bazlı% 10 Pluronic Asit çözeltisi 40 ul ekleyin.
- 1 saat boyunca (as 2.3 açıklanmıştır) yükleme kokteyli içeren 500 ul tüpler içine disseke aorta yerleştirin. Oda sıcaklığında bir döner çalkalayıcı üzerinde folyo ve yer ile tüm tüpler örtün.
- Damar NO üretimini izlemek için DAF-FM diasetat boya kullanın. 450 ul PSS, 40 ul pluronik asit ve 10 mM DAF-FM diasetat 5 ul ihtiva eden bir çözelti içinde aorta inkübe edin. (2.3 açıklanmıştır) kalsiyum kuluçka protokolüne benzer, aort yerleştirinoda sıcaklığında Sonraki 30 dakika, ardından 4 ° C'de 30 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde folyo ve yerine kaplı NO boya çözeltisini ihtiva eden bir 500 ul bir tüp içinde.
- NO üretimi ölçüldüğünde, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bir kontrol olarak NO üretimini engellemek için, endotel NO sentaz engelleyici, L-NAME kullanın. Bu işlem için, (oda sıcaklığında) inkübasyon son 30 dakika süreyle (2.5 de anlatıldığı gibi) kokteyl 100 nM L-NAME ekleyin.
3. Lazer Tarama İki foton Mikroskopi Protokolü
- Dışı boya kaldırmak için temiz PSS 3 kez - 1 saat inkübasyondan sonra, aorta 2 yıkayın.
- Normal PSS veya Ca 2 + -ücretsiz tampon (deney protokolünde bağlıdır) ya içeren bir silikon kaplı çanak aort aktarın. Silikon ile temas adventisya aşağı silikon kaplama üzerine aorta Pin (yani çanak açılış maruz kalan endotel lümen) μ şeklinde işaretçilerine kullanarak. Alternatif olarak, bir dilim Anchor kullanınızgara veya tutkal dokusunu düzeltmek için.
Not: stres ve olası mekanik eserler, transferi azaltmak ve Ca 2+ -ücretsiz çözüm aort düzeltmek ve 5 beklemek için - deney başlamadan önce 10 dakika. - Peristaltik bir pompa ya da ilaçların, otomatik veya manuel uygulama ya da hücre-dışı çözelti değişen silikon kaplı plakaya bir şırınga bağlayın.
- Dik iki foton mikroskop burun parçasının altında çanak yerleştirin ve yüklemek ve numune üzerinde 25 × (NA 1.05 ve çalışma mesafesi 2 mm) su daldırma objektif lens yerleştirin. Not: Bu özel bir mercek mevcut değilse normal bir amaç ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sinyal çözünürlüğünü artırabilir, çünkü özellikle iki foton görüntüleme için üretilmiş bir objektif kullanın.
- Yazılımını kullanarak iki foton lazer etkinleştirin (lazer pompa ve açmak için başlar). Dinle 820 nm lazer uyarım.
- Epifloresans kullanarak, aort bulmak ve üzerine objektif odakKaba ayarı kullanarak endotel yüzey.
- Uyarma lazer modu kilitli olmayan descanned dedektörler ilgileniyoruz ve beklenen emisyon spektrumları uygun emisyon filtreleri yüklü olmasını sağlamak, iki foton lazer tarama moduna mikroskop Anahtarı. Not: Burada FV10-MRL / R (495 nM 540) kullanılmıştır.
- Yaklaşık% 5, lazer gücünü kullanarak canlı taramayı başlatmak ve ince endotel hücrelerini görselleştirmek için objektif odak.
Not: Normal PSS inkübe zaman endotel hücreleri güçlü bir floresan sinyal sergileyecek. Gemi, kalsiyum içermeyen tampon maddesi içinde inkübe edilir, bu fark daha zayıf olacaktır. endotelial hücreler açılır aort üst ve düz kas hücreleri, sadece endotel hücreleri (bakınız Şekil 2) aşağıda görülebilir mevcut olacaktır. Kan damarları düz ne de düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin her ikisi de mevcut yerler olacak ne olduğundan. </ Li> - Hücreler odak olduğunda, mikroskop yazılım programı hızlı tarama modunda sıralı görüntüleri (raster tarama, 1.1 sn kare toplama frekansı ile 512 x 512 piksel pencere) toplamak için. Flu-4:00 floresan paralel olarak, damar daralması değişiklikleri algılamak ve daha iyi deneysel koşullar görselleştirmek için ışıklı görüntüleri bulaşan toplamak.
- Bazal sinyal görüntüleri toplandıktan sonra, harici bir çözelti içinde Ca2 + iyonu konsantrasyonu değiştirmek ya da yavaş yavaş peristaltik pompa görüntüleme sırasında kullanarak farmakolojik uyaran maddeler uygulanır. Yüklenen hücrelerin içindeki floresan sinyal artışı dikkate alınmalıdır.
Not: Endotel hücreler, akış değişikliklere bu nedenle Ca 2+ veya hiçbir sinyal farmakolojik aktivatörleri uygulanmasından önce, düşük laminer uygulamaları ve araç test kullanılması önerilir yanıt. Fluo-4 (Fluo-4 i için ayrışma sabiti yüklü gemiler nM konsantrasyon değerlerine hücre içi kalsiyum yeniden hesaplamak içins 345 nM), flüoresan yoğunluğu, taban çizgisinde ve Genişleme ve MnCI2 eklenmesinden sonra kaydedilebilir. 4
4. Görüntü İşleme ve Hesaplamalar
- Download ve Fiji görüntü işleme paketini yükleyin.
- Fiji görüntü dosyasını açın. İstendiğinde dosyasını içe üzerine, kanallar (iletilen ışık ve florasan sinyali) bölün. Veri analizi için sadece floresan sinyal kullanın.
- Fiji programı kapsamında, analiz sekmesini tıklayın ve araçları seçeneğine gidin. Araçlar seçeneği altında, ROI yöneticisi diyor sekmeyi bulmak ve üzerine tıklayın; Yeni bir pencere açılacaktır.
- Bundan sonra, analiz sekmesi altında ayarlanan ölçümlerine tıklayın. Özel ilgi ölçümleri seçin. Kalsiyum geçici ölçümler için ortalama gri değer seçeneğini kullanın.
- Dairesel iz aracı ile, ilgi alanları (ROI) bölgelerini izlemek ve her R ROI yöneticisi ekranda "eklemek" butonuna tıklayınız başlarOI. Bir kez ilgi tüm hücreleri ROI yöneticisi penceresinde, "daha" sekmesi altında Çoklu Tedbir seçin takip edilmiştir. Bir elektronik tabloya bu ölçümlerin hepsi doğrudan ölçümleri kaydetmek veya kopyalayıp yapıştırın ya unutmayın.
- Açık * .txt dosyası veya Excel Fiji ve yeni bir çalışma sayfasına Kökeni numaraları aktarın. Not: Alternatif olarak, daha fazla analiz için Sigma Plot veya Prism gibi herhangi bir program kullanın.
- Origin programı kapsamında, tüm geçici tepkilerin bir bakış gözlemlemek için Line + Sembol menüsü → Plot kullanın. Tepkisiz hücreleri kaldırın.
- Zaman ölçeği (X ekseni) iz numarasını yeniden hesaplayın, Sütun → Set Sütun Değerlerini kullanın ve (bizim durumumuzda 1,1sn olarak) resim koleksiyonu frekansına iz numarası sütunu çarpın.
- Mean (Y ekseni) ve Standart Hata izleme hesaplamak için seçilen tüm kayıtlar için Satır Analysis → İstatistikleri kullanın. Hücrelerin mevcut grup Line + Sembol → Konu için son Grafik çizilir.
- meaolarak takip n kalsiyum geçici hesaplama açıklanmıştır.
- Kökeni program dahilinde toplam kalsiyum salınımı için, daha sonra, Grafik tıklayın menüsü Analizi → Matematik kullanın → entegre edin. Eğri altında kalan alan toplam ayrılmaz Sonucu giriş görünür.
- (X ekseni geçici yanıt sonuna kadar maksimum aralığı seçin) Analiz → Doğrusal olmayan Curve Fit → Seçiniz Veri Seti: Geçici kinetik için Graph üzerine tıklayın, ardından menüyü kullanabilirsiniz. Bitti → Üstel Çürüme 1 → Seç Fonksiyonu → Montaj başlatın.
Üstel uydurma Grafik penceresinde görüntülenir ve Giriş Sonuç: Not. Elde edilen veriler (değerler) yayımlanan kalsiyum toplam miktarını temsil ve kanalların kinetik geçici yanıt aracılık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğru vasküler fizyoloji (damar genişlemesi ve vazokonstriksiyon) kalsiyum katkısını değerlendirmek için, bir protokol endotel hücreleri ve izole sağlam aortlarından düz kas hücrelerinin hem kalsiyum boyalar yüklemek için tasarlanmıştır. Şekil 1 'de gösterilen kurulmuş, genel deney, izolasyon ve görüntüleme önce kabın hazırlanması için temel strateji gösterir. Kısaca, sıçan aort izolasyonundan sonra, yağ ve bağ dokusu temizlenmeli ve uzunlamasına yarık. açılan aort Daha sonra hafif çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında protokolde tarif inkübe şekilde önceden hazırlanmış yükleme kokteyli ihtiva eden bir folyo kaplı 500 ul bir tüp içinde yerleştirilmelidir. İnkübasyondan sonra, aort yukarı doğru silikon ve lümen yakın adventisya sahip bir silikon kaplı plaka üzerine aşağı tuş, yıkanmalı ve görüntüleme için bir dik iki foton mikroskop aktarılır.
Once aort mikroskop konulmuş ve damar odakta olduğu, endotel hücreleri güçlü floresan emisyon (Şekil 2A) tarafından bulmak kolay olmalıdır. endotel hücreleri de gemi aşağı tuş zaman öncelikle endotel hücreleri oluşur geminin, lümen, yukarı dönük olmalıdır çünkü odak noktası haline gelmek için ilk nesne olacak. Endotel hücreleri görüntülemeye ek olarak, düz kas hücreleri (Şekil 2B) görebilir yer olacaktır. Böylece endotel ve düz kas hücrelerinin her ikisi de aynı görüntüleme alanının (Şekil 2C) içinde tespit edilebilir. Aynı görüntüleme alanı içinde görüntünün hem vasküler hücre tiplerine kabiliyetine sahip bu hücreler ortaklaşa, henüz bağımsız, farklı agonistleri ve uyaranlara yanıt nasıl daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Bu yöntemin kullanılmasını göstermek için, aort hücrelerinin ölçümler ilave yanıt vermecetylcholine (ACh), özellikle endotele içinde değişikliklere neden güçlü bir vazodilatör, tespit edilmiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, normal bir PSS kuluçkaya ise endotel hücreleri kolayca görülebilir. ACh (Şekil 3B) ilave edildikten sonra, endotel hücre flüoresansı artar hücre içi kalsiyum içeriği de artmakta olduğunu göstermektedir. ROI veya endotel hücrelerinden yayılan flüoresans ölçümü, Şekil 3C 'de gösterilmiştir. ACh ilave edilmesinden sonra, hücre içi kalsiyum içeriği artar hızlı ve daha sonra yavaşça başlangıç değerine geri döner. ACh yanıt olarak endotel hücreleri içinde kalsiyum artış önceki raporlarla tutarlıdır. 5,6
Kalsiyum çalışmalarına benzer şekilde, bu protokol endotelyal NO üretimini tespiti için uygundur. Gösterildiği gibi, bu deneyler için, aortik endotel hücreleri DAF-FM diasetat boyası yüklendiŞekil 4A. Bu yaklaşım, son ACh uyarılmasına yanıt olarak bir Ca 2 + -bağımlı bir şekilde NO üretimi artar. 6 Önemli olarak, L-NAME, bir endotelyal NO sentaz inhibitörü ile muamele edildikten sonra, bu yanıtı (Şekil 4B) bloke edilmiştir olduğunu göstermek için kullanılmıştır.
Bu teknik, hücre içi kalsiyum ölçülmesi için tatbik edilebilir nasıl bir diğer temsili bir örneği, kalsiyum ihtiva eden çözelti, kalsiyumsuz tampon maddesi içinde inkübe edildi, bir kaba ilave edildi video 1 'de gösterilmiştir. Aort başlangıçta (videonun başında) kalsiyum ücretsiz tampon inkübe edildiğinde, endotelyal hücreler hücrelerde kalsiyum düşük seviyelerini gösteren zayıf floresan bulunmaktadır. Ancak, normal PSS ilavesinden sonra, hücreler hemen artan [Ca2 +] i konsantrasyonunun ve yüksek yoğunluklu flüoresans yayan yanıt verirler. Bu deney hücreleri hayatta olduğunu göstermektedir vedış uyaranlara duyarlı. Bu deney aynı zamanda yüksek kaliteli veri onun verimi ile bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrular.
Şekil 1. Aort İzolasyon ve Deneysel Set Up. 1) sıçanları anestezi sonrasında, karın bir kesi yapmak ve bağ dokusu ve vena kava dan aorta izole. 2) aort ekstre edilmesinden sonra, yağ ve bağ dokusu damar temizlik ve boylamasına keserek kap açın. 3) hafif bir sallama ile oda sıcaklığında 1 saat için Fluo-04:00 boya kabı inkübe edin. 4) inkübasyon sonrasında, aort yıkama yukarı bakacak lümen, bir silikon kaplı plaka üzerine pin ve dik iki foton mikroskop aşamasında aktarmak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Görüntüleme düz kas ve endotel hücreler. Kalsiyum boya yeterli Yüklemeden sonra, bu düz kas hücrelerinin ve endotel hücrelerinin her iki görüntü mümkündür. (A), en iyi, bir izole edilmiş sıçan aort endotelyal hücrelerin Fluo 4 floresans bir örnektir. Alt, floresan görüntü (benzer B ve C için) iletilen ışık görünümü ile birleşti olduğunu. (B), bir izole edilmiş sıçan aort yumuşak kas hücrelerinin Fluo 4 floresans bir örnektir. Nedeniyle aortun muntazam olmayan kalınlığa (C), bu, düz kas ve endotel hücrelerinin her ikisi de mevcut görüntü bölgeleri de mümkündür. Ölçek çubukları gösterilir. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızBu rakam.
ACh Cevaben endotel hücrelerinde geçici kalsiyum Ölçüm Şekil 3. (A). Aort ilk hazırlanmış ve alt-sınır kayıtlarından normal PSS tampon maddesi içinde inkübe edildi. Asetilkolin (ACh), hücrelerin içinde kalsiyum artan seviyelerini gösteren gelişmiş endotel hücreleri (ROI) tarafından yayılan floresan sinyal ilavesinden sonra (B). Ölçek çubuğu gösterilir. (C) Ach tepki olarak endotel hücrelerinin kalsiyum geçici Origin yazılımı kullanılarak hesaplanan bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kalsiyum konsantrasyon içinde Değişiklik Endotel Hücre Duyarlılık Video 1. Örnekn. Fluo-04:00 boya hazırlanması ve inkübasyondan sonra, aort, kalsiyum içermeyen tampon maddesi ile yıkanmış ve iki foton mikroskop kademesine yerleştirildi Kademe. Damar kalsiyum içermeyen tampon maddesi içinde yerleştirildiğinde, endotelyal hücrelerin en zayıf floresan. Normal PSS ilavesinden sonra, endotel hücreleri, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu artar ve güçlü bir floresan sinyali yayan yanıt verirler.
Video isoltated sıçan aort endotel hücreleri. NO üretiminin 2. Örnek DAF-FM diasetat boya hazırlanması ve inkübasyondan sonra, aort iki foton mikroskop kademesine yerleştirildi Kademe. Banyo çözeltisine Ach eklenmesinden sonra, endotel hücreleri, hücre içi N arttırarak cevapO üretim ve güçlü bir floresan sinyal yayan. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel Bakış. Daha iyi damar fizyolojisi HAYIR kalsiyum katkısını anlamak ve için, yeni bir yöntem ölçmek için geliştirilen [Ca 2 +] i ve NO düz kas ve izole bozulmamış aorta endotel hücreleri içinde. 1) Mekanik izolasyon ve hazırlık (enzimatik olmayan sindirim) Geminin: Birlikte, bu protokol bu kritik adımlardan oluşur. Optimum fizyolojik kayıtları elde etmek mümkün olduğunca sağlıklı ve sağlam dokuyu tutmak önemlidir. Pluronik asit ile 2) kalsiyum etiketleme boyada inkübasyon veya NO etiketleme boya başka kaplar türleri için, farklı bir pluronik asit ve inkübasyon süresi, test edilmesi gerekebilir, ancak, kritik öneme sahiptir. Izgara ve iğnelerle silikon kaplı çanak aortun 3) Uygun tespit iki foton mikroskop ile görüntüleme sırasında istikrarlı bir görünüm sağlayacaktır. Gemi daraltmak ve dilate Çünkü, bu gemi prope olduğundan emin olmak için önemlidirrly doğabilecek hareket eserler önlemek için çanak sabit. Sonuçların 4) miktarının belirlenmesi. Geçici genlik daima hücrelerin fizyolojik özelliklerini karşılaştırmak için en iyi parametre olmayabilir lütfen unutmayın. geçici integrali nedeniyle toplam [Ca 2 +] i veya HAYIR serbest bırakmak için iyi bir fark gösterebilir.
Deneyler doğru yapıldığında, o izlemek mümkündür [Ca 2 +] i (veya NO düzeyleri) Video 1 & 2. Ex vivo hazırlık kombinasyonu Şekil 3 & 4 ve gösterildiği gibi uyaranlara yanıt değişiklikler ve İki foton görüntüleme kullanımı daha iyi sinyal çözünürlüğü ve vasküler dokularda hücre içi süreçlerin hassas ölçümler sağlayabilir. Burada, bu teknolojiler klasik olmayan rasyometrik Ca 2+ ve NO göstergelerin (Fluo-4 AM ve DAF-FM diasetat, sırasıyla), ile birlikte uygulanmıştırgeçici kalsiyum ve izole bir bütün aortun bireysel hücrelerin NO üretimini ölçmek. Biz bu tekniğin mekanizmaları düzenleyen ilgili bilgimizi iletmek için yardımcı olacağına inanıyoruz [Ca 2 +] i ve farklı vasküler hücre türleri içinde NO düzeyleri.
Değişiklikler ve sorun giderme. Hassas iyonoforlar tek düz kas hücrelerinde Ca 2 + sinyalizasyon ölçülmesi temel ilkeleri başlangıçta 1985 yılında yayınlanan 7 bir lazer tarama konfokal mikroskop ve izole istihdam var ca bireysel vasküler hücrelerde 2+ seviyeleri görüntüleme için son yöntemlerin çoğu ya kültürlü hazırlıklar. Kan damarları gibi dinamik dokular için, kalsiyum veya mikroskopi tabanlı teknikler kullanılarak in vivo NO düzeylerini ölçmek zordur. 2. Burada ana sınırlama dolaşım arteriyel tarafında neredeyse tüm kan damarları arasında yatıyor bir internal elastik lamina olması endothelyum ve düz kas hücrelerinin en iç tabakası. 8 Bundan başka, yumuşak kas ve adventisya tabaka arasındaki hücre dışı malzeme en. elastin 8 kollajen ve kollajen, yüksek yoğunluk ve uyarım dalga boyunda bir çok çeşitli oto-floresan önemli bir kaynağıdır . konfokal görüntüleme sırasında artan ışık saçılması ile birleştiğinde güçlü arka plan floresan düşük sinyal çözünürlüğü ve kalsiyum sinyalizasyon veya NO üretiminin nedenle, azaltılmış algılama üretir. Anlamlı ölçümler yapmak için yeterli konsantrasyonlarda damar hücrelerine yükleme flüoresan sınırlayıcı faktör böyle uzun de floresan yayar Asante Kırmızı gibi ionofor, yeni bir sınıf, bir ex vivo hazırlık, iki foton mikroskop kullanarak ve uygulayarak çözülebilir Bağ dokusu ve liflerin bir oto-floresan ile ilgili daha az parazit olduğu dalga boyu. Bununla birlikte, bu yöntemin önemli sorunlardan biri de dif olmasıdırgörüntüleme sırasında, iki ya da daha fazla boya birleştirmek geçinen ailelerin zorlanmasına. İki foton görüntüleme için kullanılabilir boyaların çoğu için uyarma spektrumları aynı anda iki farklı ionofor ölçmek için zor hale geniş polimodal dağıtım özelliklerine sahip. Bununla birlikte, düşük gürültü hibrid detektörler iyonoforlar farklı dalga boylarında ışık yayan varsayılarak tespit emisyon tayfları dar kullanılabilir. Örneğin, bu tarif edilen prosedürde emisyon spektrumu üst üste çünkü NO üretimini ve Ca + 2 konsantrasyonu değişiklikleri, hem ölçmek mümkün değildir.
Kan akışı ile doğrudan temas halinde olan vasküler endotel hücrelerinin sıvı kayma stresine maruz kalan ve vasküler homeostazı düzenler. 9 mevcut yöntem, aynı zamanda akış kaynaklı geçici kalsiyum ve endotel hücreleri ex vivo NO üretimini izlemek için uygulanabilir edilir. Buna ek olarak, bu yöntem başarılı bir şekilde Ca 2 + konsantrasyonunun okuyan uygulanabilirböbrekten ekstre küçük direnç arterlerinin düz kas hücrelerinde de değişir. Bu durumda, parçalara küçük bir direnç arterlerinin bağlı Ca2 + aşırı yük düz kas hücresi hasarı önlemek için Ca 2 + -serbest çözelti inkübe edilmelidir. Bu modifikasyon aynı zamanda, hücre ölümü azaltmak için aorta uygulanabilir.
Perspektifler. Floresans tabanlı görüntüleme yaygın in vitro hücresel fizyoloji incelemek için kullanılır olmuştur; Ancak, izole hücre modelleri her zaman hücreler kendi ana ortamında ortaya fizyolojik süreçleri özetlemek yok. Burada açıklandığı gibi bu. Translasyonel araştırma 10 hücre hatları uygulanabilirliğini sınırlı diğer hücre tipleri ile tüm yerel fizyolojik süreçler ve etkileşim hala meydana nerede ex vivo preparatların kullanımı bize taze izole dokuda hücresel davranışını izlemek için fırsat verdi . Genetik engin artan sayısı ileeering teknolojileri mevcut ve insan hastalıkları özetlemek modellerinin geliştirilmesi, ex vivo hazırlıklar translasyonel araştırmalar için yararlı bir araç olacaktır. Burada anlatılan çalışmalar için, Dahl Tuz Duyarlı (SS / JrHsdMcwi) hipertansif sıçan suşu kullanıldı. SS, sıçan ilerici insan hipertansiyon birçok açıdan tekrarlar tuza karşı duyarlı hipertansiyon doğal olarak oluşan bir doğal genetik modelidir. Bu model yaygın kullanılıyor ve bu sıçan modeli ile tuz hassasiyeti ve vasküler disfonksiyon. 11-13 yatan mekanizmaları önemli anlayışlar sağladı araştırmacılar ZFNs kullanarak (hipertansiyon) gibi kompleks hastalıkların önemli mekanizmaların katkısını test etmek mümkün olmuştur Bu gen düzenleme kaynaklarla birlikte burada açıklanan deney prosedürü kullanarak Talens ve CRISPR / Cas dayalı gen düzenleme teknolojileri. 6,14-17, tuz kalsiyum ve diğer önemli faktörler katkısını test başlamak için artık mümkün -duyarlıhipertansiyon ve bir çok farklı hayvan modellerinde endotel fonksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz görüntüleme çalışmaları ile yardım için Dr. William Cashdollar ve Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü'nde Kuzeybatı Karşılıklı Vakfı Görüntüleme Merkezi'ni teşekkür ederiz. Biz de bu yazının ve yararlı bir tartışma eleştirel okuma Dr Daria Ilatovskaya teşekkür ederim. Bu çalışma (AS) Sağlık Hibeler HL108880 National Institutes ve (AMG için) DP2-OD008396 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
