Abstract
El calcio es un regulador muy importante de muchos procesos fisiológicos en los tejidos vasculares. La mayoría de las funciones endoteliales y de músculo liso dependen en gran medida de los cambios en el calcio intracelular ([Ca2 +] i) y óxido nítrico (NO). Con el fin de entender cómo [Ca 2 +] i, NO y moléculas de aguas abajo son manejados por un vaso sanguíneo en respuesta a vasoconstrictores y vasodilatadores, hemos desarrollado una nueva técnica que se aplica en calcio etiquetado (o NO-etiquetado) tiñe con dos fotones microscopía para medir el manejo del calcio (o la producción de NO) en los vasos sanguíneos aislados. Descrito aquí es un procedimiento que se detalla paso a paso que muestra cómo aislar una aorta de una rata, calcio etiqueta o NO en las células endoteliales o de músculo liso, y la imagen de los transitorios de calcio (o la producción de NO) utilizando un microscopio de dos fotones siguiente fisiológica o estímulos farmacológicos. Los beneficios de usar el método son multi-pliegue: 1) es posible simultáneaLy medir los transitorios de calcio en ambos células endoteliales y células del músculo liso en respuesta a diferentes estímulos; 2) le permite a uno a las células imagen endoteliales y células musculares lisas en su entorno nativo; 3) este método es muy sensible al calcio intracelular o ningún cambio y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas; y 4) enfoque descrito se puede aplicar a la medición de otras moléculas, tales como las especies reactivas del oxígeno. En resumen, la aplicación de dos fotones microscopía de emisión láser para controlar los transitorios de calcio y la producción de NO en las células endoteliales y de músculo liso de un vaso sanguíneo aislado haya facilitado datos cuantitativos de alta calidad y promovido nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la función vascular.
Introduction
El calcio es un segundo mensajero fundamental dentro de las células vasculares tales como células endoteliales y musculares lisas. Es el estímulo primario para la contracción vascular y desempeña un papel importante en la dilatación vascular, incluyendo sus efectos a través de la generación de NO en el endotelio. Debido a las limitaciones de las tecnologías de formación de imágenes, ha sido prácticamente imposible observar el manejo del calcio dentro del recipiente intacto. El desarrollo de dos sistemas de imagen de fotones y la creación de nuevos calcio o NO tintes de etiquetado, hace posible la imagen a la profundidad y la resolución suficiente para empezar a entender la dinámica del calcio y la producción de NO dentro de la vasculatura.
Microscopía de dos fotones se ha aplicado recientemente en los tejidos, los órganos y los estudios en animales enteros, incluso debido a su capacidad superior para penetrar profundamente los tejidos con baja fluorescencia de fondo y la alta sensibilidad de la señal. 1,2 El estrecho espectro de excitación de dos fotones en el Iluminadorpunto focal de iones y el uso de detectores no descanned son las razones por las dos microscopía fotón es superior a la microscopía confocal tradicional. La microscopía confocal no puede producir imágenes de alta calidad en la profundidad del tejido necesario debido a la auto-fluorescencia y la dispersión de la luz fuera de foco en el agujero confocal. En consecuencia, hemos desarrollado un método que utiliza un microscopio de dos fotones para medir [Ca 2 +] i la señalización y la producción de NO en células intactas, los vasos sanguíneos individuales con una baja relación señal-ruido de alta resolución y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en el Colegio Médico de Wisconsin y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Aislamiento de la aorta de rata
- Anestesiar las ratas con isoflurano (5% de inducción, 1,5 a 2,5% de mantenimiento) u otro método aprobado IACUC.
- Coloque la rata en una posición supina. Con el fin de exponer los órganos abdominales, hacer una pequeña incisión en la línea media ventral a través de la piel y del tejido subcutáneo abdominal. Uso de almohadillas de gasa desvían suavemente los intestinos para exponer la aorta y la vena cava como se muestra en la Figura 1.
- Brevemente, embotado diseccionar la aorta desde el tejido conectivo y de la vena cava. El uso de sutura, atar la aorta lo más cerca posible al riñón. Diseccionar unos 1-2 cm de aorta y colocarlo en una cónica 15 ml maser contiene fisiológico normal de Salt Solution (PSS; en mM: 140 NaCl, 1,2 de MgCl 2, 2 CaCl 2, 4,5 KCl, 6 glucosa, 10 HEPES) en hielo.
- Una vez que la aorta se aísla, la eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los no-supervivencia procedimientos eutanasia animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humano del animal. 3
- Fórceps Utilizando un microscopio de disección, con punta fina, y microtijeras diseccionar la grasa y el tejido conectivo fuera de la aorta. Una vez que la aorta es limpio, cortar la aorta longitudinalmente y colocarlo en PSS en hielo para después.
2. colorante de carga e Incubación
- Pipet 7 l de 1 mM Fluo-04 a.m. tinte, que se suministra en la solución basada en DMSO, en 500 tubos individuales mu l que se han cubierto con papel de aluminio. Almacenar en el congelador a -20 ° C para preservar las propiedades de tinte con el tiempo. Nota: estas alícuotas de modoluciones deben ser estables durante al menos seis meses.
- Antes de usar, permiten que las soluciones de colorante para calentar a temperatura ambiente antes de abrir. Preparar soluciones de trabajo inmediatamente antes de su uso. No almacene el reactivo diluido para su uso posterior.
- Añadir 7 l de mM Fluo-04 a.m. tinte 1 confeccionada disuelto en solución de DMSO al 450 ul de PSS que no contiene calcio. Añadir 40 l de 10% de solución de DMSO no a base de ácido Pluronic al cóctel de carga para ayudar a dispersar los acetoximetilo (AM) ésteres y mejorar la carga del colorante de calcio.
- Colocar las aortas disecados en los tubos 500 l que contenía el cóctel de carga (como se describe en 2.3) durante 1 h. Cubra todos los tubos con papel y lugar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente.
- Para supervisar la producción de NO en la vasculatura, utilizar colorante diacetato DAF-FM. Incubar la aorta en una solución que contiene 450 l PSS, 40 l de ácido plurónico y 5 l de 10 mM diacetato de DAF-FM. Similar al protocolo de incubación de calcio (descrito en 2.3), colocar la aortaen un tubo de 500 l que contiene la solución NO-dye cubierta en papel de aluminio y colocar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C, seguido de la próxima 30 min a temperatura ambiente.
- Cuando se mide la producción de NO, utilizar el NO endotelial bloqueador sintasa, L-NAME, para bloquear la producción de NO como un control como se muestra en la Figura 4B. Para este procedimiento, se suman a cóctel (como se describe en 2.5) 100 nM L-NAME durante los últimos 30 minutos de incubación (a temperatura ambiente).
3. Protocolo de fotones Microscopía de escaneo láser Dos
- Después de la 1 h de incubación, lavar la aorta 2 - 3 veces en PSS limpia para eliminar tinte extracelular.
- Transferir la aorta a un plato recubierto de silicona que contiene ya sea normal o PSS Ca 2+ tampón libre (depende del protocolo experimental). Pin de la aorta hacia abajo sobre el revestimiento de silicona con la adventicia en contacto con la silicona (es decir, lumen endoteliales expuestas a la abertura de plato) utilizando pasadores en forma de μ. También puede utilizar un ancla de la rebanadarejilla o pegamento para fijar el tejido.
Nota: Para reducir el estrés y posibles artefactos mecánicos, traslado y fijar aorta en Ca 2 + libre de solución y esperar 5-10 minutos antes de comenzar el experimento. - Conectar una bomba peristáltica o una jeringa a la placa recubierta de silicona para la aplicación automática o manual de fármacos o para cambiar la solución extracelular.
- Coloque el plato debajo de la pieza de la nariz de los rectos microscopio de dos fotones, e instalar y posicionar un 25 × (NA 1.05 y el trabajo a distancia 2 mm) de inmersión en agua lente objetivo por encima de la muestra. Nota: Si este objetivo específico no está disponible, utilice un objetivo fabricados específicamente para dos imágenes de fotones, ya que puede aumentar la resolución de la señal de forma espectacular en comparación con un objetivo normal.
- Activar el láser de dos fotones usando el software (el láser comienza a bombear y encienda). Sintonice la excitación láser de 820 nm.
- El uso de epifluorescencia, busque la aorta y se centran en el objetivola superficie endotelial utilizando ajuste grueso.
- Cambie el microscopio en el modo de escaneo láser de dos fotones, lo que garantiza que el láser de excitación es el modo de bloqueo, los detectores no descanned están comprometidos y se instalan los filtros de emisión correspondientes a los espectros de emisión esperada. Nota: Aquí, la FV10-MRL / R (495-540 nm) se utilizaron.
- Iniciar escaneo en vivo utilizando aproximadamente 5% de la potencia del láser y finamente enfocar el objetivo con el fin de visualizar las células endoteliales.
Nota: Las células endoteliales exhibirán una fuerte señal fluorescente cuando se incubaron en PSS normal. Este será notablemente más débil cuando los vasos se incubaron en tampón libre de calcio. Las células endoteliales estarán presentes en la parte superior de la aorta se abrió y las células musculares lisas se pueden ver justo debajo de las células endoteliales (ver Figura 2). Debido a que los vasos sanguíneos no son ni lisa ni incluso, habrá lugares en los que tanto las células de músculo liso y células endoteliales están presentes. </ Li> - Una vez que las células están en foco, el programa de software microscopio para recoger imágenes secuenciales en el modo de exploración rápida (exploración de trama, ventana 512 x 512 píxeles con una frecuencia marco de la colección de 1,1 s). En paralelo con Fluo-4 a.m. fluorescencia, recopilar imágenes de luz transmitida con el fin de detectar cambios en la contracción de los vasos y visualizar mejor las condiciones experimentales.
- Después de la recogida de imágenes de señal de referencia, cambiar la concentración de iones Ca2 + en la solución externa o lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando la bomba peristáltica mientras que las imágenes. Observe el aumento de la señal fluorescente dentro de las células cargadas.
Nota: Las células endoteliales responden a cambios en el flujo, lo que se recomienda utilizar aplicaciones laminares bajos y de prueba del vehículo antes de la aplicación de los activadores farmacológicos de Ca 2+ o NO señalización. Para volver a calcular el calcio intracelular a los valores de concentración nM en vasijas cargadas con Fluo-4 (constante de disociación de Fluo-4 is 345 nM), la intensidad de fluorescencia puede ser registrada al inicio del estudio y después de la adición de ionomicina y MnCl2. 4
4. Procesamiento de Imágenes y Cálculos
- Descargue e instale Fiji paquete de procesamiento de imagen.
- Abra el archivo de imagen en Fiji. Al importar el archivo, dividir los canales (luz transmitida y la señal fluorescente) cuando se le solicite. Utilice únicamente la señal fluorescente para el análisis de datos.
- Dentro del programa de Fiji, haga clic en la ficha analizar y desplácese hacia abajo hasta la opción herramientas. Bajo la opción de herramientas, encontrará la ficha que dice el gerente de retorno de la inversión y haga clic en él; Aparecerá una nueva ventana.
- Después de esto, haga clic en las mediciones establecidas en la ficha analizar. Seleccione las mediciones específicas de interés. Para las medidas transitorias de calcio, utilice la opción del valor medio gris.
- Con la herramienta de trazo circular, comenzar a trazar las regiones de interés (ROI) y haga clic en "añadir" en la pantalla del gestor de retorno de la inversión para cada ROI. Una vez que todas las células de interés se han trazado, en la ventana del gestor de ROI, seleccione Medir Multi bajo la etiqueta de "más". Recuerde que debe guardar bien las mediciones directamente o copiar y pegar todas estas mediciones en una hoja de cálculo.
- Abrir archivo * .txt o Excel hoja de cálculo desde Fiji y transferir los números de una nueva hoja de Origen. Nota: También puede utilizar cualquier programa como Sigma Plot o Prisma para su posterior análisis.
- Dentro del programa de origen, utilice Parcela → Menú Line + Símbolo de observar una visión general de todas las respuestas transitorias. Anule la selección de las células que no responden.
- Volver a calcular el número de seguimiento para escala de tiempo (eje X), utilice la columna → Establecer valores de columna y multiplicar la columna el número de seguimiento para la frecuencia de recogida de imagen (en nuestro caso 1.1s).
- Utilice Análisis → Estadísticas en filas para todas las grabaciones seleccionadas para calcular media (eje Y) y trazas de error estándar. Trazar el gráfico final para el grupo actual de células Parcela → Línea + Símbolo.
- El mean calcio cálculo transición se describe como sigue.
- Para liberación total de calcio dentro del programa de origen, haga clic en el gráfico, a continuación, utilice el menú Análisis → Cálculo → Integrar. Integral total del área bajo la curva aparece en registro de resultados.
- Para la cinética transitoria, haga clic en el gráfico, a continuación, utilizar el menú: Curva Análisis → no lineal Fit → Seleccionar Conjunto de Datos (elegir eje X van desde el máximo hasta el final de la respuesta transitoria). Iniciar montaje → Seleccionar Función → Exponencial Decay 1 → Hecho.
Nota: ajuste exponencial aparece en la ventana de gráficos y registro de resultados. Los datos obtenidos (valores) representan cantidad total de calcio liberado, y la cinética de los canales mediadas la respuesta transitoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con el fin de evaluar con precisión la contribución de calcio a la fisiología vascular (vasodilatación y vasoconstricción), un protocolo fue diseñado para cargar colorantes de calcio en ambas células endoteliales y células del músculo liso en aortas intacto aislado. La experimental general que establezcan representado en la Figura 1, muestra la estrategia básica para el aislamiento y la preparación del recipiente antes de formación de imágenes. Brevemente, después del aislamiento de la aorta de la rata, se debe limpiar de grasa y tejido conectivo y se cortó longitudinalmente. La aorta abierto debe ser colocado en un tubo de 500 l forrada con papel aluminio que contiene el cóctel de carga preparado antes como se describe en el protocolo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con balanceo luz. Después de la incubación, la aorta se debe lavar, inmovilizado sobre una placa de silicona cubierta con la adventicia más cercana a la silicona y lumen hacia arriba, y se transfiere a un montante microscopio de dos fotones para formación de imágenes.
Once la aorta se ha colocado en el microscopio y el recipiente está en foco, las células endoteliales deben ser fáciles de localizar por su fuerte emisión fluorescente (Figura 2A). Las células endoteliales también será el primer objeto a entrar en foco, porque la luz del vaso, que se compone principalmente de las células endoteliales, debe estar mirando hacia arriba cuando el buque está inmovilizado. Además de imágenes de células endoteliales, habrá lugares en los que las células musculares lisas son visibles (Figura 2B). Así, tanto las células endoteliales y de músculo liso podrían ser identificados en el mismo campo de la imagen (Figura 2C). Tener la capacidad de imagen ambos tipos de células vasculares dentro del mismo campo de imagen puede conducir a una mejor comprensión de cómo estas células de forma conjunta, sin embargo, de forma independiente, responden a diferentes agonistas y estímulos.
Para demostrar la utilidad de este método, las mediciones de las células de aorta de capacidad de respuesta a la adición de unacetylcholine (ACh), un potente vasodilatador que causa específicamente cambios dentro del endotelio, se determinó. Como se muestra en la Figura 3A, las células endoteliales se pueden ver fácilmente mientras se incubaron en PSS normal. Después de la adición de ACh (Figura 3B), las endoteliales aumenta la fluorescencia celular lo que indica que el contenido de calcio intracelular también está aumentando. La cuantificación de la fluorescencia emitida a partir de las ROIs, o las células endoteliales, se muestra en la Figura 3C. Después de la adición de ACh, las intracelulares aumenta el contenido de calcio rápidamente y luego, lentamente, vuelve de nuevo a la línea de base. El aumento en el calcio dentro de las células endoteliales en respuesta a ACh es coherente con los informes anteriores. 5,6
Similar a los estudios de calcio, este protocolo es adecuado para la detección de la producción de NO endotelial. Para estos experimentos, las células endoteliales aórticas fueron cargados con colorante diacetato de DAF-FM como se muestra enLa Figura 4A. Este enfoque se utilizó recientemente para demostrar que NO aumenta la producción de una manera dependiente de Ca2 + en respuesta a ACh estimulación. 6 Es importante destacar que, después del tratamiento con L-NAME, un inhibidor de la sintasa endotelial NO, esta respuesta fue bloqueada (Figura 4B).
Otro ejemplo representativo de cómo esta técnica se puede aplicar para medir el calcio intracelular se muestra en Video 1, donde se añadió solución de calcio que contiene a un recipiente que se incubó en tampón libre de calcio. Cuando aorta se incuban inicialmente en la memoria intermedia libre de calcio (al inicio del vídeo), las células endoteliales son débilmente fluorescente que indica bajos niveles de calcio en las células. Sin embargo, después de la adición de PSS normales, las células responden de inmediato al aumentar la [Ca 2 +] i concentración y emisión de fluorescencia de alta intensidad. Este experimento muestra que las células están vivas ysensible a los estímulos externos. Este experimento también valida la viabilidad de este método con su rendimiento de datos de alta calidad.
Figura 1. Aislamiento Aorta y Experimental Set Up. 1) Después de anestesiar las ratas, hacer una incisión en el abdomen y aislar la aorta del tejido conectivo y la vena cava. 2) Después de la extracción de la aorta, limpiar el recipiente de grasa y tejido conectivo y abrir el vaso cortando longitudinalmente. 3) Incubar el buque en la AM colorante Fluo-4 durante 1 hora a RT con ligero balanceo. 4) Después de la incubación, lavar la aorta, fijarlo en una placa recubierta de silicona, luz hacia arriba, y la transfiere a la etapa de un montante microscopio de dos fotones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imaging músculo liso y células endoteliales. Después de la carga suficiente de la de tintura de calcio, es posible a la imagen tanto de células de músculo liso y células endoteliales. (A) Top, es un ejemplo de Fluo 4 fluorescencia de las células endoteliales en una rata aislado aorta. En pocas palabras, es una imagen fluorescente se fusionó con vista luz transmitida (de manera similar para B y C). (B), es un ejemplo de Fluo 4 fluorescencia de las células musculares lisas en una rata aislado aorta. (C) debido al grosor no uniforme de la aorta, también es posible de áreas de imagen que tanto el músculo liso y las células endoteliales están presentes. Escala de barras se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Figura 3. Medición de los transitorios de calcio en las células endoteliales en respuesta a ACh. (A) La aorta se preparó inicialmente y se incubó en tampón normal de PSS para las grabaciones de línea de base. (B) Después de la adición de acetilcolina (ACh), la señal fluorescente emitida por las células endoteliales (ROIs) mejoradas que indica aumento de los niveles de calcio dentro de las células. Se muestra la barra de escala. (C) Los transitorios de calcio de las células endoteliales en respuesta a la Ach se calcularon utilizando software de origen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen de óxido nítrico en las células endoteliales. (A) Después de cargar la aorta con el colorante diacetato DAF-FM y colocarlo en el escenario de un microscopio de dos fotones, es posible que la imagen niveles de NO en las células endoteliales usando fluorescencia emitida. (B) Después de la incubación con el inhibidor de la NO sintasa endotelial, L-NAME, la fluorescencia global disminuyó dentro de las ROIs, lo que indica niveles reducidos de NO dentro de las células. Barra de escala se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1. Ejemplo de respuesta de las células endoteliales a los cambios en calcio concentration. Después de la preparación y la incubación en Fluo-4 a.m. tinte, la aorta se lavó con tampón libre de calcio y se coloca sobre la platina de un microscopio de dos fotones. Cuando el recipiente se coloca en el buffer libre de calcio, la mayoría de las células endoteliales son débilmente fluorescente. Después de la adición de PSS normales, las células endoteliales responden mediante el aumento de la concentración de calcio intracelular y emitiendo una señal fluorescente fuerte.
Vídeo 2. Ejemplo de la producción de NO en las células endoteliales de aorta de rata isoltated. Después de la preparación y la incubación en colorante diacetato de DAF-FM, la aorta se colocó en la platina de un microscopio de dos fotones. Después de la adición de Ach en a solución del baño, las células endoteliales responden aumentando intracelular NO la producción y emisión de una señal fluorescente fuerte. Haga clic aquí para ver el vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descripción general Experimental. Para comprender mejor la contribución de calcio y NO a la fisiología vascular, un nuevo método fue desarrollado para la medición de [Ca2 +] i y NO en el músculo liso y las células endoteliales de aortas intactas aisladas. Juntos, este protocolo consta de estos pasos críticos: 1) aislamiento mecánico y preparación (digestión no enzimática) de la embarcación. Es importante mantener el tejido sano y intacta tanto como sea posible para obtener grabaciones fisiológicas óptimas. 2) La incubación en el tinte de calcio-etiquetado o NO-etiquetado de tinte con ácido plurónico es crítica, sin embargo, para algunos otros tipos de buques, puede necesitar un tiempo de ácido y la incubación plurónico diferente a ensayar. 3) la fijación correcta de la aorta al plato recubierto de silicona con la red y los pasadores proporcionará una visión estable durante la exploración con el microscopio de dos fotones. Debido a que el buque va a constreñir y dilatar, es importante asegurarse de que el buque es properly fijo al plato para evitar artefactos de movimiento que puedan surgir. 4) Cuantificación de los resultados. Tenga en cuenta que la amplitud transitoria no siempre puede ser el mejor parámetro para comparar las características fisiológicas de las células. El integrante de la transitoria puede mostrar una mejor diferencia debido al total de [Ca2 +] i, o la liberación de NO.
Cuando los experimentos se llevan a cabo correctamente, es posible monitorizar la [Ca2 +] i (o los niveles de NO) los cambios en respuesta a estímulos, como se muestra en las Figuras 3 y 4 y de vídeo 1 y 2. La combinación de una preparación ex vivo y el uso de dos imágenes de fotones puede proporcionar una mejor resolución de la señal y mediciones precisas de los procesos intracelulares en los tejidos vasculares. Aquí, estas tecnologías se aplicaron en combinación con el clásico Ca no radiométrico 2+ y NO indicadores (Fluo-4 a.m. y DAF-FM diacetato, respectivamente), amedir los transitorios de calcio y la producción de NO en las células individuales de toda una aorta aislada. Creemos que esta técnica ayudará a reenviar nuestro conocimiento acerca de la regulación de los mecanismos de [Ca2 +] i y los niveles de NO en los diferentes tipos de células vasculares.
Modificaciones y solución de problemas. Los principios básicos de la medición de Ca 2+ de señalización en las células del músculo liso individuales con ionóforos sensibles se publicó inicialmente en 1985. 7 La mayoría de los métodos recientes de Imagen Ca 2+ niveles en las células vasculares individuales han empleado un microscopio láser confocal de barrido y aisladas o preparaciones cultivadas. Para tejidos dinámicos como los vasos sanguíneos, es difícil medir el calcio o los niveles de NO in vivo utilizando técnicas basadas en microscopía. 2 La principal limitación aquí es que casi todos los vasos sanguíneos en el lado arterial de la circulación tienen una lámina elástica interna que se encuentra entre el endothelio y la capa más interna de las células musculares lisas. 8 Además, la mayor parte del material extracelular entre el músculo liso y la capa adventicia es el colágeno. 8 elastina y el colágeno son una fuente importante de auto-fluorescencia con alta intensidad y una amplia gama de longitudes de onda de excitación . La fuerte fluorescencia de fondo junto con el aumento de la dispersión de luz durante la proyección de imagen confocal produce baja resolución de la señal y por lo tanto, la reducción de la detección de la señalización de calcio o la producción de NO. El factor limitante de sondas fluorescentes de carga en las células vasculares en concentraciones suficientes para hacer mediciones significativas se puede resolver mediante el uso de una preparación ex vivo, un microscopio de dos fotones, y la aplicación de una nueva clase de ionóforos, como Asante Red, que emite fluorescencia a largo longitudes de onda, donde hay menos interferencia de la autofluorescencia del tejido conectivo y fibras. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este método es que es difcil para combinar dos o más tintes durante la exploración. Los espectros de excitación para la mayoría de los colorantes disponibles para dos imágenes de fotones tienen, características de distribución polimodales de ancho, que hacen que sea difícil para la medición de dos ionóforos diferentes al mismo tiempo. Sin embargo, los detectores de híbridos de bajo ruido podrían ser utilizados para reducir los espectros de emisión detectados Suponiendo que los ionóforos emiten luz a diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, en este procedimiento descrito no es posible medir tanto la producción de NO y Ca 2+ cambios de concentración debido a que los espectros de emisión se solapan.
Las células endoteliales vasculares que están en contacto directo con el flujo de sangre están expuestos a la tensión de cizallamiento de fluido y regulan la homeostasis vascular. 9 El método actual también se puede aplicar para controlar los transitorios de calcio inducidas por el flujo y la producción de NO en las células endoteliales ex vivo. Además, este método puede ser aplicado con éxito para el estudio de Ca 2+ concentracióncambios ción en las células musculares lisas de las arterias de resistencia pequeños extraídos desde el riñón. En este caso, las arterias de resistencia pequeños disecados deben incubarse en Ca 2+ de solución libre para evitar daños en las células del músculo liso debido a la sobrecarga de Ca2 +. Esta modificación también puede ser aplicada a la aorta para reducir la muerte celular.
Perspectivas. Formación de imágenes basada en la fluorescencia ha sido ampliamente utilizado para estudiar la fisiología celular in vitro; Sin embargo, los modelos celulares aisladas no siempre recapitulan los procesos fisiológicos que se producen cuando las células están en su ambiente nativo. Esto ha limitado la aplicabilidad de las líneas celulares para la investigación traslacional. 10 Como se describe aquí, el uso de preparados ex vivo nos ha dado la oportunidad de monitorear el comportamiento celular en recién aisladas tejido donde todos los procesos fisiológicos locales y la interacción con otros tipos de células se siguen produciendo . Con el creciente número de engin genéticatecnologías inge- disponible y el desarrollo de modelos que recapitular las enfermedades humanas, ex preparaciones in vivo será una herramienta útil para la investigación traslacional. Para los estudios que aquí se describen, se utilizó la sal-sensible (SS / JrHsdMcwi) cepa de ratas hipertensas Dahl. La rata SS es un modelo genético endogámicos de origen natural de la hipertensión sensible a la sal que recapitula muchos aspectos de la hipertensión humana progresiva. Este modelo está siendo utilizado ampliamente y ha proporcionado información clave sobre los mecanismos subyacentes sensibilidad a la sal y la disfunción vascular. 11-13 Con este modelo de rata, los investigadores han sido capaces de poner a prueba la contribución de los mecanismos clave para enfermedades complejas (como la hipertensión) utilizando ZFNs , / tecnologías gen de edición basados Cas-Talens, y CRISPR. 6,14-17 Usando el procedimiento experimental descrito aquí, junto con estos recursos gen de edición, ahora es posible empezar a probar el aporte de calcio y otros factores clave a la sal -sensiblehipertensión y disfunción vascular en muchos modelos animales diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. William Cashdollar, y la Fundación Centro de Imagen Northwestern Mutual en el Instituto de Investigación de la Sangre de Wisconsin para ayudar con los estudios de imagen. También agradecemos al Dr. Daria Ilatovskaya para la lectura crítica de este manuscrito y útil para el debate. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL108880 (a AS) y DP2-OD008396 (a AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
