Abstract
Calcium is een belangrijke regulator van veel fysiologische processen in vasculaire weefsels. De meeste endotheel- en gladde spier functies sterk afhankelijk van veranderingen in intracellulair calcium ([Ca2 +] i) en stikstofoxide (NO). Om te begrijpen hoe de [Ca 2+] i, NO en downstream moleculen worden behandeld door een bloedvat in reactie op vasoconstrictoren en vaatverwijders, ontwikkelden we een nieuwe techniek dat calcium-etikettering van toepassing is (of NO-etikettering) kleurstoffen met twee foton microscopie calcium handling (of NO-productie) in geïsoleerde bloedvaten te meten. Hier beschreven is een stap-voor-stap procedure die laat zien hoe een aorta te isoleren uit een rat, label calcium of NO in het endotheel of gladde spiercellen, en het beeld calcium transiënten (of NO-productie) met behulp van een twee-foton microscoop volgende fysiologische of farmacologische stimuli. De voordelen van de werkwijze zijn multi-fold: 1) Het is mogelijk om gelijktijdigely meten calcium transiënten in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in reactie op verschillende stimuli; 2) Het maakt het mogelijk om beeld endotheelcellen en gladde spiercellen in hun natieve omgeving; 3) Deze methode is zeer gevoelig voor intracellulair calcium of NO veranderingen en genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen; en 4) beschreven benadering kan worden toegepast op de meting van andere moleculen, zoals reactieve zuurstofsoorten. Samengevat, de toepassing van twee foton laseremissie microscopie calcium transiënten en NO productie in de endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde bloedvat verschaft hoogwaardige kwantitatieve gegevens en bevorderd ons begrip van de mechanismen reguleren bloedvaten te controleren.
Introduction
Calcium is een essentiële tweede messenger in vasculaire cellen zoals endotheelcellen en gladde spiercellen. Het is de primaire stimulus voor vasculaire contractie en speelt een belangrijke rol bij vaatverwijding, inclusief de effecten bij NO productie in het endotheel. Door de beperkingen van beeldvormende technieken, is het vrijwel onmogelijk om calcium handling te observeren binnen de intacte vat. De ontwikkeling van twee foton imaging systemen en de creatie van nieuwe calcium of NO etikettering kleurstoffen, maakt het mogelijk om de afbeelding op een voldoende diepte en resolutie om te beginnen met calcium dynamiek en NO productie in het vaatstelsel te begrijpen.
Twee foton microscopie is onlangs toegepast in weefsels, organen en zelfs hele dierstudies vanwege zijn superieure vermogen om diep weefsels met lage achtergrond fluorescentie en hoge signaal gevoeligheid. 1,2 De smalle spectrum van twee foton excitatie bij het Illumination knooppunt en het gebruik van niet descanned detectors zijn de redenen waarom er twee foton microscopie superieur aan traditionele confocale microscopie. Confocale microscopie kan geen beelden van hoge kwaliteit op de nodige weefsel diepte te wijten aan de auto-fluorescentie en de verstrooiing van out-of-focus licht in de confocale pinhole. Daarom hebben we een methode waarbij twee foton microscoop te meten [Ca 2+] i signalerings- en NO productie in intacte individuele bloedvat cellen met een hoge resolutie en een lage signaal-ruisverhouding ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Isolatie van de Rat Aorta
- Verdoven ratten met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) of een andere IACUC goedgekeurde methode.
- Plaats de rat in een liggende positie. Om de buikorganen bloot een kleine ventrale middellijn incisie door de huid en het subcutane abdominale weefsel. Met gaasjes voorzichtig buigen de darmen om de aorta en vena cava bloot te leggen zoals weergegeven in figuur 1.
- Kort Blunt ontleden de aorta van het bindweefsel en de vena cava. Met hechtmateriaal, afhechten de aorta zo dicht mogelijk bij de nieren. Ontleden ongeveer 1-2 cm van de aorta en plaats deze in een 15 ml conische tuworden met normale fysiologische zoutoplossing (PSS, in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 glucose, 10 HEPES) op ijs.
- Zodra de aorta is geïsoleerd, euthanaseren van de dieren volgens de goedgekeurde IACUC protocollen. Bij de voltooiing van alle niet-survival procedures euthanaseren diep verdoofde dieren door thoracotomie inducerende pneumothorax aan de humane ondergang van het dier te waarborgen. 3
- Met behulp van een dissectie microscoop, fijne punt pincet en microscissors ontleden het vet en bindweefsel af van de aorta. Zodra de aorta is schoon, snijd de aorta in de lengte en plaats het in de PSS op ijs voor later.
2. Dye laden en Incubation
- Pipetteer 7 pi van 1 mM Fluo-04:00 kleurstof, die wordt geleverd in DMSO gebaseerde oplossing, in afzonderlijke buizen die 500 ul werden afgedekt met aluminiumfolie. Bewaar in de vriezer bij -20 ° C tot de kleurstof eigenschappen in de tijd behouden. Let op: dus deze gealiquoteerdsingen moet stabiel zijn gedurende tenminste zes maanden.
- Voor gebruik kan de kleurstof oplossing opwarmen tot KT alvorens te openen. Bereid werkende oplossingen direct voor het gebruik. Laat de verdunde reagens voor later gebruik opslaan.
- Voeg 7 ul-klare 1 mM Fluo-04:00 kleurstof opgelost in DMSO oplossing tot 450 ul van PSS die geen calcium. Voeg 40 ul van niet DMSO gebaseerde 10% Pluronic Acid oplossing voor het laden cocktail om verspreiding van de acetoxymethyl (AM) esters en verbeterd laden van de calcium kleurstof.
- Plaats de ontleed aorta in de 500 ul buizen met het laden cocktail (zoals beschreven in 2.3) gedurende 1 uur. Bedek alle buizen met folie en plaats op een draaiende schudder bij RT.
- NO productie in de bloedvaten te controleren, gebruiken DAF-FM diacetaat kleurstof. Incubeer de aorta in een oplossing die 450 ul PSS, 40 ui pluronzuur en 5 ui 10 mM DAF FM-diacetaat. Vergelijkbaar met de calcium incubatie protocol (in 2.3 beschreven), plaatst u de aortaper 500 pl buis met de NO-kleurstofoplossing bedekt met folie en plaats op een roterende schudder gedurende 30 minuten bij 4 ° C gevolgd door volgende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wanneer NO productie wordt gemeten met de endotheliale NO synthase blocker, L-NAME, NO productie blokkeren als controle zoals getoond in figuur 4B. Voor die procedure, toe te voegen aan cocktail (zoals beschreven in 2.5) 100 nM L-naam voor de laatste 30 min incubatie (bij RT).
3. Laser Scanning Twee foton microscopie Protocol
- Na 1 uur incubatie, was de aorta 2-3 maal in schone PSS op extracellulaire kleurstof te verwijderen.
- Breng de aorta naar een gesiliconiseerd schaaltje met hetzij normale PSS of Ca2 + -vrije buffer (afhankelijk van het experimentele protocol). Pin de aorta beneden op de siliconenlaag de adventitia in contact met de silicone (bijv endotheliale lumen blootgesteld aan de schotel opening) middels μ-vormige pinnen. Als alternatief gebruik maken van een Slice Anchorraster of lijm aan het weefsel te herstellen.
Opmerking: Om stress en mogelijke mechanische artefacten, de overdracht te verminderen en vast te aorta in Ca 2+ -vrije oplossing en wacht 5-10 minuten vóór het begin van het experiment. - Sluit een peristaltische pomp of een injectiespuit naar de siliconen-gecoate plaat voor automatische of handmatige toepassing van geneesmiddelen of voor het veranderen van de extracellulaire oplossing.
- Zet de schaal onder de neus stuk van de rechtopstaande twee-foton microscoop en installeer en plaats een 25 × (NA 1,05 en werkafstand 2 mm) water-immersie objectief boven het monster. Opmerking: Als deze specifieke lens niet verkrijgbaar objectieve vervaardigd voor twee foton beeldvorming omdat het signaalresolutie drastisch vergeleken met een gewone doel kan verhogen.
- Activeer de twee foton laser met de software (de laser begint te pompen en branden). Stem de laser excitatie tot 820 nm.
- Met behulp van epifluorescentie, zoek de aorta en de focus van de doelstelling ophet endotheel oppervlak met grove afstelling.
- Schakel de microscoop in twee foton laser scanning modus, zodat de excitatie laser geblokkeerde modus, de niet descanned detectors zijn ingeschakeld en de emissiefilters geschikt is voor de verwachte emissiespectra geïnstalleerd. Opmerking: Hier, de FV10-MRL / R (495-540 nM) gebruikt.
- Start levende scannen met ongeveer 5% laservermogen en fijn richten van de doelstelling om de endotheelcellen zichtbaar.
Opmerking: de endotheelcellen zal een sterke fluorescerende signaal vertonen bij incubatie in normale PSS. Dit zal merkbaar zwakker zijn wanneer de schepen worden geïncubeerd in calcium-vrije buffer. De endotheelcellen aanwezig bovenop de geopende aorta en de gladde spiercellen te zien net onder de endotheelcellen (zie figuur 2) zijn. Doordat bloedvaten niet glad en zelfs, zullen er plaatsen waar zowel gladde spiercellen en endotheelcellen aanwezig zijn. </ Li> - Zodra de cellen zijn in focus, het programma van de microscoop software om opeenvolgende beelden in snelle scan mode (rasterscan, 512 x 512 pixel scherm met een frame collectie frequentie van 1,1 s) te verzamelen. Parallel met Fluo-04:00 fluorescentie, verzamel overgedragen lichtbeelden om veranderingen in vat krimp op te sporen en beter te visualiseren de experimentele condities.
- Na het verzamelen van de baseline signaal beelden, veranderen de Ca 2+ ion-concentratie in de externe oplossing of langzaam farmacologische stimulus agenten passen met behulp van de peristaltische pomp, terwijl beeldvorming. Let op de fluorescerende toename signaal binnen de beladen cellen.
Opmerking: Endotheelcellen reageren op veranderingen in stroom, waardoor het aanbeveling lage laminaire toepassingen en testen voertuig te gebruiken voor het aanbrengen van farmacologische activators Ca2 + of NO signalering. Intracellulaire calcium aan nM concentratie waarden opnieuw te berekenen in schepen geladen met Fluo-4 (dissociatieconstante voor Fluo-4 is 345 nm), kan fluorescentie-intensiteit worden vastgelegd bij aanvang en na toevoeging van ionomycine en MnCl2. 4
4. Beeldverwerking en Berekeningen
- Download en installeer Fiji beeldverwerking pakket.
- Open het beeldbestand in Fiji. Bij het importeren van het bestand, splitsen de kanalen (doorgelaten licht en fluorescerende signaal) wanneer daarom wordt gevraagd. Uitsluitend het fluorescentiesignaal van de gegevensanalyse.
- Binnen de Fiji-programma, klikt u op het tabblad te analyseren en scroll naar beneden om de optie gereedschappen. Onder de optie gereedschappen, vindt het tabblad ROI manager zegt en klik op het; Een nieuw venster verschijnt.
- Na deze, klikt u op de set metingen onder het tabblad te analyseren. Selecteer de specifieke metingen van belang. Voor de calcium voorbijgaande metingen, gebruik maken van de grijze waarde optie gemiddelde.
- Met de ronde trace tool, beginnen aan de regio's van belang (ROI) te traceren en klik op "add" op de ROI manager scherm voor elke ROI. Zodra alle cellen van belang zijn getraceerd, in de ROI manager venster selecteert Multi Measure onder de "meer" tab. Vergeet niet om ofwel sla de metingen direct of kopiëren en plakken van al deze metingen in een spreadsheet.
- Open * .txt bestand of Excel spreadsheet van Fiji en de overdracht van de nummers naar een nieuwe Origin werkblad. Let op: U kunt ook gebruik maken van een programma zoals Sigma Plot of Prism voor verdere analyse.
- Binnen het programma Origin gebruiken Plot → Line + Symbol menu voor een overzicht van alle voorbijgaande reacties te observeren. Schakel het reageert cellen.
- Herberekenen trace nummer om tijdschaal (X-as), gebruik Column → Stel Kolom Waarden en vermenigvuldig de kolom trace nummer om de afbeelding collectie frequentie (in ons geval 1.1s).
- Gebruik Analyse → Statistieken over Rijen voor alle geselecteerde opnames te berekenen Mean (Y-as) en Standard Error trace. Plot laatste grafiek voor de huidige groep cellen Plot → Line + Symbol.
- Het mean calcium transient berekening wordt beschreven als volgt.
- Voor de totale calcium vrijlating binnen de Origin-programma, klik op Grafiek, gebruik dan het menu Analyse → Calculus → integreren. Totaal integraal van oppervlakte onder curve verschijnt in Resultaat Log.
- Voor voorbijgaande kinetiek, klik op Grafiek, gebruik dan het menu: Analyse → Niet-lineaire Curve Fit → Select Data Set (kies een X-as variëren van maximaal tot het einde van voorbijgaande reactie). Start Fitting → Select Function → exponentiële Decay 1 → Gereed.
Opmerking: exponentiële montage verschijnt in Graph raam en Resultaat Log. Verkregen gegevens (waarden) vertegenwoordigen in totaal hoeveelheid calcium vrijgegeven, en kinetiek van de kanalen bemiddelde de voorbijgaande reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de bijdrage van calcium vasculaire fysiologie (vasodilatatie en vasoconstrictie) nauwkeurig te beoordelen, werd een protocol ontwikkeld om calcium kleurstoffen laden in zowel endotheelcellen en gladde spiercellen in geïsoleerde intacte aorta. De algemene experimentele opstelling getoond in figuur 1, toont de basisstrategie voor isolatie en bereiding van het vaartuig voor de beeldvorming. Kort na isolering van de aorta van de rat, moet worden gereinigd van vet en bindweefsel en in langsrichting doorgesneden. De geopende aorta moet dan in een met folie 500 pl buis met het vooraf bereide lading cocktail zoals beschreven in het protocol en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met licht rocking geplaatst. Na de incubatie moet de aorta worden gewassen, vastgepind op een siliconen bedekte plaat met de adventitia dichtst bij de silicone en lumen omhoog, en overgebracht naar een rechtop twee foton microscoop voor beeldvorming.
Once de aorta is geplaatst op de microscoop geplaatst en het vat wordt scherpgesteld, dient de endotheelcellen gemakkelijk vinden hun sterke fluorescente emissie (Figuur 2A) zijn. De endotheelcellen zal ook het eerste object in beeld te komen, omdat het lumen van het vat, die voornamelijk bestaat uit endotheelcellen, moet naar boven wanneer het vaartuig wordt vastgepind worden. Naast endotheelcellen afbeelden, zullen er plaatsen waar gladde spiercellen zichtbaar (Figuur 2B). Dus zowel endotheel en gladde spiercellen kan worden geïdentificeerd binnen hetzelfde veld imaging (figuur 2C). Met de mogelijkheid om zowel het vasculair celtypes binnen het beeldvormende gebied hetzelfde kan leiden tot een beter begrip van hoe deze cellen tezamen, maar onafhankelijk reageren op verschillende agonisten en stimuli.
Om de bruikbaarheid van deze werkwijze tonen metingen van aorta cellen responsiviteit op de toevoeging van eencetylcholine (ACh), een potente vasodilator die specifiek veroorzaakt veranderingen in het endothelium, werd bepaald. Zoals getoond in figuur 3A, kan de endotheelcellen gemakkelijk worden gezien tijdens geincubeerd bij normale PSS. Na de toevoeging van ACh (figuur 3B), de endotheelcel fluorescentie verhoogd wat aangeeft dat intracellulair calciumgehalte ook toeneemt. De kwantificering van de geëmitteerde fluorescentie van het ROI, of endotheliale cellen, wordt getoond in figuur 3C. Na de toevoeging van ACh, het intracellulaire calciumgehalte snel toe en dan langzaam terugkeert naar basislijn. De toename van calcium in de endotheliale cellen in respons op ACh is met eerdere verslagen. 5,6
Net als calcium studies Dit protocol is geschikt voor de detectie van endotheel NO productie. Voor deze experimenten werden endotheelcellen geladen met DAF-FM diacetaat kleurstof zoals opFiguur 4A. Deze benadering onlangs gebruikt om aan te tonen dat NO productieverhoging in een Ca2 + -afhankelijke wijze als reactie op ACh stimulatie. 6 Belangrijk na behandeling met L-NAME, een endotheliale NO synthase remmer Deze reactie werd geblokkeerd (Figuur 4B).
Nog een representatief voorbeeld van deze techniek kan worden toegepast op intracellulair calcium te meten weergegeven in Video 1, waarbij calcium bevattende oplossing werd toegevoegd aan een vat dat werd geïncubeerd in calciumvrije buffer. Wanneer aorta initieel geïncubeerd in calciumvrije buffer (bij het begin van de video), de endotheliale cellen zijn zwak fluorescerend waaruit een lage niveaus van calcium in de cellen. Na de toevoeging van normale PSS, de cellen onmiddellijk hierop reageren door [Ca 2+] i concentratie uitstralen en hoge intensiteit fluorescentie. Dit experiment toont aan dat de cellen levendin reactie op externe stimuli. Dit experiment bevestigt ook de levensvatbaarheid van deze methode met zijn opbrengst van hoge kwaliteit van de gegevens.
Figuur 1. Aorta Isolation and Experimental instellen. 1) Na verlamming van de ratten, een insnijding in de buik en isoleer de aorta van het bindweefsel en de vena cava. 2) Na extractie van de aorta, het reinigen van het schip van vet en bindweefsel en open het schip door te snijden in de lengte. 3) Incubeer het vaartuig in de Fluo-04:00 kleurstof gedurende 1 uur bij KT met een lichte schommelen. 4) Na de incubatie, was de aorta, pin het op een siliconen-gecoate plaat, lumen naar boven, en overbrengen naar het stadium van een rechtopstaande twee-foton microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Imaging gladde spier en endotheelcellen. Na voldoende belasting van de calcium-kleurstof, is het mogelijk om het zowel gladde spiercellen en endotheelcellen. (A) Bovenste, is een voorbeeld van Fluo 4 fluorescentie van endotheelcellen in een geïsoleerde aorta van de rat. Bottom, is een fluorescent afbeelding samengevoegd met doorvallend licht uitzicht (hetzelfde geldt voor B en C). (B), is een voorbeeld van Fluo 4 fluorescentie van gladde spiercellen in een geïsoleerde aorta van de rat. (C) door de niet-uniforme dikte van de aorta, is het ook mogelijk om beeldgebieden waar zowel gladde spier- en endotheelcellen aanwezig zijn. Schaal bars worden getoond. Klik hier om een grotere versie van te bekijkendit cijfer.
Figuur 3. Meting Calcium Transiënten in endotheelcellen in reactie op ACh. (A) De aorta werd eerst bereid en geïncubeerd bij normale PSS buffer basislijnregistratie. (B) Na toevoeging van acetylcholine (ACh), het fluorescentiesignaal uitgestraald door de endotheelcellen (ROI) meer aangeeft toenemende calcium in de cellen. Scale bar wordt getoond. (C) De calcium transiënten van de endotheelcellen in reactie op Ach werden berekend met behulp van Origin software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/> Figure 4. Imaging Nitric Oxide in endotheelcellen. (A) Zodra een aorta met de DAF-FM diacetaat kleurstof en plaatsing ervan op de fase van een twee-foton microscoop kan men het NO niveaus in de endotheelcellen gebruik uitgestraalde fluorescentie. (B) Na incubatie met de endotheliale NO synthase remmer L-NAME, de totale fluorescentie afgenomen binnen de ROI, geeft de verminderde niveaus van NO in de cellen. Scale bar wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1. Voorbeeld van endotheelcellen responsiviteit aan Veranderingen in Calcium Concentratien. Na voorbereiding en incubatie in Fluo-04:00 kleurstof, werd de aorta gewassen met calciumvrije buffer en op de fase van een twee foton microscoop. Wanneer het vat geplaatst in het calciumvrije buffer meeste endotheelcellen zwak fluorescerend. Na toevoeging van de normale PSS, de endotheelcellen hierop reageren door de intracellulaire calciumconcentratie en afgeven van een sterk fluorescerend signaal.
Video 2. Voorbeeld van NO productie in endotheelcellen van isoltated rat aorta. Na voorbereiding en incubatie in DAF-FM diacetaat kleurstof, de aorta werd de fase van een twee foton microscoop geplaatst. Na de toevoeging van Ach op badoplossing de endotheelcellen hierop reageren door intracellulaire NO productie en het afgeven van een sterk fluorescerend signaal. Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentele Overzicht. Om beter inzicht in de bijdrage van calcium en NO om vasculaire fysiologie, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het meten van [Ca 2+] i en NO binnen gladde spier en endotheelcellen van geïsoleerde intacte aorta. Samen Dit protocol omvat de volgende kritische stappen: 1) Mechanische isolatie en bereiding (niet enzymatische afbraak) van het vat. Het is belangrijk dat het weefsel gezond en intact zoveel mogelijk optimale fysiologische opname bekomen houden. 2) Incubeer in het calcium-labeling kleurstof of NO-dye labeling met pluronzuur kritisch, maar voor sommige andere typen schepen, moet een andere pluronzuur en incubatietijd te testen. 3) Een goede fixatie van de aorta naar de siliconen-gecoate schaal met het rooster en pinnen zal een stabiel zicht te bieden tijdens beeldvorming met de twee foton microscoop. Omdat het schip zal vernauwen en verwijden, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het schip is properly bevestigd aan de schotel bewegingsartefacten die zich kunnen voordoen te vermijden. 4) Kwantificering van de resultaten. Let op transiënte amplitude de beste parameter om de fysiologische eigenschappen van de cellen vergelijkt niet altijd mogelijk. De integraal van de voorbijgaande kan een betere verschil vertonen door een gehele [Ca 2+] i of NO release.
Bij de proeven kunnen worden uitgevoerd, kan men zien op de [Ca 2+] i (of NO levels) verandert in reactie op stimuli zoals getoond in figuren 3 en 4 en Video 1 en 2. De combinatie van een ex vivo voorbereiding en het gebruik van twee foton beeldvorming beter signaalresolutie en nauwkeurige metingen van intracellulaire processen in vasculaire weefsels verschaffen. Hier werden deze technieken toegepast in combinatie met de klassieke niet-ratiometrische Ca2 + en NO indicators (Fluo-04:00 en DAF-FM diacetaat, respectievelijk), aanmeten calcium transiënten en NO productie in individuele cellen van een geïsoleerd geheel aorta. Wij geloven dat deze techniek zal helpen onze kennis toekomen de mechanismen betrokken in [Ca2 +] i en NO niveaus in de verschillende vasculaire celtypen.
Wijzigingen en het oplossen van problemen. De basisprincipes van het meten van Ca 2+ signalering in enkele gladde spiercellen met gevoelige ionoforen werd aanvankelijk gepubliceerd in 1985. 7 De meeste van de recente methoden voor beeldvorming van Ca 2+ niveaus in individuele vasculaire cellen een laser-scanning confocale microscoop en geïsoleerde als werknemer of gekweekte preparaten. Voor dynamische weefsels zoals bloedvaten, is het moeilijk om calcium of NO niveaus in vivo met behulp van microscopie meten. 2 de belangrijkste beperking is dat vrijwel alle bloedvaten aan de arteriële zijde van de bloedsomloop een interne elastische lamina die ligt tussen de endothelium en de binnenste laag van gladde spiercellen. 8 Bovendien is het merendeel van het extracellulaire materiaal tussen de gladde spieren en adventitia laag collageen. 8 elastine en collageen een belangrijke bron van auto-fluorescentie met hoge intensiteit en een breed scala aan golflengten . De sterke achtergrond fluorescentie in combinatie met een verhoogde lichtverstrooiing tijdens confocale beeldvorming produceert lage resolutie signaal en daarom verminderde detectie van calcium signalering of NO productie. De beperkende factor van lading fluorescente probes in vasculaire cellen in voldoende hoge concentraties om betekenisvolle metingen kan worden opgelost door een ex vivo voorbereiding, twee foton microscoop en toepassing van een nieuwe klasse van ionoforen zoals Asante Red, die fluorescentie emitteert bij lange golflengten, waar er minder interferentie van de auto-fluorescentie van het bindweefsel en vezels. Echter, een van de belangrijkste beperkingen van deze methode is dat het difmoeilijk uit twee of meer kleurstoffen onderling verwisselen beeldvorming. De excitatie spectrum voor de meeste beschikbare kleurstoffen twee foton beeldvorming brede polymodale distributiekenmerken, waardoor het moeilijk te meten twee ionoforen tegelijk maken. Echter, kan low noise hybride detectoren worden gebruikt om de gedetecteerde emissie spectra ervan uitgaande dat de ionoforen emitteren licht bij verschillende golflengten verkleinen. Bijvoorbeeld, in deze procedure niet mogelijk om zowel NO productie Ca2 + -concentratie verandert meten, omdat de emissie spectra overlappen.
Vasculaire endotheliale cellen die in direct contact met de bloedstroom worden blootgesteld aan vocht afschuifspanning en reguleren vasculaire homeostase. 9 De huidige werkwijze kan ook worden toegepast op stroming geïnduceerde calcium transiënten en NO productie in endotheliale cellen ex vivo controleren. Bovendien kan deze werkwijze met succes worden toegepast voor het bestuderen van Ca2 + concentratiestie veranderingen in gladde spiercellen van kleine slagaders weerstand gewonnen uit de nier. In dit geval moet de weerstand ontleed kleine slagaders worden geïncubeerd in Ca2 + -vrije oplossing tegen gladde spiercellen schade door Ca2 + overbelasting. Deze wijziging kan ook worden toegepast op de aorta om celdood te verminderen.
Perspectieven. Op fluorescentie gebaseerde beeldvorming wordt algemeen gebruikt om cellulaire fysiologie in vitro onderzoeken; echter, geïsoleerde celmodellen niet altijd herhalen fysiologische processen die optreden wanneer de cellen in hun eigen omgeving. Dit heeft de toepassing van cellijnen beperkt tot translationeel onderzoek. 10 Zoals hierin beschreven is de toepassing van ex vivo preparaten heeft ons de mogelijkheid om cellulaire gedrag in vers geïsoleerde weefsels bewaken gelet op alle lokale fysiologische processen en de interactie met andere celtypen nog steeds sprake . Met het groeiende aantal genetische EnginEering technologieën die beschikbaar zijn en de ontwikkeling van modellen die menselijke ziekten recapituleren, ex vivo voorbereiding zal een nuttig hulpmiddel voor translationeel onderzoek. Voor de hier beschreven studies werd de Dahl zout-Sensitive (SS / JrHsdMcwi) stam hypertensieve rat gebruikt. De SS rat is een natuurlijk inteelt genesemodel zoutgevoelige hypertensie dat vele aspecten van progressieve menselijke hypertensie recapituleert. Dit model wordt veel gebruikt en is de belangrijkste inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan zout-gevoeligheid en vasculaire disfunctie. 11-13 Met dit model rat, hebben de onderzoekers in staat om de bijdrage van de belangrijkste mechanismen om complexe ziekten (zoals hoge bloeddruk) te testen geweest met ZFNs Talens, en CRISPR / Cas-genexpressie-editing technieken. 6,14-17 volgens de hieronder beschreven samen met deze gen-editing middelen experimentele procedure, is het nu mogelijk om te beginnen met het testen van de bijdrage van calcium en andere belangrijke factoren salt -gevoeligehypertensie en vasculaire dysfunctie bij verschillende diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. William Cashdollar en de Northwestern Mutual Foundation Imaging Center op het Bloed Research Institute of Wisconsin voor hulp met de imaging studies. We danken ook Dr. Daria Ilatovskaya voor kritische lezing van dit manuscript en behulpzaam discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies HL108880 (AS) en DP2-OD008396 (AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
