Abstract
O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca 2+] i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 +] i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.
Introduction
O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produção de NO na vasculatura.
Dois microscopia de fotões foi recentemente aplicada em tecidos, órgãos e estudos em animais inteiros, mesmo devido à sua superior capacidade para penetrar profundamente tecidos com baixa fluorescência de fundo e a sensibilidade do sinal de alta 1,2. O espectro estreito de dois fotões de excitação no Illuminatião ponto focal e a utilização de detectores não-descanned são as razões pelas quais microscopia dois fotões é superior a microscopia confocal tradicional. A microscopia confocal não pode produzir imagens de alta qualidade a uma profundidade de tecido necessária devido à auto-fluorescência e dispersão de luz fora de foco no pinhole confocal. Por conseguinte, temos desenvolvido um método usando um microscópio de dois fotões para medir a [Ca2 +] i de sinalização e a produção de NO em células dos vasos sanguíneos individuais intactas com alta resolução e baixa relação de sinal-para-ruído.
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Protocol
Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Faculdade de Medicina de Wisconsin e estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Isolamento da aorta de rato
- Anestesiar ratos com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) ou outro método aprovado IACUC.
- Coloque o rato em uma posição supina. A fim de expor os órgãos abdominais, fazer uma pequena incisão na linha média ventral, através da pele e do tecido abdominal subcutâneo. Usando compressas de gaze desviar ligeiramente os intestinos para expor a aorta e veia cava como se mostra na Figura 1.
- Resumidamente, sem corte dissecar a aorta a partir do tecido conjuntivo e da veia cava. Usando fio de sutura, amarrar a aorta tão próximo quanto possível para o rim. Dissecar cerca de 1 - 2 cm de aorta e colocá-lo em um cônico de 15 ml tuser fisiológico normal contendo solução salina (PSS; em mM: 140 de NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 de KCl, 6 de glucose, 10 de HEPES) em gelo.
- Uma vez que a aorta é isolado, sacrificar o animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os não-sobrevivência procedimentos sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal. 3
- Usando um microscópio de dissecação, uma pinça de ponta fina, e microtesoura dissecar a gordura e tecido conjuntivo fora da aorta. Uma vez que a aorta é limpo, cortado longitudinalmente da aorta e colocá-lo em PSS em gelo durante mais tarde.
2. Dye carregar e Incubação
- Pipetar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante, que é fornecido em solução à base de DMSO, em 500 ul tubos individuais que foram cobertos com folha de alumínio. Armazenar no congelador a -20 ° C para preservar as propriedades de corante ao longo do tempo. Nota: estes aliquotados assimluções deve ser estável durante pelo menos seis meses.
- Antes do uso, permitir que as soluções de tintura-se aquecer até à temperatura ambiente antes da abertura. Preparar as soluções de trabalho imediatamente antes da utilização. Não guarde o reagente diluído para uso posterior.
- Adicionar 7 ul de 1 mM de Fluo-04:00 corante pronta dissolvido em solução de DMSO a 450 ul de PSS contendo nenhum cálcio. Adicionar 40 ul de solução de DMSO não com base 10% de ácido Pluronic ao cocktail de carregamento para ajudar a dispersar os grupos acetoximetilo (AM) e ésteres de melhorar o carregamento do corante de cálcio.
- Coloque as aortas dissecados para os tubos 500 ul contendo o cocktail de carregamento (como descrito em 2.3), durante 1 h. Cobrir todos os tubos com papel alumínio e coloque em um agitador rotativo a RT.
- Para monitorizar a produção de NO na vasculatura, usar corante diacetato DAF-FM. Incubar a aorta em uma solução contendo 450 uL PSS, 40 ul de ácido plurónico e 5 ul de 10 mM de FAD FM-diacetato. Semelhante ao protocolo de incubação de cálcio (descrito em 2.3), colocar a aortanum tubo de 500 ul contendo a solução sem corante coberta na folha e lugar num agitador rotativo durante 30 minutos a 4 C seguindo-se próximo de 30 min à TA.
- Quando a produção de NO é medido, utilizar a NO-sintase endotelial bloqueador, L-NAME, para bloquear a produção de NO como um controlo, como mostrado na Figura 4B. Para esse procedimento, adicione a cocktail (como descrito em 2.5) 100 nM L-NAME para os últimos 30 minutos de incubação (em RT).
3. Laser Scanning Dois Protocolo photon Microscopia
- Após a 1 h de incubação, lava-se a aorta de 2 - 3 vezes em PSS limpo para remover o corante extracelular.
- Transferir a aorta para uma placa revestida com silicone contendo ou PSS normal ou tampão livre de Ca 2+ (depende do protocolo experimental). Pin da aorta para baixo para o revestimento de silicone com a adventícia em contacto com o silicone (ou seja, lúmen endoteliais expostas à abertura prato) utilizando pinos em forma de μ. Como alternativa, use uma fatia Anchorgrade ou cola para fixar o tecido.
Nota: Para reduzir o estresse e possíveis artefatos mecânicos, transferência e corrigir aorta em Ca 2 + livre solução e esperar 5 - 10 min antes do início do experimento. - Conectar uma bomba peristáltica ou uma seringa para a placa revestida com silicone para aplicação automática ou manual de drogas ou para modificar a solução extracelular.
- Coloque o prato sob a parte do nariz dos retos microscópio de dois fótons, e instalar e posicione a 25 × (NA 1,05 e trabalhando distância 2 mm) de imersão em água lente objetiva acima do espécime. Nota: Se esta lente específica não está disponível, use um objectivo fabricados especificamente para dois fótons de imagem, porque pode aumentar a resolução do sinal dramaticamente em comparação com um objectivo regular.
- Ative o laser de dois fótons usando o software (o laser começa a bomba e ligue). Sintonizar o laser de excitação a 820 nm.
- Usando epifluorescência, localize a aorta e focar o objetivo ema superfície endotelial usando ajuste primário.
- Alterne o microscópio de varredura a laser em modo de dois fótons, garantindo que o laser de excitação é modo bloqueado, os detectores não descanned estão envolvidos e os filtros de emissão adequadas para os espectros de emissão esperada estão instalados. Nota: Aqui, foram utilizados o FV10-MRL / R (495-540 nM).
- Iniciar a digitalização vivo utilizando aproximadamente 5% da potência do laser e finamente concentrar o objectivo, a fim de visualizar as células endoteliais.
Nota: As células endoteliais exibirão um sinal fluorescente forte quando incubadas em PSS normal. Este será visivelmente mais fraco quando os vasos são incubadas em tampão isento de cálcio. As células endoteliais estará presente na parte superior da aorta aberta e as células do músculo liso pode ser visto abaixo das células endoteliais (ver Figura 2). Porque os vasos sanguíneos não são nem lisa nem mesmo, haverá locais onde ambas as células de músculo liso e células endoteliais estão presentes. </ Li> - Uma vez que as células estão em foco, o programa de software microscópio para coletar imagens sequenciais no modo de varredura rápida (varredura raster, 512 x 512 pixels de janela com uma frequência coleção de quadros de 1,1 s). Em paralelo com Fluo-04:00 fluorescência, recolher transmitido imagens de luz, a fim de detectar alterações na contração dos vasos e visualizar melhor as condições experimentais.
- Após a coleta de imagens de sinal de linha de base, altere a concentração de íons de Ca2 + na solução externa ou lentamente aplicar agentes farmacológicos de estímulo usando a bomba peristáltica, enquanto imagem. Observar o aumento de sinal fluorescente dentro das células carregadas.
Nota: As células endoteliais responder às mudanças no fluxo, portanto, recomenda-se usar aplicações de baixa laminares e ensaio do veículo antes da aplicação de activadores farmacológicos de Ca 2+ ou NO sinalização. Para recalcular cálcio intracelular para valores de concentração nm de embarcações carregadas com Fluo-4 (constante de dissociação para Fluo-4 is 345 nM), a intensidade de fluorescência pode ser gravada no início e após adição de ionomicina e MnCl2 4.
4. Processamento de Imagem e Cálculos
- Baixe e instale Fiji pacote de processamento de imagem.
- Abra o arquivo de imagem em Fiji. Após importar o arquivo, dividir os canais (luz transmitida e de sinal fluorescente) quando solicitado. Utilize apenas o sinal fluorescente para a análise de dados.
- Dentro do programa de Fiji, clique na guia analisar e desça até a opção ferramentas. Sob a opção de ferramentas, encontrar a aba que diz o gerente de ROI e clique sobre ele; uma nova janela aparecerá.
- Após isso, clique em medições definido na guia analisar. Selecione as medições específicas de interesse. Para as medidas transitórias de cálcio, use a opção valor médio cinza.
- Com a ferramenta de rastreio circular, começam a traçar as regiões de interesse (ROI) e clique em "adicionar" na tela do gerenciador de ROI para cada ROI. Uma vez que todas as células de interesse foram rastreados, na janela do gerenciador de ROI, selecione multi Medida sob o "mais" guia. Lembre-se de salvar os medições diretamente ou copiar e colar todas essas medidas em uma planilha.
- Abrir arquivo * .txt ou planilha do Excel de Fiji e transferir os números para uma nova planilha de Origem. Nota: Como alternativa, use um programa como o Sigma Plot ou Prism para análise posterior.
- Dentro do programa de Origem, use Plot → menu de Linha + Símbolo de observar uma visão geral de todas as respostas transientes. Desmarque as células não respondem.
- Recalcular o número de rastreamento para escala de tempo (eixo X), use Coluna → Definir valores de coluna e multiplicar a coluna de número de rastreamento para a freqüência de coleta de imagem (no nosso caso 1.1s).
- Use Analysis → Estatísticas sobre linhas para todas as gravações selecionadas para calcular Média (eixo Y) e rastreamento de erro padrão. Traçar a curva final para grupo atual de células Traçar → Linha + Symbol.
- O mean cálcio transiente cálculo é descrito como se segue.
- Para total liberação de cálcio dentro do programa de Origem, clique no gráfico, em seguida, usar o menu Análise → Cálculo → Integrar. Integrante total de área sob a curva aparece no registro de resultado.
- Para cinética transitórios, clique no gráfico, em seguida, use o menu: Curva Análise → não-linear Fit → Selecionar Conjunto de Dados (escolher eixo X variam de máximo até o final da resposta transitória). Comece Fitting → Select → Função Exponencial Decay 1 → Concluído.
Nota: encaixe exponencial aparece na janela Graph e Resultado Log. Os dados obtidos (valores) representam quantidade total de cálcio liberado, e cinética dos canais mediada a resposta transitória.
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Representative Results
A fim de avaliar com precisão a contribuição de cálcio a fisiologia vascular (vasodilatação e vasoconstrição), um protocolo foi concebido para carregar corantes de cálcio em ambas as células endoteliais e células do músculo liso na aorta isolada intacta. A experimental geral definido em cima representada na Figura 1, mostra a estratégia básica para o isolamento e preparação do vaso antes de imagem. Resumidamente, após o isolamento da aorta do rato, ele deve ser limpo de gordura e tecido conjuntivo e cortado longitudinalmente. A aorta aberta deve ser então colocado num tubo de 500 ul coberto de folha contendo o cocktail de carregamento preparada antes, tal como descrito no protocolo e incubaram-se à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação leve. Após a incubação, a aorta deve ser lavada, fixada para baixo para uma placa coberta com silicone com a adventícia mais próxima do lúmen de silicone e para cima, e transferidos para um microscópio de dois fotões vertical para imagiologia.
Once a aorta foi colocado no microscópio e o recipiente está em foco, as células endoteliais deve ser fácil de localizar por sua forte emissão fluorescente (Figura 2A). As células endoteliais também será o primeiro objecto a ser focada, porque a luz do vaso, o qual consiste principalmente de células endoteliais, deve ser voltada para cima quando o recipiente é preso. Além de imagiologia de células endoteliais, haverá locais onde as células do músculo liso são visíveis (Figura 2B). Assim, tanto as células endoteliais e do músculo liso pode ser identificada dentro do mesmo campo de imagem (Figura 2C). Tendo a capacidade de imagem tanto tipos de células vasculares dentro do mesmo campo de imagem pode conduzir a uma melhor compreensão de como estas células em conjunto, no entanto, independentemente, respondem a diferentes agonistas e estímulos.
Para demonstrar a utilidade deste método, as medições de células de aorta capacidade de resposta à adição de umcetylcholine (ACh), um potente vasodilatador que provoca especificamente mudanças no endotélio, foi determinada. Como mostrado na Figura 3A, as células endoteliais podem ser facilmente vistos, enquanto incubadas em PSS normal. Após a adição de ACh (Figura 3B), a fluorescência de células endoteliais aumenta, indicando que o conteúdo intracelular de cálcio está também a aumentar. A quantificação da fluorescência emitida a partir das ROI, ou as células endoteliais, é mostrado na Figura 3C. Após a adição da ACh, o teor de cálcio intracelular aumenta rapidamente e, em seguida, lentamente retorna à linha de base. O aumento do cálcio no interior das células endoteliais em resposta a ACh é consistente com relatos prévios 5,6.
Semelhante a estudos de cálcio, este protocolo é adequado para a detecção da produção de NO endotelial. Para estas experiências, as células endoteliais da aorta foram carregadas com corante diacetato DAF-FM como mostrado naFigura 4A. Esta abordagem foi recentemente utilizada para demonstrar que o NO aumenta a produção de uma forma dependente de Ca 2+ em resposta à estimulação de ACh. 6 Importante, após o tratamento com L-NAME, um inibidor da sintase de NO endotelial, esta resposta foi bloqueado (Figura 4B).
Um outro exemplo representativo de como esta técnica pode ser aplicado para medir o cálcio intracelular é mostrado na Vídeo 1, onde a solução contendo cálcio foi adicionada a um recipiente que foi incubado em tampão isento de cálcio. Quando aorta são inicialmente incubadas em tampão isento de cálcio (no início do vídeo), as células endoteliais são fracamente fluorescente que indica baixos níveis de cálcio nas células. No entanto, após a adição de PSS normal, as células respondem imediatamente, aumentando a [Ca2 +] i e concentração emissores de alta intensidade de fluorescência. Esta experiência mostra que as células estão vivas eresponsivo a estímulos externos. Esta experiência também valida a viabilidade deste método com o seu rendimento de dados de alta qualidade.
Figura 1. Aorta Isolamento e Experimental Set Up. 1) Depois de anestesiar os ratos, fazer uma incisão no abdômen e isolar a aorta do tecido conjuntivo e da veia cava. 2) Após a extracção da aorta, limpar o vaso de tecido conjuntivo e gordura e abrir o recipiente, cortando longitudinalmente. 3) Incubar o vaso em que o corante Fluo-4 AM durante 1 hora à temperatura ambiente com ligeira agitação. 4) Após a incubação, lavar a aorta, fixá-lo em uma chapa revestida de silicone, lúmen virada para cima, e transferi-lo para o palco de um microscópio vertical de dois fótons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem do músculo liso e endoteliais. Após o carregamento suficiente da tintura-cálcio, é possível imagem ambas as células de músculo liso e células endoteliais. (A) superior, é um exemplo de Fluo 4 fluorescência das células endoteliais numa aorta de rato isolada. Bottom, é uma imagem fluorescente fundiu com vista luz transmitida (semelhante para B e C). (B), é um exemplo de Fluo 4 fluorescência de células musculares lisas num aorta de rato isolada. (C), devido à espessura não uniforme da aorta, é também possível às regiões da imagem em que tanto do músculo liso e células endoteliais estão presentes. Escala de barras são mostradas. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada daeste valor.
Figura 3. Medição transientes de cálcio nas células endoteliais em resposta a ACh. (A) A aorta foi inicialmente preparadas e incubadas em tampão de PSS normal para gravações de linha de base. (B) A seguir à adição de acetilcolina (ACh), o sinal fluorescente emitida pelas células endoteliais (ROI) melhoradas indicando aumento dos níveis de cálcio no interior das células. Barra de escala é mostrado. (C) Os transientes de cálcio das células endoteliais em resposta a Ach foram calculados usando o software Origin. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagem óxido nítrico nas células endoteliais. (A) Depois de carregar a aorta com o corante diacetato DAF-FM e colocá-lo no palco de um microscópio de dois fotões, é possível para a imagem NÃO níveis dentro das células endoteliais usando fluorescência emitida. (B) A seguir à incubação com o inibidor da sintase de NO endotelial, L-NAME, a fluorescência total diminuiu dentro das ROI, indicando níveis reduzidos de NO nas células. Scale bar é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1. Exemplo de resposta das células endoteliais para alterações de cálcio Concentraçãn. Após a preparação e a incubação no Fluo-4 AM corante, a aorta foi lavada com tampão sem cálcio e colocado na platina de um microscópio de dois fotões. Quando o recipiente é colocado no tampão isento de cálcio, a maioria das células endoteliais são fracamente fluorescente. A seguir à adição de PSS normal, as células endoteliais responder por aumento da concentração de cálcio intracelular e que emite um sinal fluorescente forte.
2. Exemplo de vídeo de produção de NO em células endoteliais de aorta de rato. Isoltated Seguindo a preparação e a incubação no corante diacetato DAF-FM, a aorta foi colocado na plataforma de um microscópio de dois fotões. A seguir à adição de Ach em solução para banho, as células endoteliais reagir aumentando N intracelularO produção e que emite um sinal fluorescente forte. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
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Discussion
Visão geral Experimental. Para melhor compreender a contribuição de cálcio e NÃO a fisiologia vascular, um novo método foi desenvolvido para medir [Ca2 +] i e NÃO dentro do músculo liso e células endoteliais de aortas intactas isoladas. Juntos, este protocolo é composto por estes passos críticos: 1) o isolamento mecânico e preparação (digestão enzimática não) da embarcação. É importante manter o tecido saudável e intacta, tanto quanto possível obter gravações fisiológicas óptimas. 2) A incubação no corante de rotulagem de cálcio ou NO-marcação com corante com ácido plurónico é crítica, no entanto, para alguns outros tipos de vasos, e um tempo de incubação de ácido plurónico diferentes podem necessitar de ser testado. 3) de fixação adequada da aorta ao prato revestido de silicone com a grade e os pinos vai proporcionar uma visão estável durante o exame com o microscópio de dois fotões. Porque o navio vai contraem e dilatam, é importante ter certeza de que o navio está properly fixado ao prato para evitar artefatos de movimento que possam surgir. 4) A quantificação dos resultados. Por favor, note que a amplitude transitória pode não ser sempre o melhor parâmetro para comparar as características fisiológicas das células. O integrante do transitória pode mostrar uma melhor diferença devida ao total de [Ca2 +] i ou liberação de NO.
Quando as experiências são realizadas correctamente, é possível monitorar a [Ca2 +] i (ou dos níveis de NO) muda em resposta a estímulos, como mostrado nas Figuras 3 e 4 e de Vídeo 1 & 2. A combinação de uma preparação ex vivo e o uso de dois fótons de imagem pode proporcionar uma melhor resolução do sinal e medições precisas de processos intracelulares nos tecidos vasculares. Aqui, estas tecnologias foram aplicados em combinação com a clássica Ca não-raciométrica 2+ e NO indicadores (Fluo-4 AM e FM DAF-diacetato, respectivamente), amedir transientes de cálcio e produção de NO em células individuais de um todo isolado aorta. Nós acreditamos que esta técnica vai ajudar a transmitir nosso conhecimento sobre os mecanismos de regulação [Ca2 +] i e os níveis de NO no âmbito dos diferentes tipos de células vasculares.
Modificações e solução de problemas. Os princípios básicos de medição de Ca 2+ de sinalização nas células musculares lisas de solteiro com ionóforos sensíveis foi inicialmente publicada em 1985. 7 A maioria dos recentes métodos de imagem Ca 2 + níveis em células vasculares individuais têm empregado um microscópio confocal de varredura a laser e isolados ou preparações cultivadas. Para tecidos dinâmicos como vasos sanguíneos, é difícil medir cálcio ou os níveis de NO in vivo utilizando técnicas baseadas em microscopia. 2 A principal limitação aqui é que quase todos os vasos sanguíneos no lado arterial da circulação têm uma lâmina elástica interna, que se situa entre o endothélio e a camada mais interna das células do músculo liso. 8 Além disso, a maioria do material extracelular entre o músculo liso e a camada adventícia é o colagénio. 8 elastina e colagénio são uma importante fonte de auto-fluorescência com intensidade elevada e uma ampla gama de comprimentos de onda de excitação . A forte fluorescência de fundo juntamente com o aumento da dispersão da luz durante a imagem confocal produz resolução baixa de sinal e, portanto, reduzida a detecção de sinalização de cálcio ou nenhuma produção. O factor limitante de sondas fluorescentes carga das células vasculares em concentrações suficientes para fazer medições significativas pode ser resolvido usando uma preparação ex vivo, um microscópio de dois fotões, e a aplicação de uma nova classe de ionóforos, tais como Asante vermelho, que emite fluorescência a longo comprimentos de onda, onde há menos interferência do auto-fluorescência do tecido conjuntivo e fibras. No entanto, uma das principais limitações deste método é que é difcil para combinar dois ou mais corantes durante o exame. Os espectros de excitação para a maioria dos corantes disponíveis para dois fótons de imagem, tem características de distribuição polimodais de largura, o que torna difícil para medir dois ionóforos diferentes simultaneamente. No entanto, os detectores de híbridos de baixo ruído poderia ser usado para limitar os espectros de emissão detectados assumindo que os ionóforos emitem luz a diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, neste procedimento descrito não é possível medir tanto a produção de NO e de Ca2 + mudanças de concentração porque os espectros de emissão sobrepostos.
As células endoteliais vasculares que estão em contacto directo com o fluxo de sangue exposto a tensão de cisalhamento de fluidos e regulam a homeostase vascular. 9 O método actual pode também ser aplicado para monitorizar transientes de cálcio induzida pelo fluxo e a produção de NO em células endoteliais ex vivo. Além disso, este método pode ser aplicado com êxito para estudar Ca 2+ Concentraalterações ção em células do músculo liso de artérias pequenas resistência extraídos a partir do rim. Neste caso, as artérias pequenas dissecados de resistência devem ser incubadas em solução livre de Ca2 + para evitar danos nas células do músculo liso devido a sobrecarga de Ca2 +. Esta modificação pode também ser aplicado para a aorta para reduzir a morte celular.
Perspectivas. Imagiologia à base de fluorescência tem sido amplamente utilizada para estudar a fisiologia celular in vitro; no entanto, os modelos de células isoladas nem sempre recapitular processos fisiológicos que ocorrem quando as células estão no seu ambiente nativo. Isso tem limitado a aplicabilidade de linhas de células para pesquisa translacional. 10 Tal como descrito aqui, o uso de preparações ex vivo nos deu a oportunidade de monitorar o comportamento celular em recém isolado tecido onde todos os processos fisiológicos locais e interação com outros tipos de células ainda estão ocorrendo . Com o crescente número de engin genéticanharia tecnologias disponíveis eo desenvolvimento de modelos que recapitulam doenças humanas, ex vivo preparações será uma ferramenta útil para pesquisa translacional. Para os estudos aqui descritos, foi utilizado o Dahl sensíveis ao sal (SS / JrHsdMcwi) cepa de ratos hipertensos. O rato é um modelo SS genética pura natural de hipertensão sensível ao sal que recapitula muitos aspectos da hipertensão humana progressiva. Este modelo está sendo amplamente utilizado e forneceu informações importantes sobre os mecanismos subjacentes sal-sensibilidade e disfunção vascular. 11-13 Com este modelo de rato, os pesquisadores foram capazes de testar a contribuição de mecanismos-chave para doenças complexas (como hipertensão) usando ZFNs , TALENS, e CRISPR / tecnologias gene de edição baseados em Cas 6,14-17. Usando o procedimento experimental descrito aqui, juntamente com esses recursos de edição de gene, agora é possível começar a testar a contribuição de cálcio e outros fatores-chave para o sal sensíveis aohipertensão e disfunção vascular em diversos modelos animais diferentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. William Cashdollar, ea Northwestern Mutual Foundation Imaging Center do Instituto de Pesquisa Wisconsin sangue para obter ajuda com os estudos de imagem. Agradecemos também o Dr. Daria Ilatovskaya para a leitura crítica deste manuscrito e discussão útil. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Grants HL108880 (como) e DP2-OD008396 (a AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
